[]单胺氧化酶抑制药物的体外筛选及其作用机制探究论文_张万萍1,余永游2通讯作者 曾庆东3,程鹏3,彭杨3

( 1重庆医科大学附属大学城医院；2重庆市铜梁区人民医院；3重庆医科大学药学院；重庆400000)

[摘要] 目的：从本实验室设计并合成的一系列化合物中筛选出对单胺氧化酶抑制活性高的化合物，并进一步探究其作用机制。方法：运用本实验室成功构建的单胺氧化酶抑制药物的筛选模型进行此次筛选，用苄胺作为MAO-B的反应底物，5-羟色胺作为MAO-A的反应底物，采用紫外分光光度法分别测定其活性。结果：大多数异喹啉类化合物对MAO有抑制活性，其中化合物b、c、e、j和k对MAO抑制活性较高，尤为突出的是对MAO-A的抑制率均高于90%。雷沙吉兰以及所有筛选出的化合物对MAO的作用机制均为不可逆性抑制。结论：对MAO的抑制活性最为显著的是化合物j，对MAO-B和MAO-A的IC50值分别为92.399 μmol/L和39.773 μmol/L。这为进一步研究设计高效低毒且可逆的MAO抑制药物奠定了一定的基础。

[关键词]单胺氧化酶；抑制活性；单胺氧化酶抑制药物；不可逆

1 引言

单胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）是一种黄素蛋白酶，以二聚体的形式结合在细胞线粒体外膜，分为MAO-A和MAO-B两种亚型。这二者之间有70%左右的序列同源性，结构上有相似的黄素腺嘌呤二核苷酸结合位点，主要倾向于疏水性的脂肪族和芳香族，MAO-A的底物结合部位的疏水性强于MAO-B，其底物在活性中心旋转的自由度也要优于MAO-B。因此，在对抑制药物和底物的选择上，这两种亚型不同的氨基酸残基结合位点起着决定性作用。

迄今为止，MAO抑制药物约有140种之多，但大多数都有严重的不良反应，比如头痛、抑郁、过敏反应和体位性低血压等，最为显著的是“干酪效应”，这些不良反应与非选择性MAO抑制药物的副作用类似。为此，本实验室设计合成了一系列化合物，建立了MAO抑制药物的筛选模型，并运用此模型对所得化合物进行初步筛选研究，以期找出高效低毒、高选择性的MAO抑制药物。

2 材料与试剂

2.1 实验动物

SD雄性老年大鼠，约280 g，由重庆医科大学动物中心提供[证号：SYXK（渝）2016-0002]。

2.2 仪器与试剂

组织捣碎匀浆机（NAI-JJ2），上海那艾精密仪器有限公司；低温高速冷冻离心机（H-1750R），湖南湘仪公司；紫外可见分光光度计（UV-2102PCS），尤尼柯仪器公司；台式离心机（TGL-16G），上海安亭科学仪器厂。

5-羟色胺肌酸酐单水合硫酸盐（>98%，批号：P1064561），东京TCI公司；苄胺、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、高氯酸均为分析纯，购自上海强顺化工有限公司；乙酸丁酯、环己烷也为分析纯，购自重庆川东化工有限公司；实验用水为超纯水。

2.3 待筛异喹啉类化合物的合成及溶液的配制

以下12种待筛异喹啉类化合物均由本实验室药物化学专业的其他成员设计并合成，具体见表1。

精确称取5.0 mg待筛异喹啉类化合物，置于100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.6）中溶解，定容制成1 mmol/L待筛化合物溶液，保存于4℃冰箱中，备用。

3 方法与结果

3.1 MAO的制备

选取280 g左右的SD雄性大鼠，断髓致死，于灭菌后的超净台中迅速取出肝脏，用生理盐水洗涤3次，拭干，保存于-80 ℃，备用。参照文献，制备MAO的具体方法为：称取肝组织5 g于0.3 mol/L蔗糖溶液175 ml中匀浆，将肝匀浆置于高速低温（0℃～4℃）冷冻离心机中以1500 r/min离心10 min，取上清液，以10000 r/min离心30 min，取沉淀混悬于0.3 mol/L蔗糖溶液4 ml中，再加入到1.2 mol/L蔗糖溶液40 ml中，以10500 r/min离心40 min，所得沉淀为MAO。再用100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.6）洗涤1次，加入磷酸钾缓冲液40 ml使沉淀混悬，分装成每支EP管1 ml，储存于-80 ℃，备用。

3.2 MAO抑制药物的体外筛选

根据文献，用苄胺作为MAO-B的反应底物，环己烷提取其产物苯甲醛，在242 nm波长下测定其产物的吸光度A值；同理，5-HT作为MAO-A的反应底物，乙酸丁酯提取产物5-羟基吲哚-3-基乙醛，在280 nm波长下测定其吸光度A值。

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采用本实验室建立的MAO抑制药物的体外筛选模型进行初步筛选，具体方法如下：

用苄胺作为MAO-B的底物，将100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.6）、MAO抑制药物和MAO一起于37℃孵育20 min，之后再加入底物苄胺100 μl，最终使总体积800 μl的MAO和苄胺浓度分别为0.15 mg/ml和2 mmol/L，反应60 min，立即加入200 μl 10%高氯酸灭活，反应终止，加环己烷3 ml，涡旋2 min，提取产物苯甲醛。于10000 g离心5 min，在242 nm波长下测定吸光度A值。

操作同上，用5-HT作为MAO-A的底物，将磷酸钾缓冲液、MAO抑制药物与MAO孵育20 min后，加入底物5-HT 200 μl，最终使总体积800 μl的MAO和5-HT浓度分别为0.40 mg/ml和5 mmol/L，加乙酸丁酯3 ml提取其产物，在280 nm波长下测定其吸光度A值。

空白对照在加入MAO后，立即加入10%高氯酸200 μl灭活，其余操作同上。

通过吸光度A值的大小，判断MAO抑制药物生物活性的强弱。

按以上操作步骤进行实验，最终使雷沙吉兰和待筛化合物在反应体系中浓度均为500 μmol/L，反应总体积为800 μl。大多数化合物对MAO都有一定的抑制活性，其中化合物b、c、e、j和k对MAO抑制活性较高，尤其是对MAO-A的抑制率均高于90%。

3.3 化合物对MAO抑制作用IC50值的测定

按3.2项操作，将以上筛选出的具有抑制活性的化合物进行IC50值实验，选择指数大于1，表明该化合物对MAO-A抑制作用比MAO-B强，其指数越大，选择性越高。同理，选择指数小于1，表明该化合物对MAO-B抑制作用比MAO-A强，其指数越小，选择性越高。其中化合物b、c、e、j和k对MAO-A抑制活性较好，尤其是化合物j效果最为显著，其对MAO-B的IC50值92.399 μmol/L，对MAO-A的IC50值为39.773 μmol/L。

3.4 时间依赖性实验

按3.2项操作，取表2中b、c、e、h、i、j、k和雷沙吉兰这8种化合物，进一步进行时间依赖性实验，考察其对MAO抑制活性的可逆性。化合物的终浓度为IC50值和2 IC50值的浓度，与MAO预孵育时间分别为0、15、30、60 min。

结果显示：所有筛选出的化合物和雷沙吉兰作用机制一致，对MAO均为不可逆性抑制。

4讨论

雷沙吉兰是临床上治疗帕金森氏病的不可逆且选择性好的第二代MAO抑制药物，可提高突触前多巴胺的水平，调节多巴胺能运动功能，因其在体内不会被代谢为安非他命类衍生物，所以无中枢兴奋作用，总体不良反应较低。本实验选择雷沙吉兰作为对照药物，结果发现化合物j对MAO的抑制作用最为显著，对MAO-B和MAO-A的IC50值分别为92.399 μmol/L和39.773 μmol/L，其抑制活性虽较雷沙吉兰弱，但初步具有成药的趋势。从作用机制而言，MAO抑制药物分为可逆性和不可逆性抑制药物，本实验中所有筛选出的化合物与雷沙吉兰一样，均为不可逆性抑制药物。这也进一步验证了本实验室建立的MAO抑制药物筛选模型是可行的，适合于高通量筛选，并且具有操作简便、成本低和结果稳定等特点。

另外，从研究MAO-B抑制药物的构效关系来看，含有氮杂环结构类、香豆素类和黄酮类化合物的抑制活性与选择性最好，而后两类还具有神经保护作用；从研究MAO-A抑制药物的构效关系来看，其中噁唑烷酮类和喹喔啉类化合物具有较好的选择性且呈可逆性的抑制作用，毒副反应更小。本实验所得化合物大多数对MAO有抑制活性，尤其是对MAO-A的抑制活性较高，这与雷沙吉兰对MAO抑制作用的选择性有所不同。在此基础上，我们可以设计合成一系列新型化合物并探索筛选出疗效更优的目标产物。因此，本文为进一步探索高效低毒且具有可逆性的MAO抑制药物奠定了一定的基础。

【参考文献】

[1]余 瑜.单胺氧化酶与抑制药物[J].重庆医科大学学报，2013,38(6):1-9.

[2]张万萍，郭红梅，李文军等.单胺氧化酶抑制药物体外筛选模型的建立[J].重庆医科大学学报，2013,38(6):570-574.

作者介绍：张万萍（1988—），女，汉族，重庆市人，重庆医科大学附属大学城医院，主管药师，硕士，主要从事新药筛选及活性研究。

通讯作者：余永游，男，出生于1987.11，硕士，主管药师，主要从事临床药学工作以及新药合成研究

基金项目：国家科技重大专项课题“重大新药创制”（编号：2010ZX09401-306-1-1）。

论文作者:张万萍1,余永游2通讯作者 曾庆东3,程鹏3,彭杨3

论文发表刊物:《医师在线》2019年8月16期

论文发表时间:2019/11/26

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