刘小伟[1]2003年在《脂多糖诱发肝损伤的分子机理和蛋白质组学研究》文中认为脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌内毒素的主要成分，也是革兰氏阴性细菌激发宿主免疫应答，导致机体损伤的重要因素。人体集聚革兰氏阴性杆菌最丰富的部位是肠道，其所产生的LPS经吸收首先到达肝脏，作为机体主要解毒器官的肝脏，无疑是清除LPS的最活跃场所，但也是免疫损伤的最常见靶位。LPS不但可加重肝硬化、酒精性肝病肝损伤，而且明显增强CCl_4和乙醇等肝毒性物质的肝毒性，单独LPS亦可导致肝损伤。但LPS引起肝损伤过程中涉及的具体信号转导分子及效应分子尚不清楚。 本研究运用常规分子生物学和免疫组织化学方法，动态分析LPS刺激不同时段肝脏LPS／TLR_4途径信号分子及功能分子TNF-α表达与肝脏病理变化的关系，同时比较LPS肝损伤发展不同时相蛋白质组变化，从蛋白质整体水平动态捕捉LPS肝损伤信号转导途径中的特异蛋白质“指纹”，搜查参与到该信号通道的信号、效应分子，探索LPS致肝损伤的发生机理。 首先，Balb／c鼠腹腔注射LPS建立急性内毒素血症动物模型，分别在3小时、6小时、12小时、24小时、30小时处死动物取肝脏组织，HE染色观察病理改变，免疫组织化学方法检测肝细胞凋亡禾月组织TNF－a的表达，逆转录PCR（RT－PCR）法检狈肝组织信号分子 1”LR。（Tolllike Receptor 4，TLR．）、MyD88（MyeloidDifferential Factor 88，MvD88）mRNA 7k平的表达。结果表明，腹腔注射 LPS后 0、 小时小鼠一般情况无明显改变，肝组织学变化不明显，24小时小鼠肝脏出现明显炎性浸润、坏死；而3～6 ’J’时肝细胞凋亡和肝组织 TNF－口的表达达到高峰，12小时即明显减少，24小时凋亡、坏死并存，以坏死为主；肝组织 TLR4mRNA的表达在注射LPS后3小时开始下调，6、12小时明显抑制，24小时则基本恢复：肝组织W088mRNA的表达在不同时间点变化不明显。 然后，本研究为探讨LPS诱发肝损伤相关蛋白质群的变化规律，动态分析了LPS刺激不同时段肝脏的蛋白质谱型。在上述动物实验基础上，匀浆抽提肝脏总蛋白进行双向凝胶电泳，从蛋白质表达丰度角度，寻找差异表达蛋白质；对差异表达蛋白质斑点胰酶酶解后用MALDITOF攸S作肽指纹图，结合蛋白质数据库搜索进行蛋白质鉴定，并分析各差异蛋白质在内毒素肝损伤中的作用。结果发现腹腔注射LPS后6 ’J’时（早期人 蛋白质谱显示TNF－a相关蛋白TNFAIPI（TNF－a inducible endothelial protein，TNFAIPI）表达明显上调，TRA IL受体2蛋白表达下调，线粒体相关蛋白MetaxinZ、TIMMSA（Mitochondrlal import Inner membranetranslocase subunit TIMS A，TIMMSA）开始表达上调，部分蛋白酶体相关蛋白质如磷脂酶AZ、PA28（proteasome activator 28，PA28）、MDPP（Maggesiumdependent protein phosphatase，MDPP） V等的表达被抑制；24小时（后期，包括30小时3只小鼠死亡）的蛋白质谱显示，TRAIL受体2表达抑制，线粒体相关蛋白MetaxinZ、TIMMSA达到表达高峰，蛋白酶体相关蛋白磷脂酶AZ、PA28、MDPP恢复表达，并开始表达增殖相关蛋白P34d＊激酶。 本研究结果提示，LPS致肝损伤呈时间依从性：早期，TNF－a相关蛋白出现表达高峰，线粒体凋亡途径相关蛋白质开始表达上调，出现以TNF－口为中心的肝细胞凋亡，肝组织TLR．mRNA的表达表现为抑制状态；中后期，线粒体凋亡途径相关蛋白质达到表达高峰，肝组织出现明显病理变化，凋亡和坏死并存，以坏死为主，同时机体开始启动损伤修复程序，肝组织TLR．mRNA的表达开始恢复，与肝脏的病理变化在时间上呈一致性，可能与LPS耐受性产生有关，提示LPS信号传导分子TLR．在介导肝损伤中起重要作用，而MmD88mRNA的表达在LPS刺激不同时限无明显变化，提示其为胞内保守信号分子。
彭金娥[2]2016年在《希望Ⅱ号对烟草烟雾暴露诱导小鼠肺损伤的作用及其机理研究》文中研究说明目的：观察希望Ⅱ号对烟草烟雾暴露诱导小鼠肺损伤的血液生化指标、肺组织病理学的影响,应用蛋白质组学技术研究烟草烟雾暴露小鼠肺蛋白质表达变化,并从蛋白组学角度探讨希望Ⅱ号对于烟草烟雾暴露诱导小鼠肺损伤的可能作用机理。方法：156只雄性昆明小鼠按随机数字表方法,随机分为单纯烟草烟雾暴露、停止烟草烟雾暴露(即戒烟)治疗和持续烟草烟雾暴露治疗叁部分,共计13组,每组12只。单纯烟草烟雾暴露部分分为①对照组：每天置于自然空气环境中,15d取材；②单纯暴露模型组：每天置于烟熏箱中烟草烟雾暴露72min,15d取材。烟草烟雾暴露-治疗部分分为①对照组：每天置于自然空气环境中,16d开始每日灌胃双蒸水5.49ml·kg-1,45结束造模,取材；②戒烟模型组：每天置于烟熏箱中烟草烟雾暴露72min,连续15d,16d开始置于自然空气环境中,余同对照组；③戒烟治疗原花青素组：16d开始每日灌胃原花青素52mg·kg-1,余同戒烟模型组；④戒烟治疗希望Ⅱ号低、中、高剂量(XwIIL.XwIIM、 XwIIH)组：16d开始每日灌胃1.83ml·kg-1、5.49ml·kg-1、16.47ml·kg-1希望Ⅱ号,余同戒烟模型组。⑤持续暴露模型组：每天置于烟熏箱中烟草烟雾暴露72min,连续45d,余同对照组；⑥持续暴露治疗原花青素组：16d开始每日灌胃原花青素52mg·kg-1,余同持续暴露模型组；⑦持续暴露治疗希望Ⅱ号低、中、高剂量组：16d开始每日灌胃1.83ml·kg-1、5.49ml·kg-1、16.47ml·kg-1希望Ⅱ号,余同持续暴露模型组。取小鼠血清用于测定谷草转氨酶(AST),谷丙转氨酶(ALT),过氧化氢酶(CAT),乳酸脱氢酶(LDH),琥珀酸脱氢酶(SDH),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX),髓过氧化物酶(MPO),丙二醛(MDA),总超氧化物歧化酶(T-SOD),铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)活性。取肝脏右叶上部、肺脏右上叶、肾匀浆检测T-SOD、Cu/Zn-SOD、MDA水平。取皮肤、肺脏右下叶匀浆检测羟脯氨酸(Hyp)含量。取心脏上部匀浆检测MPO含量。取肝脏左叶、肺脏左上叶,心脏中部,两肩胛至两髂骨之间的背部皮肤、左肾用10%中性缓冲福尔马林固定48小时,然后进行HE常规染色、Masson特殊染色,弹性纤维染色,形态计量肝细胞体积构成比,肺泡体积差,肺泡腔面积与总面积比,平均肺泡数,肺、心、肝、肾胶原纤维体积比,表皮厚度,弹性纤维,转化生长因子-β1的表达,比较组间变化。提取小鼠肺脏蛋白,应用蛋白质组学技术分离和鉴定模型及治疗组与对照组小鼠之间的表达差异蛋白质。结果：①与对照组相比,各模型组小鼠肝、肺组织Cu/Zn-SOD、T-SOD、血清CAT、 SDH、GSH-PX活性均显着性降低；肝、肺组织MDA、肺羟脯氨酸、血清AST、ALT、 LDH、MPO含量均显着性升高。②与戒烟模型组比较,戒烟治疗希望Ⅱ号低、中、高剂量组小鼠肝组织T-SOD、Cu/Zn-SOD、血清GSH-PX、SDH活性均显着性回升；戒烟治疗希望Ⅱ号中剂量组小鼠血清CAT活性显着性回升；戒烟治疗希望Ⅱ号高剂量组小鼠肝、肺组织MDA含量显着性回降；戒烟治疗希望Ⅱ号低、高剂量组小鼠LDH活性显着性回升,戒烟治疗希望Ⅱ号低、中、高剂量组小鼠血清AST、ALT、MPO含量均显着性回降；戒烟治疗希望Ⅱ号低、中、高剂量组小鼠肺组织Cu/Zn-SOD活性显着性回升,MDA含量显着性回降；戒烟治疗希望Ⅱ号中、高剂量组小鼠肺组织总SOD活性显着性回升,肺羟脯氨酸含量显着性回降。③与持续暴露模型组相比,持续暴露治疗希望Ⅱ号低、中、高剂量组小鼠肝组织T-SOD、Cu/Zn-SOD、血清CAT、GSH-PX、SDH活性均显着性回升；持续暴露治疗希望Ⅱ号低、中、高剂量组小鼠肝、肺组织MDA、血清AST、ALT、MPO含量显着性回降；持续暴露治疗希望Ⅱ号中、高剂量组小鼠肺组织Cu/Zn-SOD、总SOD活性显着性回升；持续暴露治疗希望Ⅱ号低、中剂量组小鼠肺羟脯氨酸、血清LDH含量显着性回降。④希望Ⅱ号上调模型小鼠上调TGF-β1的表达。蛋白质组学结果显示希望Ⅱ号对持续暴露模型组与对照组之间差异蛋白表现调节作用,差异蛋白参与氧化还原功能酶,脂肪酸代谢类,参与脂肪酸,心肌收缩及其他代谢过程。结论：希望Ⅱ号对烟草烟雾暴露诱导肺损伤及相关联的皮肤、心脏、肝脏、肾脏损伤具有保护作用。希望Ⅱ号可能是通过提高机体的抗氧化酶含量,维护氧化与抗氧化平衡,调节肺脏氧化酶活性,调节肺脏蛋白质、脂肪酸代谢,从而保护肺脏及其它脏器功能,对抗烟草烟雾暴露的氧化损伤。
文海花[3]2010年在《清热解毒凉血化瘀法对内毒素肝损伤大鼠蛋白质表达的干预作用》文中认为目的：探讨清热解毒凉血化瘀法对内毒素肝损伤大鼠蛋白质表达的干预作用。方法：(1)SD大鼠40只,随机分为4组：正常组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组。(2)模型组：模型组大鼠每天用蒸馏水2ml灌胃,每天1次,连续7天。于末次灌胃1小时后腹腔注射脂多糖(LPS) (10mg/Kg)。腹腔注射及取血前禁食12小时以上,自由饮水。注射脂多糖6小时后,用1%戊巴比妥钠(30mg/Kg)腹腔注射,麻醉动物后,酒精消毒皮肤,开胸,心脏取血。所有血液放入4℃冰箱保存。用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS技术)检测血清蛋白质谱的差异表达。用全自动生化仪检测肝功酶学指标。用显色基质鲎试剂盒检测内毒素浓度。取肝组织1.5cm×1cm×0.5cm,10%甲醛固定,常规病理切片,HE染色,光镜下观察肝组织病理变化。(3)中药组：成人中药用量为1.58g生药／kg／天,根据体表面积公式,大鼠常规用量为10.20g生药／kg／天。中药高剂量组用中药20.40g／kg灌胃,每天1次,连续7天,余实验方法同模型组；中药低剂量组用中药5.10g／kg灌胃,每天1次,连续7天,余实验方法同模型组。(4)正常组：正常组大鼠每天用蒸馏水2ml灌胃,每天1次,连续7天,于末次灌胃1小时后腹腔注射等量蒸馏水,余实验方法同模型组。结果：(1)各组内毒素水平：与模型组比较,中药高剂量组、中药低剂量组的血液内毒素水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与中药低剂量组比较,中药高剂量组的血液内毒素水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)肝脏生化检查结果：与模型组比较,中药高剂量组、中药低剂量组的血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶水平(AST)降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与中药低剂量组比较,中药高剂量组的ALT、AST,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)蛋白质芯片共捕获到115个差异表达蛋白峰,其中,11个差异表达蛋白峰有统计学意义(P<0.05)。相对分子质量为4200道尔顿的蛋白峰在中药干预组的血清中高表达；相对分子质量为8984道尔顿、9005道尔顿的蛋白峰在中药干预组低表达。(4)光学显微镜下观察：①正常组：肝板纹理清楚,肝细胞排列整齐,索状结构清晰。②模型组：可见炎细胞浸润,核固缩,较多脂肪滴,索状结构不清,肝窦狭窄,肝细胞排列紊乱。③中药高剂量组可见肝板纹理比较清楚,有少量炎细胞。肝细胞排列较整齐。索状结构清晰。④中药低剂量组可见肝板纹理比较清楚,肝细胞肿胀、炎细胞及中央静脉扩张淤血。结论：(1)清热解毒凉血化瘀中药能降低内毒素肝损伤大鼠的内毒素水平。(2)清热解毒凉血化瘀中药能降低内毒素肝损伤大鼠的谷丙转氨酶水平、谷草转氨酶水平。(3)清热解毒凉血化瘀中药能影响内毒素肝损伤大鼠的蛋白质表达,对内毒素肝损伤大鼠的蛋白质表达有一定的干预作用。蛋白峰的变化,可能是清热解毒凉血化瘀中药干预内毒素肝损伤大鼠的重要的分子基础。各组大鼠的血清内确实存在着差异表达蛋白,这可能有助于内毒素肝损伤的进一步研究。
杨红莲[4]2007年在《氯丙嗪致大鼠胆汁淤积效应及其作用机制研究》文中研究说明氯丙嗪(chlorpromazine，CPZ)属于吩噻嗪类抗精神分裂症药物，1952年开始用于临床，成为20世纪医学界重大发现之一，开创了精神病治疗的先河，奠定了现代精神药理学的新时代。CPZ可导致少数用药患者发生黄疸型肝损伤，服用者中黄疸型胆汁淤积的发生率为1～2％，并且与用药剂量和时间无明显的相关性，呈现典型的特异质肝损伤的特征。CPZ所致肝细胞胆汁淤积的临床表现、发病特征，与其它ILT的表现形式一样，同样具有不可预测性、发生率低、无明显的剂量反应关系、难以用实验动物模型复制等特点。因此，CPZ诱发肝细胞胆汁淤积的分子机制至今尚未完全明了。本研究首先建立CPZ致大鼠胆汁淤积模型，评价了CPZ致大鼠胆汁淤积损伤的毒性作用特点，在此基础上，应用RT-PCR技术、蛋白质组学和代谢组学相关技术从大鼠肝脏胆汁转运体基因变化、肝细胞全蛋白表达改变、肝脏萃取物和胆汁代谢表型的角度，深入探讨了CPZ胆汁淤积发生的分子作用机制。CPZ胆汁淤积大鼠模型的建立：实验使用SD大鼠，对CPZ不同剂量(37.5mg／kg、53.0mg／kg和75.0mg／kg)单次给药大鼠和相同剂量(37.5mg／kg)叁次给药大鼠的血液生化指标进行个体样本分析。根据反映大鼠胆汁淤积损伤的敏感指标TBA、TBIL历史参照值和对照值的上限值，确定发生胆汁淤积的大鼠之后，将每组动物按是否发生胆汁淤积分为胆汁淤积型(CS)及非胆汁淤积型(NCS)亚组。测定大鼠胆汁中TBA、TBIL、PLIP、TCHO的浓度和输出量，采用光镜和透射电镜检查大鼠肝脏病变。结果表明37.5mg／kg CPZ组未见CS大鼠，53.0和75.0mg／kg CPZ组CS的发生率分别为16.7％和50％。37.5mg／kg CPZ叁次给药大鼠，D1、D4和D7天剖杀时的CS发生率分别是37.5％、13.3％和33.3％。胆汁流速测定结果表明，与对照组大鼠比较，CS大鼠胆汁流速显着性降低，NCS大鼠流速未发生改变；胆汁中的TBA，TBIL和PLIP浓度在所有NCS大鼠中未发生变化，而CS大鼠中的TBA浓度显着性降低，TBIL浓度显着性升高，PLIP浓度未发生显着性变化。胆汁中TBA，TBIL和TCHO的输出量在NCS大鼠中未发生变化，而在CS大鼠中显着性降低，这些结果表明大鼠胆汁中的TBA也是反映大鼠胆汁淤积的一个敏感指标，大鼠胆固醇和磷脂的代谢受到影响。此外，CPZ单次给药和多次给药大鼠血清中的ALT和AST在CS和NSC大鼠中均显着性升高，但CS大鼠升高幅度更大。大鼠肝脏病理检查发现，37.5mg／kg CPZ组个别大鼠肝脏少数细胞发生轻微的嗜酸性变，53.0和75.0mg／kgCPZ组NCS大鼠肝细胞嗜酸性变，肿胀，偶发灶性坏死，CS大鼠的病理变化主要是肝细胞体积缩小，胞浆嗜酸性染色增强，胞核浓缩深染，部分细胞肿胀，细胞体积增大，胞浆疏松，偶见小血管旁嗜酸性粒细胞浸润。CS大鼠病理改变与文献报道的CPZ直接肝损伤病理特征一致。肝脏电镜结果表明37.5mg／kg CPZ组大鼠细胞核改变不明显，线粒体尚可，嵴可见，说明肝脏只发生轻度损伤。53.0mg／kg、75.0mg／kg CPZ组大鼠透射电镜结果表明CPZ主要损伤了肝细胞中的膜结构、线粒体与内质网，表明CPZ直接肝损伤较严重，75.0mg／kg CPZ组CS大鼠发现毛细胆管微绒毛异常，胆小管空腔异常，大鼠肝脏超微结构改变与CPZ胆汁淤积损伤关系更为密切。CPZ胆汁淤积大鼠胆汁转运体基因的表达：CPZ给药大鼠肝脏胆汁转运系统相关基因Ntcp、Oatp1、Oatp2、Bsep(Spgp)、Mrp1、Mrp2、Mdr2、Mdr1a、Mdr1b表达RT-PCR检测结果表明大鼠胆汁转运系统中的基因Mdr2、Mdr1a和Oatp1在CPZ给药大鼠中的表达发生明显的上调或下调，其它转运体基因表达未发生显着性变化。CPZ给药组NCS大鼠Mdr2表达上调，而CS大鼠表达下调，与对照组相比，都具有显着性差异。Mdr1a表达在CPZ给药组NCS大鼠中未发生变化，而在CS大鼠中表达下调。Oatp1表达在NCS和CS大鼠中均发生下调。磷脂、胆固醇和胆汁酸的分泌只有密切协调才能防止胆汁酸盐诱发对胆管的损伤，而叁者的协调主要由Mdr2调控，Mdr2在CS和NCS大鼠中发生相反的表达改变，提示其在CPZ胆汁淤积发生中起着重要的作用。Mdr1a与CYP450是疏水化合物解毒反应中的一对对立体，Mdr1a是肝脏CYP450的主要调节因子，Mdr1a在NCS和CS中大鼠的表达差异，会导致CYP450对药物代谢的差异。Oatp1在NCS和CS大鼠中表达均下调，从而影响CPZ毒性代谢产物的肝外输出，并导致其在体内蓄积。CPZ胆汁淤积大鼠蛋白质组学研究：实验利用蛋白质组学中的二维凝胶电泳技术对对照组大鼠、37.5mg／kg CPZ组NCS大鼠和75.0mg／kg CPZ组CS大鼠的肝脏蛋白进行分离，分别分离出1277、1303和1257个蛋白点，与对照组相比，共发现19个表达差异的蛋白质点，其中质谱鉴定出9个蛋白质。6个表达减弱的蛋白分别是葡萄糖调节蛋白58、载脂蛋白A-Ⅰ、碳酸酐酶3、过氧化物还原酶Ⅰ、α-酮酸脱氢酶、儿茶酚邻位甲基转移酶，2个表达量增强的蛋白分别是β-微管蛋白和调钙素。另一方面，上述部分蛋白在37.5mg／kg CPZ组NCS大鼠中也发生表达改变，但表达方式不同。X蛋白质点，它在对照组中没有表达，在37.5mg／kg CPZ组NCS大鼠中有表达，但表达量低，在75.0mg／kg CPZ组CS大鼠中高表达。这些结果提示免疫反应和细胞钙稳态紊乱可能参与了CPZ胆汁淤积特异质反应的发生，CPZ胆汁淤积大鼠胆固醇代谢途径受损，氧化应激反应增强，抗氧化应激防御体系受损。CPZ胆汁淤积大鼠代谢组学研究：利用NMR技术检测对照组大鼠、CPZ不同剂量给药大鼠、CS大鼠和NCS大鼠肝组织萃取物和胆汁中内源性代谢产物谱的变化，结果表明对照组大鼠和37.5mg／kg CPZ大鼠与53.0mg／kg CPZ大鼠和75.0mg／kg CPZ大鼠肝脏组织和胆汁的代谢谱不同，75.0mg／kg CPZ组CS大鼠和NCS大鼠的代谢成分也可明显区分开。这些代谢成分的改变提示CPZ肝毒性导致能量代谢中的糖酵解、叁羧酸循环改变，其肝毒性与线粒体、内质网功能降低、氧化磷酸化和脂肪氧化改变、肝脏抗氧化防御体系受损有关，这些结果与前期病理变化结果相一致。75.0mg／kg CPZ组CS和NCS大鼠肝组织萃取物、胆汁中代谢成分的改变发现两者即有相同的代谢成分改变，又有部分不同的代谢成分改变，这些不同的代谢成分可能是CPZ胆汁淤积特异质发生的特征代谢表型。
李磊强[5]2015年在《红芪多糖对小鼠脾淋巴细胞免疫调节作用的实验研究》文中研究指明目的：探讨红芪多糖(HPS)对小鼠脾淋巴细胞的免疫调节作用及蛋白表达图谱的影响。方法：1.制备正常小鼠脾淋巴细胞悬液,用MTT法检测红芪多糖对小鼠脾淋巴细胞的刺激增殖作用,流式细胞术检测CD3+T淋巴细胞以及CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,ELISA试剂盒测定培养上清中的IL-2、IL-4、INF-γ含量。2.制备正常小鼠脾淋巴细胞悬液,分为HPS组和对照组,培养72小时后,采用标准裂解法提取脾淋巴细胞总蛋白,并用丙酮沉淀法对提取的脾淋巴细胞蛋白进行纯化,比较丙酮沉淀法纯化前后的的蛋白样品所得2-DE图谱,验证丙酮沉淀法是否适用于脾淋巴细胞蛋白的制备,同时对第一相等电聚焦电泳条件进行优化,银染显色后比较各凝胶图像。3.采用方法2优化后的双向电泳方法分离脾淋巴细胞蛋白,银染显色,PDQuest8.0软件对凝胶图谱进行差异点分析,找出差异明显的蛋白质点。结果：1.MTT实验结果表明：培养72h后,40、80、100、200μg/ml的红芪多糖均能显着的促进脾淋巴细胞的增殖(P<0.05),且100μg/ml寸作用最强,故选用终浓度为100μg/ml作为干预浓度,用于后续实验；HPS干预后,CD3+总T淋巴细胞百分比增加(P<0.05),且CD3+CD8+T淋巴细胞比例上调(P<0.01)；细胞培养上清检测显示：IL-2含量增加(P<0.01),INF-γ增加(P<0.05),而IL-4含量减少(P<0.05)。2.丙酮沉淀法能够增加蛋白的溶解性,增加蛋白点数目,同时对等电聚焦程序的优化,也使得2-DE图谱的纵向和横向拖尾显着减少,蛋白质点分离良好,2-DE图谱分辨率提高。3PDQuest8.0软件分析HPS组和对照组的2-DE图谱,结果显示：HPS组中共有16个蛋白点发生明显改变,其中11个蛋白质点高表达,4个蛋白质点消失,1个蛋白质点低表达。结论：1.HPS能够调节脾淋巴细胞的免疫功能,增加IL-2分泌,且能诱导Thl细胞分化,以增强细胞免疫应答能力为主。2.标准裂解法结合丙酮沉淀法适用于小鼠脾淋巴细胞蛋白的提取和纯化,利用优化后的双向电泳方法获得了HPS作用小鼠脾淋巴细胞蛋白的2-DE图谱。3.HPS能显着影响正常小鼠脾淋巴细胞蛋白质的表达。
王莹[6]2008年在《利用蛋白质组学技术研究Z24的肝毒性作用机制》文中研究表明病理性血管生成是肿瘤生长和转移的关键步骤之一,因而阻断或抑制新血管生成是抗肿瘤的有效策略。近年来以抗血管生成为靶点已成为肿瘤治疗的研究热点,血管生成抑制剂类新药不断涌现,给肿瘤治疗带来了新的希望。虽然有些血管生成抑制剂已应用于临床,但是大部分化学类药物都由于毒性原因而受到限制。目前毒性已经成为阻碍化学类抗血管生成药物开发与临床应用的瓶颈,深入了解那些被淘汰化合物的毒性及毒性作用机制对于提高研发成功率具有重要意义。Z24是一种合成的化学类血管生成抑制剂,其药理作用靶点为碱性成纤维细胞生长因子和Bcl-2蛋白,体内外实验研究表明,Z24对多种肿瘤的生长具有明显的抑制作用,但临床前安全性研究发现一定剂量下Z24对啮齿类动物具有肝毒性,遵循前人研究血管生成抑制剂的经验,我们认为有必要研究清楚其可能存在的毒性作用和作用机制,这对于能够把Z24成功开发成为新的抗肿瘤药物具有重要的指导作用。因此,本课题对Z24的毒性作用机制进行了研究,首先建立了Z24经口染毒致大鼠肝损伤的动物模型,然后采用蛋白质组学技术对Z24引起的大鼠肝脏和血浆蛋白质表达谱的改变进行了分析,通过对差异表达蛋白进行功能分析,在蛋白质水平上推测Z24的肝毒性作用机制,并进行相应的功能验证研究,主要研究方法及结果如下:Z24经口染毒致大鼠肝损伤模型的建立:雌性Wistar大鼠,连续5d灌胃给予0、50、100、200mg/kg的Z24后,检测血浆肝功系列生化指标及肝脏组织病理学的变化。结果显示,100、200mg/kg组大鼠血浆AST、ALP、TBI、DBI、TG和Tch等水平明显升高,BUN含量明显下降,病理切片光镜下见3个Z24给药组均存在程度不等的肝细胞空泡变性和纤维组织增生,电镜下200mg/kg组可见细胞核皱缩、线粒体呈透明状、线粒体嵴断裂等超微结构改变。结果表明50mg/kg Z24可致大鼠肝脏轻微损伤, 100和200mg/kg剂量下具有明显肝毒性。Z24肝毒性的主要病理学特征是肝细胞脂肪变性和纤维组织增生。Z24染毒大鼠的肝脏差异表达蛋白分析:采用2-DE-MALDI-TOF-TOF-MS的方法对不同剂量Z24染毒大鼠与未染毒大鼠的肝脏全蛋白表达谱进行了比较研究,共鉴定出22种差异表达蛋白,包括二氢硫辛酰胺脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶α链、烯酰辅酶A水解酶、电子传递黄素蛋白脱氢酶、电子传递黄素蛋白α多肽、ATP合酶D链、甘油-3-磷酸脱氢酶1、鸟氨酸转氨酶前体、延胡索酰乙酰乙酸酶、甘氨酸N-甲基转移酶、支链酮酸脱氢酶E1α多肽、醛脱氢酶7A1及1B1、3α-羟化类固醇脱氢酶(3α-HSD)、谷胱甘肽S-转移酶α5(GST-α5)、谷胱甘肽S-转移酶P(GST-P)、硒结合蛋白2和PDZ/LIM结构域蛋白1等。这些蛋白中除了GST-α5、GST-P和PDZ/LIM结构域蛋白1表达上调之外,其余蛋白均表达下调。Z24染毒大鼠的血浆差异表达蛋白分析:采用2-DE-MALDI-TOF-TOF-MS的方法对不同剂量Z24染毒大鼠与未染毒大鼠的血浆蛋白表达谱进行了比较研究,共鉴定出11种差异表达蛋白,包括胎球蛋白B、精氨酸代琥珀酸合成酶、结合珠蛋白、丛生蛋白前体、载脂蛋白E前体、血清白蛋白前体等。其中胎球蛋白B和血清白蛋白前体表达下调,其它的蛋白均表现为表达上调。差异表达蛋白的功能分析及部分蛋白的表达验证:主要在SWISS-PROT数据库中对所鉴定的差异表达蛋白的功能及亚细胞定位进行了查询,利用Gene Ontology对差异蛋白的功能进行了分类,并采用Western blot方法对3α-HSD、GST-P和胎球蛋白B的表达情况进行了验证。发现在肝脏差异蛋白中,大部分(12/22)分布于线粒体;近1/3蛋白参与糖、脂肪和能量代谢途径,如二氢硫辛酰胺脱氢酶、烯酰辅酶A水解酶、电子传递黄素蛋白脱氢酶、ATP合酶D链等。在血浆差异表达蛋白中,胎球蛋白B和精氨酸代琥珀酸合成酶是肝毒性的潜在生物标志物,丛生蛋白与细胞凋亡密切相关。通过差异表达蛋白的功能分析,推测①Z24肝毒性的主要作用机制是通过抑制糖有氧氧化、脂酸β氧化及氧化磷酸化途径使ATP产生减少,能量供应不足导致细胞功能障碍,引起细胞死亡,凋亡很可能是Z24引起肝细胞死亡的主要方式;②线粒体脂酸β氧化作用障碍,导致肝细胞内脂质蓄积,是发生肝细胞脂肪变性的原因;③胎球蛋白B和精氨酸代琥珀酸合成酶可作为Z24肝毒性的潜在标志物。Western blot研究结果显示的3α-HSD、GST-P和胎球蛋白B的表达变化与蛋白质组研究结果相一致。Z24对大鼠肝脏细胞凋亡及线粒体功能的影响:按前述方法复制Z24经口染毒致大鼠肝损伤动物模型,取染毒及对照大鼠的肝组织,制备线粒体,检测线粒体的肿胀程度、跨膜电位(ΔΨm)、活性氧(ROS)、NAD(P)H氧化还原状态、游离钙等指标,并采用TUNEL法对肝细胞凋亡进行了原位检测。结果显示,Z24染毒后大鼠肝线粒体内游离钙含量明显增加、ΔΨm下降、ROS产生增多、还原态NAD(P)H减少、线粒体肿胀程度增加、肝细胞凋亡明显增加。结果表明,Z24染毒后可能由于线粒体内钙超载刺激了线粒体渗透转换孔(PTP)开放,导致渗透性转换(MPT)发生,引起ΔΨm下降、ROS产生增多以及线粒体肿胀,诱导了细胞凋亡的发生。Z24对大鼠肝脏抗氧化体系的影响:按前述方法复制Z24经口染毒致大鼠肝损伤动物模型,采用化学比色法检测肝组织匀浆中的丙二醛(MDA)以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等指标。结果显示,染毒后肝匀浆中GPX活力下降;总-SOD(T-SOD)活力升高,其中主要为CuZn-SOD活力增强,而Mn-SOD活力无明显改变;GST活力明显增高;GSH含量未见下降,反而有所升高,提示肝脏抗氧化能力无明显降低;MDA含量未见明显升高,提示脂质过氧化反应并未明显增强。结果表明,氧化应激损伤反应在Z24肝毒性中不起主导作用。Z24对大鼠肝脏微粒体细胞色素P450(CYP450)酶系的影响:按前述方法复制Z24经口染毒致大鼠肝损伤动物模型,取染毒及对照大鼠的肝组织,差速离心法制备微粒体,检测微粒体内CYP450总含量、细胞色素b5(Cyt-b5)含量、NADPH-CYP450还原酶活性以及CYP1A2、1B1、2E1、3A4等亚型的活性变化。结果显示,Z24染毒后微粒体内CYP450总含量和Cyt-b5含量增高;NADPH-CYP450还原酶活性增强;200mg/kg剂量下CYP1A2和3A亚型的活性增强,但50、100mg/kg剂量下无明显改变;Z24染毒各组CYP2E1和1B1的活性均明显增强。结果提示,Z24染毒可使大鼠肝微粒体CYP450酶系的表达发生改变,Z24对CYP2E1和CYP1B1的诱导效应可能与其肝毒性作用有关。综合分析上述结果,得出以下结论:①Z24对大鼠具有肝脏毒性,血浆生化改变主要为AST、ALP、TBI等水平明显升高;主要病理学改变是肝细胞脂肪变性和纤维组织增生;毒性损伤的主要靶细胞器是线粒体;线粒体内脂酸β氧化障碍,导致肝细胞内脂质蓄积,引起肝细胞脂肪变性。②Z24致大鼠肝毒性的主要作用机制是抑制糖有氧氧化、脂酸β氧化及氧化磷酸化途径,使ATP供应不足,导致细胞功能障碍,引起细胞凋亡;钙离子代谢紊乱引起线粒体PTP的开放可能是Z24诱导肝细胞凋亡的启动途径。③Z24可诱导大鼠肝微粒体CYP450酶系的表达发生改变,对CYP2E1和CYP1B1的诱导效应可能与Z24肝毒性作用有关。④氧化应激反应在Z24致大鼠肝毒性的发生中不占主导作用。⑤血浆中精氨酸代琥珀酸合成酶及胎球蛋白B可作为Z24肝毒性的潜在标志物。
池肇春[7]2019年在《肠道细菌与非酒精性脂肪性肝病研究进展与现状》文中进行了进一步梳理在人类历史的长河中,1.6亿年来人类与定植在胃肠道和身体其他器官内的细菌共生,共同进化,这些细菌数量巨大,达1014以上(人体含有1013真核细胞),包含约500～1 000个种属。其宏基因大小约为自身基因的100倍~([1])。然而直至目前为止仅30%菌种培养成功,70%的细菌尚不能培养。这些庞大的细菌分布全身各组织器官中,其中以胃肠道定植最多。根据其空间分布肠道细菌可分成黏液层细菌和肠腔内细菌,两者在物质交换、信号传递、免疫系统发育和抵抗
参考文献：
[1]. 脂多糖诱发肝损伤的分子机理和蛋白质组学研究[D]. 刘小伟. 中南大学. 2003
[2]. 希望Ⅱ号对烟草烟雾暴露诱导小鼠肺损伤的作用及其机理研究[D]. 彭金娥. 北京中医药大学. 2016
[3]. 清热解毒凉血化瘀法对内毒素肝损伤大鼠蛋白质表达的干预作用[D]. 文海花. 泸州医学院. 2010
[4]. 氯丙嗪致大鼠胆汁淤积效应及其作用机制研究[D]. 杨红莲. 中国人民解放军军事医学科学院. 2007
[5]. 红芪多糖对小鼠脾淋巴细胞免疫调节作用的实验研究[D]. 李磊强. 兰州大学. 2015
[6]. 利用蛋白质组学技术研究Z24的肝毒性作用机制[D]. 王莹. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[7]. 肠道细菌与非酒精性脂肪性肝病研究进展与现状[J]. 池肇春. 中西医结合肝病杂志. 2019
标签：消化系统疾病论文; 肝损伤论文; 肝细胞论文; 线粒体论文; 蛋白质组学论文; 蛋白质论文; 胆汁淤积论文; 蛋白质结构论文; 蛋白质合成论文; 胆汁论文; 健康论文; 养生论文; 内毒素论文; 对照组论文; 多糖论文;