黄林杰 罗达龙 黄琳
（梧州食品药品检验所 广西 梧州 543002）
【摘要】 目的：探讨实时荧光定量PCR对蕲蛇样品真伪鉴别的准确性。方法：采用实时荧光定量PCR法从蕲蛇正品、混伪品中提取DNA,进行引物扩增，并通过Cq值和扩增曲线对样品真伪进行判断。结果：3批蕲蛇正品的Cq值均低于30，曲线有明显的指数增长期；2批混伪品无Cq值，曲线为一直线。结论：本方法鉴别蕲蛇操作简单，准确率高，重现性好，可行有效。
【关键词】 实时荧光定量；PCR；蕲蛇；鉴别
【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）16-0045-02
Application of real-time fluorescent quantitative PCR in the Identification of traditional Chinese medicine AgkistrodonAcutus
HuangLinjie,LuoDalong,Huang Lin. WuzhouInstitute for Food and Drug Control,Guangxi, Wuzhou 543002,China
【Abstract】Objective To investigate the accuracy of real-time fluorescence quantitative PCR in the identification of the samples of Agkistrodonacutus.Methods DNA of the AgkistrodonAcutus and its adulterants were extracted by real-time fluorescence quantitative PCR,and primers were amplified.And through the Cq value and amplification curve to determine the authenticity of the sample. Result The 3 batches of Agkistrodonauthentic,sCq values were lower than 30, and the Curve had obvious growth period.There was no Cq value, and the curve was a straight line for the 2 batches of mixed adulterants.Conclusion This method is simple to identify AgkistrodonAcutus, high accuracy, good reproducibility, feasible and effective.
【Key words】Real-time fluorescence quantitative;PCR;Agkistrodonacutus; Identification
蕲蛇为为蝰科类动物五步蛇的干燥体,具有祛风、通络、止痉的功效[1]。由于其药用价值较高，导致近年来被大量捕捉，药材资源不断减少，大量伪品充斥着市场，质量问题日益严重。传统的蕲蛇药材的鉴别，主要是对其头部、鳞片和骨骼的形态特征进行性状鉴别，这对实验人员的中药材鉴别经验及蕲蛇药材的完整性要求较高。随着分子生物学的发展，使得中药材的分子遗传标记鉴别成为可能。目前，文献上已有聚合酶链式反应（PCR）法应用于药材鉴别的介绍。本文采用实时荧光定量PCR（以下简称qPCR），通过硅胶柱法提取蕲蛇的DNA，利用PCR荧光探针法鉴别真伪，较普通PCR法（电泳法）具有操作简单、时间短、准确率高，不易造成污染的特点，具有较好的应用前景。
1.材料与仪器
1.1 材料
1.1.1蕲蛇正品及伪品 蕲蛇正品1、2来源于安徽亳州中药材市场，蕲蛇正品3及混伪品金钱白花蛇、赤链蛇均来源于广西玉林中药材市场，并经过形态学鉴定。
1.1.2试剂 动物组织基因组DNA提取试剂盒（购自广州迪奥生物科技有限公司，型号：DePure Tissue DNA Kit），SuperReal荧光定量预混试剂增强版（购自TIANGEN，型号：FP205），内含2 x SuperRealPreMix Plus（with SYBR Green I）和RNase-Free ddH2O，蕲蛇引物（购自invitrogen，型号：A12925，序列:5-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3和5-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3）
1.2 仪器
Minispin台式高速离心机（德国Eppendorf公司）、MINIB-100F恒温金属浴（杭州米欧仪器有限公司）、XA205DU电子天平（德国梅特勒托利多公司）、LightCycler96荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）、-20℃冰箱（美的公司）。
2.方法
2.1 引物稀释
按产品引物合成说明书，所需引物浓度为10μM，此引物每OD为一管，每管nmole数为2.9，按照管内nmole数/工作液浓度=所需加入的超纯水(ml)，则需加超纯水0.29ml来稀释。稀释好的引物放-20℃保存备用。
2.2 样品前处理
取试样中段的肌肉组织剪碎，加入研钵中研成粉末，称取30mg至2ml灭菌离心管中。
2.3 模板DNA提取
取前处理好的样品，按动物组织基因组DNA提取试剂使用说明书提取DNA,置-20℃保存备用。
2.4 PCR反应液配制
按照SuperReal荧光定量预混试剂使用说明书配制PCR反应液，每管样品的试剂取用量如下。
试剂体积（μl）
2 x SuperRealPreMix Plus（with SYBRGreen I）10
5-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-30.5
5-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-30.5
RNase-Free ddH2O7
每次PCR实验需要阴性对照、阳性对照各一个，所以此次试验共需制备7管。按照以上顺序依次加入试剂至干净的离心管中，涡旋振荡混匀后，放冰盒上待用。将灭菌的PCR八联管（0.2ml离心管）固定在PCR管盒上，将冰盒上的反应液短暂离心后，轻轻打开盖子，加至PCR管中，每管18μl。
2.5 加模板
往上述PCR管中加入2μl提取好的DNA（反应总体积为20μl），加样顺序为阴性对照、待检样品、阳性对照。轻轻敲打PCR管盒，使反应液与DNA混匀，并经3000转离心数秒，立即进行PCR反应。
2.6 荧光定量PCR测试
仪器参数：检测模式为荧光通道，反应总体积为20μl，SYBR Green I染色，依次选择“预变性”和“二步扩增”，收集荧光；PCR反应参数：95℃预变4min，然后进行45个循环：95℃变性30s，63℃复性45s并采集荧光。
2.7 结果判定
2.7.1阴性对照需无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期；
2.7.2阳性对照需Cq≤30，曲线有明显指数扩增期；
2.7.3无Cq值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，可报告样品阴性；
2.7.4Cq值≤36，曲线有明显指数扩增期，可直接报告样品阳性。
3.结果
蕲蛇阳性品及阴性品的扩增曲线图分别见图1、2。蕲蛇正品1、2、3和阳性对照Cq值分别为17.31、17.44、19.28和19.52，均<30，且扩增曲线有明显指数增长期，故可判定为蕲蛇阳性；而金钱白花蛇、赤链蛇和阴性对照均无Cq值，曲线均为一条直线，故为阴性。经过多次重复测试，样品结果稳定一致，表明该方法对蕲蛇的鉴别准确率较高。
4.讨论
一直以来，蕲蛇的传统鉴别方法为形态学鉴别[2],由于市场上的蕲蛇特别是经过炮制后的产品，多除去了头、鳞、骨[3]，外观形态上已经发生了很大的改变，这对药材的鉴别带来了较大的困难。文献上已经引入了PCR方法来鉴别蕲蛇，对于不能通过性状、显微来鉴别真伪的，只需要有特定的引物和相关试剂，经过模板DNA提取、PCR反应和电泳检测3个步骤即可完成鉴别。但是，相比较qPCR而言，普通PCR法使用的仪器较多，需要PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪或紫外透射仪等，且时间不少于2小时。而qPCR只需要一台仪器，就能完成整个试验流程，实验花费的时间减少一半，操作简单，样品经过前处理，放入仪器1小时后即可进行分析，无须开盖转移样本，避免污染，且能每时每刻记录样本的荧光值变化。本研究对3个蕲蛇正品和2个混伪品的鉴别准确率为100%，且经多次重复测试，重现性好，说明该方法对鉴别蕲蛇的真伪是可行有效的。
【参考文献】
[1]中国药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.2015:372.
[2]沈海英等. PCR方法在蕲蛇鉴别中应用[J].蛇志，2013,25（4）：369,385.
[3]宋文成等.中药材蕲蛇及其常见混伪品的特异性PCR鉴别[J].中国中药杂志，2007,32（12）：1220-1222.
论文作者:黄林杰,罗达龙,黄琳
论文发表刊物:《医药前沿》2016年6月第16期
论文发表时间:2016/6/22
标签：蕲蛇论文; 荧光论文; 引物论文; 伪品论文; 定量论文; 样品论文; 阴性论文; 《医药前沿》2016年6月第16期论文;