张俊杰[1]1998年在《胎肝中特异表达基因的克隆》文中指出胎肝正处于生长发育阶段，其中表达的一些基因在成人肝脏中则处于关闭状态，克隆这类在胎肝中特异表达的基因将有助于了解肝脏的生长发育过程。 基因克隆的方法很多，利用细胞间基因表达的差异是克隆新基因最有效的手段之一。1992年Liang P．等建立的mRNA差异显示PCR技术在筛选和克隆差异表达基因方面更为敏感和快捷。该技术已在生长发育、细胞分化和生理病理等方面的研究中得到广泛的应用。 本研究利用mRNA差异显示PCR技术，对胎肝和成人肝脏的基因表达差异进行了比较，经二次PCR获得了4个在胎肝中表达的差异基因片段和4个在成人肝脏中表达的差异基因片段。将4个胎肝差异基因片段克隆入测
王跃嗣[2]2005年在《人nthESC向HSC诱导分化和胚胎造血标志物表达研究》文中提出造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是近年来研究较多的一类组织干细胞,目前发现卵黄囊、胎肝、主动脉-性腺-中肾区(AGM)、胎儿血液以及胎盘中均存在具有高度扩增能力的HSC。本论文主要进行了具有课题组专利的人自体基因胚胎干细胞(nthESC)向造血干细胞的诱导分化、人胚胎发育过程中卵黄囊、胎肝和胎盘中的造血发育以及胎盘贴壁细胞的分离培养、向神经细胞诱导分化的研究,为nthESC 和HSC的临床应用提供了理论依据和技术方法。1. 探讨了人胚骨髓间充质干细胞(MSC)的体外分离、扩增、冻存、复苏、转GFP基因和向成骨和神经细胞的诱导分化条件,结果发现MSC有60%可转染GFP基因,表达CD29、CD13、CD59,而CD34、CD45和CD38表达阴性。Vimentin染色阳性,mallory染色显示胶原存在,分离的细胞可在神经诱导体系和成骨诱导体系下进一步向神经细胞和成骨细胞分化。表明MSC在体外能迅速扩增,具有向成骨和神经细胞分化潜能,可以作为稳定饲养层来源。2. 利用人MSC 与人nthESC 共培养,研究人MSC 对胚胎干细胞诱导造血的作用并建立一种有效诱导nthESC 为HSC 的方法。经过20 d 培养,获得大量的CD133+和CD34+绿色荧光标记的HSC。来源于nthESC 的KDR+细胞首先出现在第5 天,CD133 随后出现,CD34+细胞出现在第7 天,随时间延长三者表达增强,第11 天左右表达最强,随后减弱,20 d 仍有表达。培养中发现11 d 可形成小造血集落,14 d 形成大集落。在BMP4、FGF-1和VEGF 等因子作用下,可促进造血细胞形成。结果显示由nthES 与MSC 共培养可产生CD34+细胞,nthESC 的造血分化程序为先形成KDR+细胞,其次是CD133+,再形成CD34+细胞。表明nthESC 可在人胚骨髓MSC 饲养层上有效诱导成HSC。3. 采用分阶段悬浮培养法,首先诱导nthESC 形成拟胚体(EB),在此过程中添加BMP4 和FGF-1。第二阶段,打散EB,再添加VEGF 和其他细胞因子,对HSC 进行扩增。结果发现,采用低黏附板可有效促进EB 形成,BMP4 和FGF-1 可使EB 形成数量明显增加,可使KDR+和CD133+荧光细胞数量明显增多。添加VEGF 等细胞因子,可有效促进CD34+细胞数量增加。结果表明,联合使用BMP4、FGF-1、VEGF 和SCF 等细胞因子,可使悬浮培养形成EB 数量增加,产生更多的造血前体细胞,继而产生大量HSC。
杜权[3]1998年在《红系细胞终末分化的排核机制及分化相关基因的克隆与鉴定》文中指出发育生物学自1894年由德国生物学家Wilhelm Roux及其同事奠基以来，在一个多世纪的发展过程中一直是生命科学领域的研究热点之一，其中细胞分化与去分化更是倍受重视。在生物体的发育过程中，细胞按照一定的方向进行分化，产生具有不同功能的终末细胞，当这一过程受到干扰时，细胞分化受阻，甚至恶变成为肿瘤细胞。肿瘤细胞在一定条件下可以再分化，恶性表型逆转。因此，细胞的分化-去分化-再分化是一个动态的过程，对其机理的研究可为肿瘤的发生机理研究和防治提供重要的依据。哺乳类红系细胞的分化具有明显的特征，当红系细胞进入终末分化时，细胞开始表达红系特异的珠蛋白，同时细胞形态出现明显的改变，即核固缩进而出现排核。当红系细胞癌变时，细胞停滞于较幼稚的阶段，形成红白血病细胞，其珠蛋白基因处于关闭状态，在一定条件下，红白血病细胞可以重新分化，表达珠蛋白，并且这一过程可以人为控制。因此红系细胞是研究细胞分化与癌变的良好模型。 直至目前为止，文献报道的红系特异的作用因子主要集中于红系分化的早期阶段。但当红系细胞进入终末分化阶段时，出现细胞分裂停止、珠蛋白基因表达、核固缩和排核等一系列特征性改变，涉及与终末分化相关基因开启和关闭的调控因子则尚无确切报道，鉴定这些因子，对阐明红系细胞终末分化的机制及红系细胞恶变的机理有重要的理论意义和实用价值。近年来，本室对哺乳类红系细胞的终末分化，尤其是排核
孙燕[4]2003年在《人ZNF268基因在早期胚胎发育中的特性和功能研究》文中认为早期胚胎是细胞生长、发育、分化最旺盛时期，大多数基因都处于活化状态，是发现和分离有重要功能新基因的极好材料。尽管小鼠等模式动物，对于我们认识哺乳类动物早期胚胎发育提供了许多重要信息，但它与人类存在着必然的差异。为此，我们根据实际情况和条件选择人早期胚胎为材料，进行人早期胚胎中表达的新基因的分离和功能研究。 在构建早期人胚胎cDNA文库的基础上，应用杂交筛选和表达标签(EST)分析技术从3-5周龄人胚胎cDNA文库中得到一个克隆子L30，应用5’RACE技术，克隆了其全长cDNA。经过对全长cDNA序列的测定及其结构特征的分析，证实L30为一个新的锌指蛋白基因，国际命名委员会命名其为ZNF268。为了研究ZNF268的生物学功能，我们分别在mRNA和蛋白质水平研究了ZNF268在不同器官和组织中的表达图谱，为进一步深入研究奠定基础。 以~(32)P标记的ZNF268cDNA特异片段(3’UTR)作为探针，通过Northern杂交技术，检测了ZNF268在42种正常人成体器官和组织以及8种晚期胎儿器官中的表达。结果显示，除阳性对照外，检测的所有样品中均无明显的杂交信号。同时，从早期人胚胎(3-5周龄及3月龄)提取总RNA与ZNF268探针进行杂交，均得到了3.8kb的杂交条带。Northern结果表明ZNF268mRNA仅特异性表达于早期人胚，而在成人组织中不表达。 为了进一步在翻译水平研究ZNF268蛋白的表达，我们构建了ZNF268重组原核表达载体，纯化在大肠杆菌中表达的产物，制备了特异的zNF268抗体paZNF268ab。以paZNF268ab抗体为依托，用Western印迹法检测出在4月龄人胚胎肝脏组织中，有分子量为108KDa的ZNF268蛋白的特异表达信号。进一步利用免疫组织化学方法检测ZNF268蛋白在5周至7月龄人胚肝中的表达。结果显示ZNF268蛋白在不同发育时期的人胎肝中表现出不同的表达水平，其表达量随着胚龄增加、即胚肝分化发育成熟而下降。由此可见ZNF268可能参与调控早期人胚肝的分化和发育。免疫组织化学的结果还显示，ZNF268在早期的造血干、祖细胞中表达。因此ZNF268也可能参与早期造血细胞的分化发育，从而与早期人胚造血相关。 大多数锌指蛋白做为转录调控因子，在细胞中的表达集中于细胞核中。而用免疫组织化学方法检测ZNF268蛋白表达产物的定位时，发现ZNF268蛋白集中于细胞质中。为了进一步确认ZNF268蛋白在细胞中的表达定位，构建了与绿色荧光蛋白融合的部分及全长ZNF268表达载体，对在COS7细胞中表达的不同ZNF268片段融合EGFP的蛋白质进行细胞内定位。结果证实ZNF268蛋白的表达主要定位于细胞质中。这一结果表明ZNF268不同与大多数的锌指蛋白，其发挥功能可能是通过胞质内的调控途径。同时这一结果为确定ZNF268的靶向物及研究ZNF268的功能奠定了基础。 在研究ZNF268表达产物的细胞内定位时，我们还观察到ZNF268KRAB盒的表达产物定位于细胞核中。CZHZ型锌指蛋白的KRAB盒具有和其它因子相互作用而介导转录抑制的功能。ZNF268的KRAB盒保守性很高，可能同样是一个转录抑制因子。细胞内定位的结果显示ZNF268的KRAB盒主要集中于细胞核中，这与其它转录抑制因子定位于细胞核中是一致的。为了研究ZNF268KRAB盒的功能，构建了一系列含有ZNF268KRAB盒不同片段的真核表达载体;与含有CAT基因的报告载体共转染细胞，分析ZNF268KRAB盒的转录抑制活性。结果证实ZNF268的KRAB盒确实具有转录抑制作用;并且KRAB一A是一个强抑制子，KRAB一B对KRAB一A有协同作用。 在确证了ZNF268有转录抑制功能的基础上，我们希望寻找ZNF268功能作用的靶向物。采用酵母双杂交技术，用ZNF268蛋白作为“诱饵”，筛选18~24周龄(约4一6月龄)的人胚肝文库。经过营养缺陷型筛选、X一a一gal和X一p一gal筛选、及体外免疫共沉淀验证，得到一个与ZNF268蛋白相互作用的蛋白质AHSG。研究表明，AHSG参与人胚肝的发育。ZNF268蛋白与AHSG蛋白的互作说明，ZNF268可能通过与AHSG协同作用而参与调控人胚肝的发育。同时，AHSG不仅仅表达于肝脏，在骨髓生血基质中也有表达，并与多种血液疾病相关，提示ZNF268潜在的与早期人胚造血的关系，以及在某些特定情况下可能与某种疾病相关。 总之，本研究从转录和翻译水平分析了ZNF268在人早期胚胎中的表达特征;研究了ZNF268的细胞内定位并分析了其作用的靶向物。研究结果初步阐明了这一新的锌指蛋白基因在人早期胚胎中的功能。
吴洁[5]2010年在《PML4通过增强GATA-1转录活性参与红系分化成熟》文中指出造血生成是由少量的造血干细胞(HPCs)通过增殖分化产生多种成熟血细胞的过程,造血系统作为研究分化相关细胞分子机制的模型被广泛关注。正常造血分化是个复杂多步骤的过程,受到细胞间和细胞内多种信号的严密调控,这些信号最终靶向转录调控因子,特异转录因子的表达决定了细胞的分化方向。造血转录因子的缺失或功能异常会导致造血分化出现问题,引发造血系统疾病。因此对造血转录因子的表达及功能的精确调控在正常造血生成过程中具有重要意义。红细胞是造血生成中产生最多的细胞类型,红系细胞生成的转录调控是造血系统中研究较多的一类。红系分化是一个受到精密调节的有序过程,与动态的特异基因表达模式密切相关,目前已发现许多转录因子和信号通路参与其中。在红系造血分化过程中,红系特异基因渐次开启表达,而另一些基因的表达逐渐关闭,最终细胞呈现红系特异表型。GATA-1是红系分化和成熟过程中的中心转录因子,GATA-1的靶基因有很多,几乎所有的红系特异表达的基因都是GATA-1的靶基因,GATA-1既可以作为激活子也可以作为抑制子起作用。GATA-1还能与多种转录因子及辅因子相互作用,其特定功能与其相互作用因子密切相关。发现新的GATA-1的相互作用蛋白并对其进行研究有利于我们更好地理解GATA-1的功能以及红系分化过程中的转录调控机制。早幼粒细胞白血病蛋白PML是肿瘤抑制子,主要定位于PML核体内,PML蛋白的核体内定位,对于其功能的发挥和核体的形成至关重要。PML核体可通过募集和释放多种蛋白参与多种细胞功能的调控,例如诱导细胞衰老和凋亡,增殖抑制,维持基因组稳定性和抗病毒。此外,PML在造血系统中亦具有重要作用,PML参与造血祖细胞分化,还有研究表明PML参与粒系分化,而PML在红系分化中的作用还未被充分阐释。基因的表达模式往往与其功能相关,我们首先用realtime-PCR的方法检测了PML在发育不同阶段红细胞中的表达情况,结果发现PML在8.5d-10.5d的卵黄囊中表达较低,而在11.5d-14.5d的胎肝中表达较高,说明PML在小鼠红系发育较晚期组织中高表达,且表达谱与GATA-1存在一致性。同时,以G1E-ER4, MEL, K562细胞系作为诱导红系分化的模型,检测了PML在分化不同阶段红系细胞中的表达,PML在诱导红系分化过程中持续表达,在EPO诱导CD34+细胞向红系分化时表达上调,且同样发现PML与GATA-1的表达谱存在一致性。随后我们构建了PML和GATA-1的表达质粒,利用co-IP, GST pull down等方法证明体内和体外PML能与GATA-1直接相互作用,免疫荧光结果说明PML可以将GATA-1募集到PML核体上。接着我们构建了PML和GATA-1的系列缺失突变体,同样用co-IP的方法证明分别是GATA-1的C端锌指和PML的coiled-coil结构域介导了它们的相互作用。PML与GATA-1的相互作用是否是功能性的呢?通过报告基因实验发现,PML可以增强GATA-1的转录活性,且PML与GATA-1的相互作用对于PML增强GATA-1的转录活性必不可少。PML是如何影响GATA-1的转录活性的呢?我们利用报告基因、IP、ChIP方法对其机制进行研究发现,PML增强体内GATA-1与DNA的结合,PML促进GATA-1与其辅因子p300的协同激活能力,并可促进GATA-1与p300的相互作用,增强p300对GATA-1的乙酰化,增加CBP/p300在GATA-1结合位点上的募集。我们用PML的诱导剂干扰素α处理K562细胞,发现PML表达上调的同时,珠蛋白基因的表达也上调。进一步在K562细胞中过表达PML可检测到细胞增殖抑制,细胞周期G1期阻滞,红系分化标志物珠蛋白和血型糖蛋白A等的表达上调,干扰PML则这些基因表达下调,而GATA-1过表达对珠蛋白的影响与PML类似。同样,PML过表达的G1E-ER4细胞中,α,β-珠蛋白转录增强,联苯胺染色结果显示血红蛋白生成增多,说明PML促进红系分化成熟。我们还在人原代红细胞中进行了PML的过表达和干扰,发现原代细胞中PML也可以增强珠蛋白基因的表达。此外,利用GATA-1缺失的G1E细胞和GATA-1活性可诱导的G1E-ER4细胞为研究模型,我们发现PML对红系分化成熟的促进作用是GATA-1依赖的。综上所述,我们的研究首次发现PML可作为GATA-1新的调节因子,将GATA-1募集到PML核体,促进GATA-1与CBP/p300的协同作用,增强GATA-1的乙酰化和体内与DNA的结合,从而提高GATA-1的转录活性,并且通过调节GATA-1的活性参与红系终末分化。
郝艳秋[6]2003年在《人肝再生增强因子基因克隆、表达、生物活性及应用研究》文中研究表明肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration,ALR)是一种特殊的促肝细胞分裂原，在肝损伤修复过程中起重要的作用。 肝脏疾病是危害人类健康的重大疾病之一。我国的肝炎、肝硬化及肝癌患者人数在1亿左右。且发病率在逐年上升，据1999年统计，发病率在12％左右。因此，为解除肝病患者的痛苦，研究一种医治肝病的新药迫在眉睫。1987年以来，我国学者应用胎肝的混悬液，治疗各种肝病取得了明显的疗效。由此启发并说明胎肝中含有肝细胞的增殖刺激因子。1994年Hagiya等人从初断乳大鼠的肝胞液中分离出一种能促进肝细胞增殖的一种热稳定性细胞因子，命名为肝细胞再生增强因子。 本论文应用基因工程的手段克隆、表达并纯化了人的肝再生增强因子基因(hALR)。为进一步研究它的生物学功能打下了基础。并通过建立大鼠肝纤维化模型和小鼠的脂肪肝损伤的模型，较系统的研究了基因克隆方法获得的人肝细胞再生增强因子基因的生物活性，为使hALR尽早应用于临床治疗肝病奠定了基础。结果如下： 1．首次从6个月胎肝中提取hALR基因的总的RNA，采用RT-PCR的方法克隆了hALR的完整阅读框的cDNA片段。由测序结果得知，重组子片段是由378个碱基组成的，有2个碱基发生了突变，未导致氨基酸发生变化。 2．首次构建了重组ALR原核表达载体，获得了pET28a-hALR的重组表达质粒，并测序证实。 3．首次对pET28a-hALR基因进行了IPTG梯度的诱导表达，不同浓度的诱导剂IPTG诱导表达表明，当IPTG浓度为1M时，表达量最高；首次对pET28a-hALR基因进行了时间梯度的诱导表达。经过不同时间的诱导表达表明，诱导时间在3小时时表达量最高。 4．首次对pET28a-hALR基因表达部位进行了分析。原核表达的蛋白质无论在沉淀中还是在上清中均有表达。在沉淀中较在上清中表达得多。即蛋白质在大肠杆菌细胞内表达量大，而且主要是以包含体的形式存在。 5．通过表达蛋白质的免疫印迹检测(Western-blot检测)，证明表达出了18.7KD的融合型目的蛋白。Westen-blot杂交显色反应，结果在20.1KD附近有一明显的黑色斑点，正是hALR与其抗体结合后所表达的目的蛋白。 6．用NI离子交换树脂对表达的pET28a-hALR蛋白质进行了纯化。纯化的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，证明了目的蛋白被纯化出来了。 7．首次通过建立人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化模型，研究rhALR对肝纤维化的生物活性作用。结果表明，rhALR对免疫损伤性大鼠肝纤维化的组织增生有明显的抑制作用，在免疫性肝纤维化过程中，给予rhALR可使血清中ALT，AST，LDH水平明显降低。保护了人血白蛋白所致的大鼠肝细胞的慢性免疫性损伤。 8．首次通过建立乙硫氨酸引起的小鼠的脂肪歼损伤的模型，观察rhALR对脂肪肝损伤的生物活性作用。结果表明，rhALR可抑制小鼠脂肪肝时ALT，AST，LDH活性升高，同时降低TG、TCH的含量，hALR对乙硫氨酸引起的小鼠脂肪肝有治疗作用。 东北农业大学理学博士学位论文一 9．通过基因工程的方法可以大量的生产11Hut，不仅大大陶氏了成本，而且克服了生u剂的缺点：纯度低、含杂质、成本高、易出现过敏反应等。同时也解决了胎肝来源受限的问题。为重组人肝再生增强子基因的药品开发和临床应用奠定了 出。 10利用酶联免疫吸附的方法检测不同类型肝病患者血清中ALR水平。尝试了一种较快速的检现9 患者血清中ALR水平的方法。本实验结果表明，肝病患者血清中影氏可检测到 ALR水平的浓度为 0．2 u叭，最高是9．2 u g／L。发现ALR抗体与 ALR抗原反应呈较好的线性正相关。提示ELISA j3i：．；y测外周血清中ALR水平具有良好的敏感性和特异性。
王灿华[7]2006年在《ACAT2基因特异性表达的分子机制研究及小鼠ACAT1 cDNA 5'-UTR的克隆分析》文中研究说明酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一合成胆固醇酯的酶,在细胞和生物体胆固醇代谢平衡中起着非常重要的作用。目前在哺乳动物细胞中发现两种基因编码ACAT(ACAT1和ACAT2)。ACAT1广泛存在于各种组织细胞中,与细胞胆固醇代谢平衡有关;而ACAT2则选择性地在小肠和肝脏细胞中表达,主要参与饮食中胆固醇的吸收和载脂蛋白的装配。人类一些重要疾病如:涉及心脑血管病的动脉粥样硬化、神经系统的阿尔海默氏疾病及胆结石病等,都与ACAT密切相关。因此,ACAT已成为国际前沿密切关注的筛药靶标。ACAT是一种低含量的内质网膜蛋白,其天然型至今仍未成功纯化,所以在基因水平的研究是目前唯一有效的途径。1993年,美国Dartmouth医学院的TY Chang教授实验室首先克隆得到了人ACAT1 cDNA K1,ACAT的分子生物学等研究才迅速发展起来。我的论文工作所在的中国科学院上海生命科学研究院生物化与细胞生物学研究所李伯良教授实验室与美国TY Chang教授实验室合作研究,已首先报道了人ACAT1、ACAT2基因的基因组结构和它们的启动子序列等,而且在人ACAT1基因的表达调控研究中取得很好进展。在这些研究基础上,本论文工作的主要部分是探索ACAT2基因分化、组织和种属特异性表达的分子机制。首先,通过序列分析发现,在人ACAT2基因核心启动子区内,有4个肠细胞特异的转录因子Cdx2和1个在肝细胞及其它细胞中普遍表达的转录因子HNF1α的结合位点,并且第1、2个Cdx2(Cdx2-1和Cdx2-2)元件与HNF1α元件完全重叠。进而缺失突变、定点突变和启动子-荧光素酶报道基因活性分析结果都证明,它们是ACAT2基因肠细胞分化依赖启动子活性所必需。凝胶阻抑实验(EMSA)也证明,肠Caco-2细胞的核蛋白与ACAT2基因的启动子片段形
付汉江[8]2005年在《非编码RNA克隆分析及其功能初步研究》文中研究说明近年来,不编码蛋白质的RNA分子—非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)被大量发现,与已知的mRNA、rRNA及tRNA不同,它们不直接参与蛋白质的合成。非编码RNA在各种生物中广泛存在,它的种类繁多,主要包括:类mRNARNA、microRNA(miRNA)、snRNA、snoRNA、scRNA、pRNA、SRP-RNA、gRNA等。非编码RNA可影响转录及染色质的结构,参与RNA的加工修饰,调节mRNA的稳定性及翻译,还可以影响蛋白质的稳定和转运。ncRNA以多种机制发挥这些作用,如:RNA-RNA(DNA)碱基配对、RNA-蛋白质相互作用、模拟其他核酸分子或直接起催化作用。microRNA及类mRNA RNA是两类非常重要的非编码RNA分子,已有的研究结果表明它们与细胞的生长和分化、胚胎的发育、肿瘤的形成和抑制都有着密切的关系。本论文对这两种非编码RNA分别在发育、肿瘤及衰老过程中的作用进行了初步研究。 microRNA是一类20-25个碱基可调控其他基因表达的小分子非编码RNA,它广泛存在于各种真核生物中。虽然现在已从多种生物中鉴定出了数百种miRNA,但仍有大量的miRNA尚未发现,即使在人体中,实际存在的miRNA数量也可能远远超过原先预测的约250条。这就意味有许多miRNA,特别是那些在特定组织或在特定发育阶段表达的miRNA有待鉴定。对目前已知的miRNA,只有极少数的功能得到了较完整的研究,大部分miRNA在细胞中所起的作用对我们来说还是一个有待揭示的谜。由于miRNA分子非常小,表达量相对较低,容易降解,因此用传统的方法克隆miRNA比较困难。肝脏是人体的一个及其重要的器官,它承担着造血、免疫、消化、解毒、物质代谢等多种重要功能。为探讨相关miRNA在肝细胞中调控基因表达的机制,揭示相关miRNA在肝细胞增殖、癌变中的生物学功能,我们以人胎肝为实验材料进行了miRNA的克隆分析并初步探讨了miRNA对细胞增殖的影响。这部分获得的主要进展有: 1.建立了一种新的miRNA基因克隆分析方法,与传统克隆方法相比,这种方法减少了RNA操作步骤,具有操作简便、减少RNA降解、无须使用同位素及成功率高等优点。 2.建立了一种简便快速的miRNA表达检测方法,这为检测miRNA在各种组织及细胞中的表达水平,进行功能研究提供了良好的工具。 3.利用这种新的miRNA克隆方法,成功地从人胎肝组织中克隆到27条
阳学贤[9]1999年在《人红系发育相关基因的分离鉴定》文中提出红系发育是贯穿个体发育的重要生理过程，这一过程由三条主线组成：(1)随着个体发育，造血器官发生改变，红细胞发生由卵黄囊、胎肝最后迁移至骨髓；(2)造血多潜能干细胞经寡潜能干细胞、单潜能血细胞，最后分化为成熟红细胞；(3)红细胞从胚胎期到胎儿期再到成年期发生的珠蛋白开关。这一过程是细胞内多基因调控的结果，已有一些与红系分化发育相关的基因被分离鉴别，但还有许多基因仍不清楚。一些基因的表达异常导致的红系发育紊乱常与疾病相关，如红白血病、与珠蛋白发育开关相关的HPFH、PU.1的过表达诱导的成年鼠成红细胞永生化及EKLF敲除导致的鼠胎儿期致死等。可见，研究红系发育调控具有重要的理论和临床意义。 为了分离人红细胞从胎儿期到成年期发育相关新基因，本文首先从原代培养成人骨髓红系祖细胞BFUe入手，获得可代表成人型红细胞的BFUe衍生集落细胞(BFUeDCs)。并且，建立了一种新的“特异ds cDNA合成介导的丰富cDNA扣除”的方法，有效消除了BFUeDCs cDNA群中丰富的珠蛋白拷贝。 在此基础上构建了成人型红细胞BFUeDCs对胎儿型红细胞K562-H(Hemin诱导的K562细胞)的消减cDNA文库，获得了约1.1×10~3个独立阳性克隆。随机挑取37个克隆进行测序分析，发现了12个新的EST。 为了获得兴趣基因的全长cDNA，构建了BFUeDCs cDNA文库，其原始库容量为1.81×10~6 pfu，有效库容量1.47×10~6 pfu，重组率81.2％，插入片段范围0.4～2.8kb。 以EST-XF为探针筛选BFUeDCs cDNA文库获得一长2,206bp的cDNA，与GenBank核酸数据库中所有序列比较不具有显著同源性，是一新
孙晓艳[10]2004年在《肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究》文中指出本文采用免疫组织化学、细胞培养、分子克隆、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附实验、放射免疫等方法和技术，就近些年来干细胞领域研究的热点问题——干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞进行了研究，着重探讨了肝干细胞在肝脏中的分布及迁徙，并从基因和化学因子两个方面探讨肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的机制。 全文共分四个部分。 第一部分，胎肝中肝干细胞的免疫组织化学研究。采用免疫组织化学方法显示不同时期人胚胎肝脏的干细胞，分析肝干细胞的形态与分布特点及发育过程中干细胞在肝脏中的迁移，探讨肝脏的发生发育及肝内干细胞的来源。 本课题采用免疫组织化学的方法借助肝干细胞的表面表达蛋白CD34、C-11、CK19、OV6标记胎儿肝脏中的干细胞，观察不同发育时期肝干细胞在胎肝中的分布与迁移。结果发现胎肝内汇管区周边界板处含有丰富的卵圆样干细胞，这些细胞具有相似的形态和分布，分别表达CD34、C-11、CK19和OV6。阳性细胞紧密排列成管，呈鞘样包绕着原始汇管区，部分包绕着初级汇管区，随着次级汇管区的成熟，卵圆样干细胞逐渐局限于赫令氏管周围。此外，胚胎发育的不同阶段均可见单核样细胞分散在肝索、肝血窦之内；这些细胞分别表达CD34、OV6，多见于汇管区的间充质组织之内，肝血管内少见。 以上研究表明，1)汇管区周边界板处含有丰富的干细胞，胚胎发育早期此处可能是肝脏发育的起点，这些干细胞逐渐分化为胆管上皮样细胞，然后分化为肝细胞和胆管上皮细胞。2)CD34、C-11、CK19和OV6分别阳性的卵圆样干细胞具有相似的形态和分布，都表达肝干细胞的特征性表面蛋白可能是同一来源的干细胞。3)肝内存在着造血干细胞来源的干细胞，这些细胞尽管形态和分布相似，OV6、CD34表达阳性的单核样干细胞是否属于同一细胞类型，它们和造血干细胞的关系，还需要进一步的深入研究。 第二部分，神经中间丝蛋白Nestin在胎肝干细胞中的表达。为了进一步探讨肝干细胞向着胰岛素分泌细胞方向分化的可塑性，采用免疫组织化学的方法研究标记不同发育时期人胚胎肝干细胞中Nestin的表达，研究肝干细胞向着胰岛素分泌细胞方向分化的可能性的同时探索肝干细胞新的表面标志蛋白。 不同发育时期胎儿肝脏，取材、固定制成石蜡切片，ABC法标记神经前体细胞的特异性表面标记Nestin在胎肝干细胞中的表达。结果发现汇管区周边界板处卵圆样干细胞表达Nestin阳性，Nestin阳性细胞单层紧密排列成管，呈鞘样包绕着早期汇管区，部分包绕着初级汇管区，随着次级汇管区的成熟，Nestin阳性卵圆样干细胞逐渐局限于赫令氏管周围;此外胚胎发育不同时期均可见Nestin阳性的单核样干细胞分布在肝实质内。 以上研究表明，肝内的卵圆样干细胞和单核样干细胞都可以表达Nestin，具有向着胰岛p一细胞方向定向分化的前提。Nestin可能是一种特征性的蛋白在未分化的内胚层来源的干细胞中表达。 第三部分，pEGFP一PDx一1表达载体的构建。构建真核表达质粒，从基因诱导方面着手研究胰腺内分泌细胞发育的关键基因PDX一1在肝干细胞定向分化中的调控机制，为胰岛及p一细胞发育的基因调控机制的研究提供理论参考。 参考分子克隆技术，采用PCR的方法从SK900/BLSCRIPT质粒中扩增PDX一1，同时将一个单个限制性酶切位点连接反应转变为以Hindm和BamHI为末端的双限制性酶切位点连接反应，将PDX一1。DNA插入PEGFP一cl的多克隆位点中，构建一个重组表达质粒PEGFP一cl一PDx一1，并对重组子进行Smal单个酶切鉴定。 将PDX一1插入pEGFP一Cl的c一末端，在pEGFP一cl启动子的作用下与pEGFP一Cl一同表达形成融合蛋白，同时以GFP作为报告基因，减小外源基因表达产物对细胞的毒性，提高PDX一1在真核细胞中的表达，而且不影响其目的蛋白的结构和功能，对研究PDX一1调控肝干细胞的定向分化机制具有重要的意义。 第四部分，卵圆细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。在充分研究肝脏内干细胞的分布和定位的前提下分离大鼠肝脏卵圆细胞，在化学诱导剂作用之下使卵圆细胞定向分化为胰岛素分泌细胞，检测诱导后肝干细胞的表型变化，研究肝干细胞的诱导分化机制，为干细胞的定向分化和干 一4-细胞诱导分化的替代疗法的临床实践提供实验参考。 首先以3’一me一DAB喂食大鼠四周，刺激肝卵圆细胞的迅速增生，改良梯度离心法分离、培养大鼠卵圆细胞，观察其形态、描述其增值特点并进行免疫组织化学鉴定。随后更换含有Nicotimide和高浓度葡萄糖的RPMI 1 640培养液继续培养，同时以不含诱导剂的RPMI 1 640培养液培养的卵圆细胞作为阴性对照;sDs一聚丙烯酞胺凝胶电泳、ELIsA、班A鉴定细胞表达产物。结果发现改良的梯度离心的方法能够有效的分离大鼠肝卵圆细胞，卵圆细胞胞体为卵圆形，代谢缓慢，具有干细胞的特点，可以形成集落，并且0V6、CD34、Nestin染色呈阳性。SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳显示诱导组的细胞样品在相应位置上出现胰岛素表达条带，阴性对照组没有该条带出现;ELISA?
参考文献：
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[8]. 非编码RNA克隆分析及其功能初步研究[D]. 付汉江. 中国人民解放军军事医学科学院. 2005
[9]. 人红系发育相关基因的分离鉴定[D]. 阳学贤. 中国协和医科大学. 1999
[10]. 肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究[D]. 孙晓艳. 第一军医大学. 2004