陈增刚[1]2001年在《人类整体椎间盘在藻酸盐凝胶中的培养》文中指出实验设计：将带软骨终板的胎儿椎间盘包埋于藻酸盐凝胶中培养，观察椎间盘组织中蛋白多糖含量的变化。目的：建立一种体外椎间盘培养系统，研究椎间盘作为一个完整的器官时，其培养的可行性。背景资料：由于在培养基中保持椎间盘——特别是髓核的组织完整性比较困难，所以体外椎间盘培养的研究十分少，目前尚无人类完整椎间盘体外培养的报道。方法：将带软骨终板的胎儿椎间盘包埋于藻酸盐凝胶中培养2周。分别在第1周和第2周对髓核中蛋白多糖的含量进行检测。包埋于藻酸盐凝胶中不带软骨终板的胎儿椎间盘和普通培养基培养的胎儿椎间盘作为对照组。结果：包埋于藻酸盐凝胶中带软骨终板的椎间盘其髓核中蛋白多糖的含量始终高于对照组。结论：这种组织培养方法有助于整个椎间盘代谢的维持，人类完整椎间盘体外组织培养是可行的。
丁凡[2]2012年在《持续压力对兔椎间盘髓核细胞线粒体及细胞外基质合成代谢的影响》文中认为第一部分原代椎间盘髓核细胞的体外分离及培养(一)原代脊索细胞的体外分离及培养目的：建立体外兔椎间盘脊索细胞的藻酸盐凝胶培养模型,并观察其形态及生物学特点。方法：胶原酶消化法及不连续密度梯度离心法体外分离收集原代椎间盘脊索细胞,于1.2%低粘度藻酸盐凝胶中进行培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态、Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行细胞表型初步鉴定,并分别以死活细胞染色及活细胞计数试剂盒(CCK-8法)检测细定胞在藻酸盐凝胶中的存活情况及细胞增殖能力。结果：成功分离获得原代椎间盘脊索细胞,其可稳表达Ⅱ型胶原。原代细胞在藻酸盐凝胶中生长良好,但增殖缓慢。结论：初步了解兔椎间盘脊索细胞体外生物学特性,为椎间盘退变机制及组织工程学髓核种子细胞的研究提供了一定的实验依据。(二)原代软骨样细胞的体外分离培养及共培养体系的建立目的：观察非接触共培养条件下脊索细胞对软骨样细胞增殖及生物学特性的影响。方法：无菌条件下取4周龄日本大白兔胸腰段脊柱,获取髓核组织,酶消化法及不连续密度梯度法分离纯化的脊索细胞及软骨样细胞。取第2代软骨样细胞与脊索细胞按1：1的比例接种于共培养装置Transwell小室中,单层培养的软骨样细胞设为对照组。培养1,3,7和10d后倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,免疫荧光法鉴定细胞表型,CCK-8法测定细胞增殖,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖的表达。结果：成功地分离纯化获取脊索细胞及软骨样细胞。镜下观察见原代脊索细胞体积较大,呈圆形或椭圆形,直径10-15μm,胞浆内含较多大小不等的囊泡；原代贴壁的软骨样细胞体积较脊索细胞小,呈短梭形,直径4-6μm。随着非接触共培养时间的延长,软骨样细胞增殖明显加快,以共培养7,10d明显(P<0.05)；Ⅱ型胶原、蛋白多糖的表达量也逐渐增高。结论：脊索细胞能促进髓核软骨样细胞的增殖,其可能在阻止椎间盘退变的发生中具有一定意义。第二部分持续压力对体外单层培养兔椎间盘髓核细胞线粒体及细胞外基质合成代谢的影响目的：本研究的目的在于观察线粒体途径是否参与了压力诱导的兔髓核细胞凋亡这病理过程中。方法：可控加压装置用于观察持续压力(压力强度为1.0Mpa)对单层培养髓核细胞行压力负荷6,12,18,24及36h后造成的生物学效应。细胞活力情况通过细胞计数试剂盒CCK-8检测,细胞凋亡率通过流式细胞仪进行分析,倒置相差显微镜观察细胞的形态学改变,凋亡相关的基因和蛋白表达分别通过实时荧光定量(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR) PCR和Western-blot来进行分析。Western-blot检测细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白多糖的蛋白表达。细胞线粒体功能主要通过线粒体膜通透孔、活性氧及线粒体膜电位进行分析。结果：该压力强度在上述时间点内能使细胞活力明显降低、细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白多糖的蛋白表达减少,且能诱导兔椎间盘髓核细胞发生凋亡改变。而且该压力能显着抑制髓核细胞线粒体功能,表现为细胞线粒体膜通透孔的开放、活性氧的过度产生及线粒体膜电位的降低。结论：该压力不仅能抑制髓核细胞细胞外基质蛋白合成代谢,而且还诱导髓核细胞凋亡。且其诱导的髓核细胞凋亡可能部分通过线粒体凋亡途径所介导。线粒体途径介导的髓核细胞凋亡可能是椎间盘发生退行性改变的重要机制。第叁部分持续压力对体外藻酸盐凝胶立体培养兔椎间盘髓核细胞线粒体及细胞外基质合成代谢的影响目的：本研究通过建立兔椎间盘髓核细胞藻酸盐凝胶立体培养模型,观察压力干预对髓核细胞线粒体功能及相关基因表达的影响。方法：将髓核细胞置于1.2%的低粘度藻酸盐凝胶中进行立体培养,再行压力干预12,24,36,40及48h后观察相应的生物学效应。如酶标仪检测细胞线粒体脱氢酶活性,相关的基因表达通过实时荧光定量RT-PCR来进行分析。结果：该压力强度在上述时间点内能降低兔椎间盘髓核细胞细胞外基质蛋白多糖mRNA的表达,且能诱导凋亡的发生。此外该压力能显着抑制髓核细胞线粒体功能,表现为线粒体脱氢酶活性的降低。结论：该压力能抑制椎间盘髓核细胞细胞外基质的合成代谢及线粒体脱氢酶活性,且能诱导髓核细胞发生凋亡。线粒体途径可能参与了压力诱导的髓核细胞凋亡过程中。
丁涛[3]2010年在《丝素蛋白/磷酸钙骨水泥在肺栓塞动物模型及椎间盘藻酸盐凝胶培养系统中的实验测试研究》文中进行了进一步梳理第一部分丝素蛋白/磷酸钙骨水泥的制备、抗稀散性及体外凝血实验研究【目的】制备丝素蛋白/磷酸钙骨水泥(silk fibroin/calcium phosphate cement,SF/CPC)复合人工骨材料,对骨水泥在液体中的抗稀散性进行测试,试验不同SF添加质量分数对稳定性的影响,同时测试PMMA、CPC和SF/CPC对离体动物血浆凝血指标的影响,为下一部分的动物体内实验提供参照。【方法】将家蚕丝纤维脱胶、溶解、透析、喷雾干燥后制得丝素蛋白粉末。通过液相沉淀法制备磷酸四钙,将其和无水磷酸氢钙等摩尔比混合,加入4 wt%羟基磷灰石晶种。配制质量分数分别从0.5 wt%、1.0 wt%、1.5 wt%、2.0 wt%、2.5 wt%到3.0 wt%的丝素复合磷酸钙骨水泥6组,按液固比0.4ml/g与固化液混合,制备6种SF/CPC,未添加SF的CPC组作为空白对照。观察各种材料在液体中的抗稀散性,定量测定骨水泥残余质量百分比。将固化后的PMMA、CPC和SF/CPC骨水泥材料颗粒加入新鲜猪血浆,测定材料对凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原定量(Fig)及D-二聚体(D-D)等凝血指标的影响。【结果】由于SF的添加,CPC在液体中的抗稀散性明显提高,随着SF质量分数的提高,SF/CPC的骨水泥残余率逐渐上升,至2.5wt%-3.0wt%时基本达到100%。叁种骨水泥作用动物血浆后仅CPC组的PT略有减少,其它凝血指标未见明显改变。【结论】丝素蛋白的添加可以明显改善磷酸钙骨水泥在液体中易崩解的特性,SF/CPC的抗稀散性与添加SF的质量分数有同增关系,兼顾稳定性与注射性,选择2.5wt%的SF/CPC进行后续的研究。骨水泥材料对体外血浆的凝血指标影响很小,仅观察到CPC使PT有轻微的缩短,丝素的添加可进一步提高CPC的血液相容性。第二部分丝素蛋白/磷酸钙骨水泥在骨水泥肺栓塞动物模型中的测试研究【目的】建立骨水泥肺栓塞动物模型,研究PMMA、CPC及SF/CPC叁种材料造成肺栓塞后,对心血管系统的血流动力学、肺氧合及抗凝血酶活性的影响,探讨丝素改良骨水泥材料降低心血管系统并发症的可行性。【方法】实验动物麻醉后气管插管,呼吸机保持正常的呼气末潮气量和动脉CO2浓度。下肢股动脉置入测压管,供监测有创动脉血压和采集血标本;经颈内静脉置入肺动脉漂浮导管测量肺动脉压及中心静脉压。动物行开胸手术,经肺动脉干注入PMMA、CPC或SF/CPC骨水泥,持续监测血流动力学参数,包括平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure,MPAP)、平均动脉压(mean arterial pressure,MABP)、中心静脉压(central venous pressure,CVP)和心率(heart rate,HR) ;测定预设时间点的动脉血PH值、动脉血氧分压(PaO2)和动脉血二氧化碳分压(PaCO2)以及注射前后抗凝血酶Ⅲ活性(ATⅢ)。处死后肺标本行CT检查,立体叁维重建血管内骨水泥铸形。【结果】CPC对心血管系统的影响最为严重,平均肺动脉压的升高最大时为21.33±5.44mmHg(注射后50分钟),平均动脉压下降最大时为-27.15±11.79mmHg(注射后50分钟),在注入骨水泥10分钟时出现心率的瞬时下降(-27.67±6.14次/分)。PMMA组及SF/CPC组的变化较轻微,与CPC组比较差异有统计学意义。注射骨水泥后CPC组血气指标改变明显,PH值下降,变化最大时-0.13±0.02(注射后60分钟),动脉血二氧化碳分压(PaCO2)升高,变化最大时15.9±7.67mmHg(注射后60分钟),注射后10分钟动脉血氧分压(PaO2)即已有明显下降(-23±1.26mmHg); PMMA及SF/CPC对肺栓塞动物动脉血气的影响较小。AT-III在叁组均有下降,CPC组降幅最大,与另两组间差异有统计学意义。【结论】注射型骨水泥直接注入动物肺动脉干可建立椎体成形术中骨水泥血管渗漏致肺栓塞模型,对PMMA、CPC及丝素复合CPC叁种材料进行的测试比较结果证明,骨水泥的抗稀散性对肺栓塞后心血管并发症严重程度起主要影响作用。丝素的复合使CPC在血液中的抗稀散性明显提高,有效地减少了栓子特别是微栓子的产生,能明显减轻骨水泥栓塞后对血流动力学、呼吸功能的影响,降低激活凝血系统的危险,从而降低急性心肺功能障碍的发生率和死亡率。第叁部分丝素蛋白/磷酸钙骨水泥对藻酸盐凝胶培养系统中椎间盘细胞活性、基质多糖及胶原代谢影响的实验研究【目的】研究PMMA、CPC和SF/CPC叁种骨水泥材料浸出培养液对藻酸盐凝胶培养系统中椎间盘细胞活性、基质多糖和胶原代谢的影响。【方法】兔椎间盘标本取出后,在藻酸盐凝胶系统中分别使用常规培养液(对照组)、PMMA、CPC及SF/CPC材料浸出培养液培养,至1周、2周及3周时,对各组标本行Hoechst33342和PI染色检测细胞坏死率,免疫组化检测I型胶原、Ⅱ型胶原的表达,番红O(Safranin O)染色检测基质蛋白多糖含量。在荧光显微镜下计数Hoechst33342和PI染色切片中强红色荧光+强蓝色荧光重迭的细胞数占总细胞数的百分比;利用Image-pro plus 6.0软件对免疫组化I型胶原、Ⅱ型胶原染色切片中棕黄色阳性沉淀及番红O染色切片中番红色部分作平均光密度(IOD/Area)分析。【结果】各周PMMA组及CPC组坏死细胞率均高于对照组及SF/CPC组,第一周时SF/CPC组坏死细胞率明显低于PMMA组和CPC组(P<0.05),第叁周时SF/CPC组坏死细胞率与PMMA组无统计学差异,但明显低于CPC组(P<0.05)。纤维环外层Ⅰ型胶原光密度测定结果显示,第一周时PMMA组光密度值明显低于其他组,第二周、第叁周时CPC组及SF/CPC组较对照组有升高。纤维环内层及髓核区II型胶原光密度测定结果显示,第二周时,PMMA及CPC组明显低于SF/CPC组和对照组,SF/CPC组近似于对照组。Safranin O染色光密度结果显示,对照组平均光密度值随时间呈下降趋势,PMMA组基质多糖含量下降最早且最为明显。【结论】PMMA对藻酸盐凝胶系统中培养的椎间盘细胞活性、基质胶原及多糖代谢影响最为明显,SF/CPC较CPC对椎间盘组织有更好的生物相容性,对椎间盘代谢的干扰最小。椎体成形术所用骨水泥材料可加速椎间盘的退变,影响程度与材料的类型有关,选择适当的填充材料可降低此并发症的发生率。第四部分丝素蛋白/磷酸钙骨水泥对椎间盘基因表达影响的实验研究【目的】研究骨水泥材料对椎间盘退变相关基因表达的影响,从基因水平分析椎体成形术后椎间盘退变的机理,为预防和治疗措施提供靶基因及作用机制等理论基础。【方法】建立藻酸盐凝胶系统对兔椎间盘进行体外培养,分别以常规培养液(对照组)、PMMA、CPC及SF/CPC材料的浸出培养液培养,至1周、2周时提取各组标本RNA行PCR扩增和产物检测以及SYBR? Green I荧光定量PCR检测,对AGC1、COLⅠ、COLⅡ、BMP-2、IL-1β、TIMP-1、MMP-3、MMP-2、SOX-9、TGF-β1、Cox-2在各组的表达水平进行比较,通过内标基因GAPDH和对照组基因对目的基因进行校正,2-△△CT法估算目的基因的相对表达量。【结果】第一周时PMMA组AGC1的表达量低于对照组,CPC组及SF/CPC组均高于对照组,第二周时SF/CPC组表达量仍保持较高水平;各骨水泥组COL1的表达量在第一周时较对照组均有反应性的调高,第二周回落仅SF/CPC组表达量仍能保持与对照组接近;各骨水泥组COL2基因表达在第一周时均未测出,第二周时虽可测出但均极低;第一周时PMMA组及CPC组MMP-2、MMP-3的表达量均高于对照组,第二周时CPC组表达量下降,SF/CPC组表达则始终低于对照组;第一周时PMMA组和CPC组的TIMP-1的表达量增高,第二周时各组表达量较第一周时均有下降;各骨水泥组IL-1β的表达在第一周及第二周均高于对照组,第二周时SF/CPC组的表达低于PMMA组和CPC组;CPC组COX-2的表达量高于其他组;第一周时大部分骨水泥组TGF-β1、BMP-2及SOX9表达量高于对照组,第二周时均有不同程度的下降,TGF-β1和SOX9的表达低于对照组。【结论】骨水泥材料对椎间盘退变相关基因表达量有影响,能促使体外培养的椎间盘退变,但椎间盘组织本身的保护和修复机制也有相应的反应性激活。不同类型的材料对特定基因表达的影响存在差异,PMMA和CPC使COL1基因表达短暂反应性增高后降至正常对照以下,而SF/CPC作用下COL1基因的表达仍能保持一定水平, PMMA对AGC1的表达抑制作用强,SF/CPC未引起基质降解相关基因MMP-2和MMP-3的表达上升,对炎症因子基因表达增高的刺激作用较PMMA和CPC组小。在影响基因表达水平上,SF/CPC促椎间盘退变的作用最小。
王海[4]2013年在《来源于人退变椎间盘的叁种干细胞与BM-MSCs生物学特性及组织工程应用的比较研究》文中研究表明背景:下腰痛(low back pain，LBP)是临床常见疾病，是导致劳动力丧失的主要原因之一，现在一致认为椎间盘退变性疾病(Degenerative disc disease，DDD)是引起LBP最常见的原因。有报道发现80%的人一生当中都曾发生过LBP，如此高的发病率给国家和社会带来了严重的经济损失。目前治疗DDD的方法包括保守治疗和手术治疗。保守治疗属对症治疗，以减轻和缓解疼痛为目的，不能解决椎间盘(Intervertebral disc, IVD)退变导致的生物学丧失问题，因此并不能从根本上解决疼痛的根源。手术治疗主要包括髓核摘除术和脊柱融合术。手术治疗旨在解除突出的椎间盘组织的机械压迫作用，从而达到解除疼痛的目的，但其也因未能恢复IVD的生物学性能，远期效果并不好，且常因内固定的使用而加速相邻节段椎间盘退变，从而发生新的问题。随着科学技术的日新月异，特别是近年来逐渐出现了多种IVD移植和人工椎间盘置换技术，这些技术一定程序上改善了临床治疗的效果，但这些技术也没有从根本上解决或者逆转IVD的生物学功能，仍然存在许多并发症和缺陷。现在认为理想的治疗DDD的方法是既能缓解疼痛症状，又能恢复IVD的结构和生理功能，远期效果好，复发率低。随着基础医学特别是干细胞研究的迅速发展，基于干细胞的治疗手段已成为治疗DDD最有希望前途的手段之一。近年来，应用组织工程技术对退变椎间盘进行再生和修复的研究取得了一些成绩，寻求以提高所构建的组织工程椎间盘的生物学活性为目的的新型种子细胞来源成为一项重要的任务。当前，多项研究证实人退变纤维环、髓核组织中存在具有多向分化潜能的干细胞。此外，在我们的前期工作中，课题组从人退变软骨终板中亦分离出类似于MSC的干细胞，这些细胞经诱导可以向骨、软骨、脂、肌方向分化，且体外实验结果显示出比BM-MSCs更强的成软骨能力。本研究旨在前期研究的基础上，从人退变椎间盘中分离、扩增纤维环细胞、髓核细胞、软骨终板细胞，经琼脂糖悬浮培养法筛选后，并探讨纤维连接蛋白筛选的效能，所获取的干细胞克隆与来自同一个体的BM-MSCs进行初步的细胞生物学特性比较，作为种子细胞分别构建组织工程髓核，进一步比较上述四种干细胞在动物体内的髓核再生和椎间盘的修复能力。目的：通过体内、外实验对NPSCs、AFSCs、CESCs与BM-MSCs的生物学特性进行检测与比较，初步探讨四种干细胞在细胞形态、增殖活性、表面标记物和体外向叁系分化的能力以及作为组织工程种子细胞在组织工程应用上的生物学特性差异，以期寻找一种新的、可应用于组织工程学的种子细胞,为组织工程椎间盘的构建甚至临床的应用治疗提供良好的种子细胞来源。方法：从因患腰椎间盘退变性疾病行椎间盘摘除植骨融合术中收集符合纳入标准的标本。将手术中最先切除出来的AF组织经副教授以上职称经验丰富的术者确认后，收入AF标本盒，随后两次切除组织予以舍弃，其后切除的标本经术者确认为NP时装NP标本盒，刮除的CEP装入CEP盒，植骨前取髂骨时接>5ml骨髓，以上标本再在解剖显微镜下清理异物杂质如韧带、肌肉及脂肪等，再次分离AF、NP及CEP，运用机械-酶消化法获取AF细胞、NP细胞和CEP细胞。BM-MSCs运用Percoll液梯度分离法获取。获得的IVD来源的叁种细胞经体外扩增至第2代时，第2代细胞经琼脂糖悬浮培养法筛选，并初步探讨Fibonectin差别粘附法的筛选效果，挑选取单细胞形成的克隆进行体外扩增，扩增后的细胞进行流式细胞术检测干细胞标志物、多向分化能力，进行干细胞的鉴定。同样，经诱导向骨、软骨及脂叁系分化的不同干细胞，经RT-PCR及组织学检测分析，寻找不同干细胞向不同细胞系分化能力的差异性。将不同干细胞复合藻酸盐体外构建组织工程髓核，培养1、7、14及28天后进行支架细胞增殖检测、DNA和sGAG含量检测，最后行SEM检测，寻找差异性。另外所获细胞经CFDA-SE荧光染料标记后植入纤维环穿刺抽髓核抽吸法制造的椎间盘退变动物模型体内，于术后第1、3及6月后进行MRI和X线检测评估IVD的退变情况，并在第6月处死动物，进行目标椎间盘的组织学检测评估。鉴于在前两部分实验中，发现四种不同干细胞中，CESCs具有最强的体外成骨及成软骨能力，复合藻酸盐构建的组织工程髓核也具有良好的生物学性能。此外,已有大量研究发现BM-MSCs具有良好的体内成骨效应，常常作为种子细胞来探讨用于横突间植骨融合的应用研究，并显示出了良好的应用前景。因此，我们特将CESCs与BM-MSCs一起复合多孔羟基磷灰石植入新西兰大白兔两侧横突间，术后2月时间内进行X线、叁维CT及micro CT检测及组织学评估，探讨两种不同干细胞间的成骨效应差异，分析和评估横突间融合的融合效率差异。数据应用SPSS13.0软件作统计学处理，定量结果采用配对T检验、单因素方差分析和重复测量的单因素方差分析进行统计分析，P<0.05被认为具有统计学意义。结果：1．来自同一个体的AFSCs、NPSCs、CESCs与BM-MSCs形态上类似，呈成纤维细胞样外观，但仍存在细小差别，AFSCs最细长，BM-MSCs最宽大，而CESCs尺寸最短，NP居中；四种干/祖的体外增殖能力没有显着差异；在体外实验观察中，经PCR及半定量分析，CESCs成骨和成软骨能力最强，AFSCs和BM-MSCs居中，两者没有显着差异，而NPSCs最弱；BM-MSCs成脂能力最强，NPSCs次之，CESCs和AFSCs最弱；流式细胞术结果表明，AFSCs和CESCs的CD105表面标志物均值呈中强表达，低于95%，而NPSCs略低于95%，四组干细胞的其它标志物的表达，满足ISCT对间充质干细胞的定义标准；四种干细胞体外构建的组织工程髓核培养结果表明，CESCs与BM-MSCs组中合成和分泌的sGAG与DNA含量最高，NPSCs次之，AFSCs最弱；组织工程髓核中的细胞增殖无显着差异；组织工程髓核的SEM结果表明，各干细胞皆与支架粘附较好，在28天后能分泌大量的ECM，其中CESCs最多，BM-MSCs次之，NPSCs居中，AFSCs最弱。2．AFSCs、NPSCs、CESCs与BM-MSCs复合藻酸盐植入椎间盘退变的动物模型体内，通过术后的检测分析，CESCs-藻酸盐复合物相对其余叁组细胞具有最强的髓核再生和椎间盘修复能力，BM-MSCs-藻酸盐和NPSCs-藻酸盐居中，而AFSCs-藻酸盐最弱。3．CESCs与BM-MSCs与HA复合进行兔腰椎横突间植骨对比中，两组干细胞复合HA皆能达到横突融合，增强脊柱的稳定性；CESCs相对BM-MSCs具有更强的体内成骨能力；多孔羟基磷灰石在应用于腰椎横突间植骨融合实验时，抗折性较差，需要加以改进，以适应一定的抗折性要求。结论：1.体外比较实验中，CESCs具有最强的成骨和成软骨能力，AF和BM-MSCs居中，NPSC最弱。2．CESCs显示了用于构建组织工程髓核的优秀的生物学特性，在体内或体外都可以作为一种具有优越性能的种子细胞应用于髓核组织工程领域，发挥干细胞的潜能。3．初步实验结果表明相比较BM-MSCs，CESCs具有更强的体内成骨能力。此外，CESCs能够作为一种优秀的种子细胞用于腰椎横突间融合，通过提高融合率和增强成骨效应，达到增加脊柱稳定性的作用。
刘青华[5]2014年在《去势山羊骨质疏松与椎间盘退变的相关性研究》文中指出骨质疏松症和椎间盘退行性变化均为中老年人常见病、多发病,往往可见于同一患者,严重影响其生活质量。研究表明骨质疏松患者易合并腰椎间盘退变,尤其是绝经后妇女骨质疏松症状越严重,其椎间盘退变程度也越重。这说明二者之间存在一定的内在联系或相似的发病机制,但国内外学者在雌激素、椎间盘营养、炎性因子、基因等方面的研究对其相关性得到了截然不同的结论。本研究试图在雌性山羊身上通过去势建立骨质疏松模型和椎间盘穿刺建立退变模型,并以复合模型研究二者的病理进程及推断其相关性,同时对骨质疏松山羊的骨髓间充质干细胞在椎间盘退变中可能存在的阻逆作用进行研究,为这两类疾病防治的临床与基础研究提供实验依据和新的思路。目的：构建山羊骨质疏松动物模型和椎间盘退变模型并对其进行系统全面的评价,以及探讨去势山羊骨质疏松与椎间盘退变二者的内在联系；对山羊BMSCs进行体外分离培养及生物学特性研究,并探讨骨质疏松山羊BMSCs是否存在阻逆椎间盘退变的作用。方法：18只3岁雌性山羊随机分为ABC3组,A组：假手术组,B组：行双侧卵巢切除术组(OVX Ⅰ组),C组：卵巢切除+甲强龙肌注组(OVX Ⅱ组),采用骨密度测量、Micro-CT扫描重建分析、血清钙磷及碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)检查及组织形态学观察、力学测试等方法评价山羊骨质疏松情况；将20只山羊随机分成A组：以16G针刺入8只山羊L3/4椎间盘并注入生理盐水0.1ml(实验组或造模组), B组：仅暴露8只羊的L3椎体下缘(sham组),C组(正常对照组)4只。对术前及术后1、3、6个月影像学资料、组织学及Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化等结果进行统计学分析；采用健康雌性成年山羊24只,随机分为A组：正常对照组,B：单纯去势组,C：单纯穿刺组,D：复合组(卵巢切除+椎间盘穿刺),对腰椎MRI、X线、骨密度、病理组织学及免疫组化等结果进行统计学分析；抽取山羊骨髓进行BMSCs分离培养,并进行生长曲线描绘、表面标记物及细胞周期检测、成骨细胞及成软骨细胞诱导分化；选用成年山羊15只,随机分为A组：对照组3只和B组：实验组12只,对照组共显露山羊L2/3、L3/4,L4/5、L5/6四个椎间盘,实验组每只山羊显露L2/3、L3/4,L4/5共计36个椎间盘的同时行椎间盘穿刺+髓核抽吸,穿刺椎间盘随机纳入3组,其中B1组：单纯造模组、B2组：单纯海藻酸钠凝胶移植组、B3组：骨髓间充质干细胞+藻酸盐凝胶复合移植组,术后进行MRI扫描、DR检查及病理组织学、免疫组化染色观察分析。结果：构建骨质疏松模型各检测结果显示：1.骨密度检测： C组术后6个月腰椎BMD.BMC较术前有统计学差异(分别为t-=7.756,P<0.001和t=5.194,P0.003),分别下降26.91%和22.95%；并且与A组和B组相比均有显着性降低(P<0.05),均值低于A、B两组；B组术后6、12个月的腰椎BMD.BMC均较术前和假手术组(Sham组)有显着性降低(P<0.05),分别下降了11.96%、18.09%和29.30%、25.50%；Sham组手术前后BMD.BMC的变化无显着性差异(P>0.05)。2.Micro-CT检测：Tb.N、Tb.Sp、TBPf、BV/TV、BS/BV、SMI整体比较有统计学差异(P<0.001)；OVX Ⅰ组、Ⅱ组的Tb.N、Tb.Sp、TBPf、BV/TV、BS/BV、SMI与Sham组比较,均有统计学差异(P<0.05),而Tb.Th.DA无显着差异(P>0.05)。OVX Ⅰ、Ⅱ两组间差异无统计学意义(P>0.05)。B组12个月及c组术后6个月的腰椎骨小梁较Sham组明显稀疏,骨小梁变细、发生断裂,孔隙率增加,局部有较大的空隙形成,皮质骨变薄。3.血清学检查：Ⅰ、Ⅱ组Ca、P、ALP、BGP含量较sham组各时间点差异有统计学意义(P<0.05),呈上升趋势,分别较术前增加(45.07%、40.79%、41.19%和210.01%)、(45.16%、39.32%、39.12%和194.66%),假手术组各指标术前、术后无显着差异(P>0.05)。术后6个月BC组间差异有统计学意义(P<0.05),C组高于B组；手术组自身前后对照亦有统计学意义(P<0.05)。4.腰椎组织学观察：术前各组骨小梁形态规则、数量众多、排列整齐、粗细均匀、间隙小而连接成拱形结构,很少有小梁断裂。术后去势组较术前及假手术组的骨小梁数目减少、变薄变细、甚至断裂穿孔、髓腔扩大,局部可见骨缺损。5.力学测试表明,术后叁组最大扩张压力整体差异有统计学意义(F=105.727,P<0.001)；假手术组椎体和去势组两两比较差异有统计学意义(P<0.05),且B、C组之间亦显着差异(P<0.05)。构建椎间盘退变模型结果显示：1.DR片：术后1个月A组即出现椎间隙变窄,并逐渐下降。术后1、3、6个月A、B、C各组椎间盘高度变化(%DHI)分别为85.45±2.48、68.90±4.07、56.77±4.43,94.37±2.42、94.50±1.85、93.87±2.64和95.89±2.60、94.82±1.98、95.13±2.81.对照组各时点差异无统计学意义(F=0.229,P=0.802),实验组与对照组各时点差异均有统计学意义(P<0.05)。2.MRI检查：两对照组L3/4椎间盘T2加权像始终呈高强度信号,髓核组织区域信号均匀、明亮,髓核与纤维环分界明显,椎间盘高度前后一致,即假手术组未发生椎间盘退变；而A组L3/4椎间盘髓核T2加权像信号强度逐渐降低,术后1个月椎间盘呈灰色、术后3个月呈灰黑色、术后6个月呈黑色,椎间隙逐渐狭窄。L3/4椎间盘髓核矢状位MRI T2W1信号值(灰度值)比较提示A组术前术后信号改变差异有统计学意义(P<0.05),且造模时间越长信号强度降低越明显。A组与对照组术后各时间点灰度值相比均有统计学意义(P<0.05)。3.组织学评价：肉眼观正常对照组椎间盘髓核呈白色胶冻状、含水丰富清亮饱满,纤维环结构清晰呈同心圆排列整齐；穿刺造模组椎间盘厚度有所下降,髓核颜色变灰暗、量少,纤维环结构粗糙。HE染色见正常椎间盘纤维环层次分明,与髓核界线清楚,髓核内有丰富的空泡细胞和小的类软骨样细胞,胶原蛋白排列成规则的网格状结构；退变椎间盘纤维环排列紊乱甚至断裂,髓核缩小,细胞数量减少,髓核内网格样结构消失,水分减少,髓核和纤维环界线不清。4.Ⅱ型胶原免疫组化检测：对照组以中央髓核组织染色为主,细胞外基质呈强阳性棕黄色染色；造模组术后1个月见淡黄染,且染色逐渐变淡,术后6个月基本无阳性表达。术后3个月A、B组灰度值分别为178.87±4.44、159.07+4.77；术后6个月ABC组分别为217.84±10.33、160.76±7.58、163.34±5.90。术后各时间点A与B、C组之间髓核平均灰度值均有统计学差异(P<0.05),A组术前术后自身对比均有统计学差异(P<0.05),对照各时点无统计学差异(P>0.05)。5.Ⅰ型胶原免疫组化检测：BC组纤维环外层Ⅰ型胶原呈强阳性染色,纤维环内层染色较弱,髓核中无染色,A组Ⅰ型胶原在纤维环内层及髓核阳性染色呈逐渐增强趋势。术后各时点A组与BC组之间平均灰度值有统计学差异(P<0.05),A组自身前后对照有统计学差异(P<0.05),对照组之间无统计学差异(P>0.05)。而二者相关实验结果提示：1.腰椎MRI:B组与A组术前及术后3、6个月之间无统计学意义,P>0.05；B组12月时、C组与D组术后3、6、12个月的L3/4椎间盘较A组均有退行性变化发生,P<0.05；其中D组术后6、12个月与其他组相比,椎间盘退变有统计学意义,P<0.05；术后3、6、12个月,CD组椎间盘T2WI信号值与B组比较有统计学意义,P<0.05；D组、C组自身对比,各时点信号值之间均有统计学意义,P<0.05；而B组,术后12个月T2WI信号值与术后3、6个月之间有统计学意义,P<0.05。2.腰椎X线：CD组术后3月椎间隙开始变窄并逐渐下降。术后3、6、12月C组、D组与其它组及自身前后%DHI对比,均有统计学意义,P<0.05；D组术后6、12个月与C组比较,椎间盘高度变化%DHI有统计学意义,P<0.05；B组术前及术后3、6个月时与A组间无意义,P>0.05,12月时与A组比较有统计学意义P<0.05。正常对照组0-12个月之间%DHI无统计意义P>0.05。3.骨密度检查：术后6、12个月,B组及D组BMD较术前显着性降低(P<0.05),与AC组相比均有显着性降低(P<0.05),但两组之间无显着性差异(P>0.05)；C组BMD较术前及A组无显着性降低(P>0.05)；A组之间无统计学差异(P>0.05)。4.椎体病理组织学HE染色：去势前、A组、C组的骨小梁形态较规则,排列整齐,粗细均匀,间隙较小。而BD组骨小梁数目减少、变薄变细、断裂穿孔、髓腔扩大,甚至有出血及骨缺损。5.椎间盘病理组织学HE染色：A组纤维环板层结构清晰,纤维排列整齐,髓核陷窝样结构饱满丰富,细胞数目多,髓核细胞核深染胞浆淡染；CD组纤维环板层分界模糊,纤维排列不规整,髓核陷窝样结构欠规则、减少或变小,细胞减少,基质密度低染色浅；D组极少髓核细胞,髓核缩小纤维化,退变程度重于C组。而B组有少许板层结构破坏、髓核细胞数量减少。6.Ⅱ型胶原免疫组化：AB组以中央髓核组织染色为主,细胞外基质染成棕黄色；C组淡黄染,D组基本无阳性表达。各组之间Ⅱ型胶原平均灰度值有统计学差异(P<0.05)。干细胞体外分离培养结果：1.原代细胞贴壁生长,呈短梭状或伴多个突起,核大,核仁清晰,多分裂相,逐渐转为形态均一、放射状排列。传代后多呈长梭形,增殖速度明显加快,融合成片状。2.生长曲线：P3生长曲线呈S形,第1-3天为相对滞缓期,第4-9为对数生长期,以后逐渐进入生长平台期。成骨及成软骨诱导细胞生长曲线类似。3.表面抗原标志物检测显示：CD29(76.8%)、CD44(93.6%)阳性表达,不表达CD34(4.3%)、CD45(5.9%)。4.第叁代BMSCs细胞周期检测显示：G1期细胞为68.33%,G2期细胞为21.42%,S期细胞为10.25%,即大部分细胞处于静止期。5.碱性磷酸酶染色：成骨诱导2-3周ALP染色,多数细胞胞浆呈均匀浅灰色,胞质中有棕黑色阳性颗粒,细胞界限清楚,表现为ALP染色阳性。6.茜素红染色：细胞基质中出现红褐色钙化结节,茜素红染色结果为阳性。7.HE染色：成软骨诱导14d见类软骨结节的外周细胞胞圆质少,核较小,部分细胞已失去细胞质和细胞核形成空壳,细胞外基质蓝染,呈类似透明软骨细胞样外观。8.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：可见细胞质内有呈黄色颗粒阳性细胞,阳性细胞率达70%以上.9.阿利新蓝染色：阿利新蓝染色可见大多数细胞胞质及胞外基质被染成明显的蓝色采用骨质疏松山羊干细胞治疗椎间盘退变结果显示：1.X线检查：B1组及B2组术后1月即开始出现椎间隙变窄,椎间隙高度进行性丢失。术后1、3、6月B1、B2组与A组对比,椎%DHI变化有统计学意义,P<0.05；其中B2组术后与B1组比较也有统计学意义,P<0.05；B3组在术后3、6个月与B1、B2组相比,椎间盘高度有所恢复,差异有统计学意义,P<0.05；B3组术后1个月与正常对照组比较有统计学意义,P<0.05,与B182组对比无显着性差异P>0.05；A组0-12个月各组内对比无统计意义P>0.05。2. MRI检查显示：各组术前比较无统计学意义,P>0.05；术后1、3、6月B1、B2组,与A组T2WI信号强度比较差异均有统计学意义,P<0.05,但B182组之间无显着性差异,P>0.05；B3组术后3、6月与A组比较无显着性差异,P>0.05,与B182组比较均有统计学意义,P<0.05。3.HE染色：B3组术后6个月纤维环板层结构比较清晰,纤维排列整齐、细胞数目增多,基质高密度染色较深,髓核细胞核深染胞浆淡染；而B1组术后6个月的板层分界模糊,髓核缩小,纤维排列不规整,髓核陷窝样结构欠规则、减少,细胞减少,基质密度低染色浅。4.Ⅱ型胶原免疫组化染色分析：术后1、3、6月B1组灰度值为160.13±1.66、177.44±3.24、192.69±4.24；B2组为168.93±3.76、188.81±3.47、201.29±4.85；B3为159.20±5.67、147.80±5.00、140.69±1.58；A组为136.36±3.80、135.69±2.65、134.36±3.14,术后1、3、6月时B3组与其余组之间均有统计学意义P<0.05；B2组与B1组也有统计学意义,P<0.05,且与A照组比较均有显着性差异,P<0.05；除正常对照组外,其余各组组内比较也有统计学意义,P<0.05。结论：1.采用双侧卵巢切除去势方法约1年左右可以成功构建山羊骨质疏松大动物模型,联合应用双侧卵巢切除+激素肌注+低钙饮食可以较快地建立起山羊骨质疏松动物模型。2.采用注射生理盐水的纤维环穿刺方法半年左右可以在大动物身上成功构建椎间盘退变模型。以较大号(14G)穿刺针穿刺纤维环在1年左右也能构建出山羊椎间盘退变模型,同时以纤维环穿刺+髓核抽吸方法也可构建山羊椎间盘退变大动物模。3.在骨质疏松过程中可能会不可避免地引起轻度的椎间盘退变情况的发生,在同时有椎间盘退变其它致病因素(或已经发生了椎间盘退变)情况下可加重椎间盘退变进程。但不能确定椎间盘退变是否会加重骨质疏松进展。4.经全骨髓法培养的BMSCs,可为椎间盘组织工程提供较理想的种子细胞。利用藻酸盐凝胶包封处理骨质疏松山羊的骨髓间充质干细胞并移植入山羊退变椎间盘中,可以有效抑制椎间盘的进一步退变。
吴健[6]2008年在《骨髓间充质干细胞复合可注射型纤维蛋白凝胶TGF-β1移植治疗兔椎间盘退变的实验研究》文中提出第一部分骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定目的:建立兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、扩增和鉴定的方法,了解其作为椎间盘组织工程种子细胞的可行性。方法:穿刺兔股骨大转子抽取骨髓4ml,培养、扩增、传代,倒置显微镜下观察原代和传代细胞的生长特性,流式细胞仪分析细胞表面标记物CD44、CD45。细胞经过诱导分化后进行Ⅱ型胶原免疫组化染色、阿利新蓝染色、碱性磷酸酶染色及钙结节染色。结果:体外成功建立兔骨髓间充质干细胞培养扩增的方法,并成功诱导出成骨、软骨细胞。骨髓MSCs表达CD44,不表达CD45。Ⅱ型胶原免疫组化染色,阿利新蓝染色,ALP染色及钙结节染色阳性。结论:全骨髓法能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特征,该细胞经诱导后能表现类软骨细胞的特性,是一种有效的椎间盘组织工程种子细胞。第二部分针刺抽吸法诱导椎间盘退变动物模型的建立目的:探讨针刺抽吸法建立椎间盘退变动物模型的可行性。方法:新西兰大白兔18只,用21G皮肤穿刺针从椎间隙正前方刺入L3/4、L4/5、L5/6椎间盘的纤维环,深度控制在5mm,拔出针芯,抽吸出部分髓核组织。术前及术后4、8、12周分别对造模后椎间盘及对照椎间盘(L2/3)行MRI及CR检查,并行免疫组化及组织学观察。结果:术后第4周到第12周,造模后的椎间盘MRI的T2W1信号呈现持续减弱趋势;椎间盘高度指数持续下降;免疫组化及组织学检查显示髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量较对照间盘进行性减少,细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论:针刺抽吸法可诱导兔椎间盘的缓慢退变,为研究椎间盘退行性变的机理及治疗提供有效的载体。第叁部分兔骨髓间充质干细胞在退变椎间盘环境中存活及迁移能力的实验研究目的:探讨兔骨髓间充质干细胞在退变椎间盘环境中存活及迁移能力,为进一步研究提供实验基础。方法:新西兰大白兔9只,穿刺法诱导椎间盘退变模型建立2周后每个退变椎间盘移植入BrdU标记的骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶TGF-β1复合物0.04ml,术后2、4、8周将兔处死,取L3/4,L4/5,L5/6的9个椎间盘髓核组织进行BrdU免疫组织化学染色,随机取9个L2/3髓核作为对照组,计数10个高倍视野中BrdU阳性细胞数。结果:BrdU免疫组化染色可见在2、4、8周均有阳性染色细胞,细胞数为157.11±17.45、68.56±16.89、79.78±22.11,4周及8周组间无统计学意义,P>0.05,其余各组间有统计意义,F=74.59,P<0.01。纤维蛋白移植区阳性细胞数量随时间推移逐渐减少后保持一定数量,部分细胞向髓核组织迁移,正常对照组未见阳性细胞。结论:兔骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶TGF-β1移植后能在退变椎间盘环境中存活及迁移,为椎间盘退变的组织工程学研究奠定了实验基础。第四部分骨髓间充质干细胞复合可注射型纤维蛋白凝胶TGF-β1移植治疗兔椎间盘退变的实验研究目的:探讨兔骨髓间充质干细胞移植抑制椎间盘退变的可行性,为后续的临床研究提供实验基础。方法:新西兰大白兔54只,随机分为3组:(1)退变模型组,(2)单纯纤维蛋白凝胶TGF-β1移植组(,3)骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶TGF-β1移植组,每组18只。退变模型组单纯用针刺法诱导建立退变模型,单纯纤维蛋白凝胶TGF-β1移植组及骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶TGF-β1移植组退变模型诱导两周后分别移植入纤维蛋白凝胶TGF-β1复合物及骨髓间充质干细胞纤维蛋白凝胶TGF-β1复合物,分别于术后4、8、12周(移植术后2、6、10周)行CR、MRI及病理检查。结果:椎间盘高度指数(DHI)在退变模型组及单纯支架移植组中下降明显,与时间呈正相关;正常对照组及干细胞移植组下降较缓慢。MRI结果显示退变模型组及支架移植组随时间的推移,退变逐渐加重,干细胞移植组退变不明显。免疫组化及组织学检查显示退变模型组髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量较对照间盘进行性减少,细胞凋亡率明显增加,单纯支架移植组与退变模型组相似,干细胞移植组髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原含量较退变组及单纯支架移植组明显增多,细胞凋亡率下降。结论:干细胞移植能明显抑制椎间盘退变,为进一步的研究奠定了实验基础。
程洪涛[7]2004年在《兔髓核细胞的体外培养及髓核细胞移植抑制椎间盘退变的实验研究》文中认为研究背景:椎间盘退变时慢性腰痛的一个重要病因,对此,目前尚缺乏有效的治疗手段。近来用椎间盘移植或椎间盘细胞移植来修复退变椎间盘的研究已取得较大的进步。实验证实椎间盘细胞移植可以起到抑制椎间盘退变的作用。但是由于椎间盘细胞在体外培养时增殖能力较弱,如何提供高质量和数量的椎间盘细胞仍是现阶段的研究重点。目的:通过不同的方法培养兔髓核细胞,对比在两种培养体系里生长的髓核细胞形态以及合成代谢能力的异同,探讨合适的髓核细胞培养方法。并通过经皮髓核细胞移植来观察移植的兔髓核细胞是否可以抑制髓核抽吸术后椎间盘的退变,探讨采用髓核细胞修复椎间盘的可行性。方法:采用胰酶+胶原酶联合消化法分离兔髓核细胞,分离所获细胞一部分用DMEM/F12混合培养基进行单层培养,其余的采用低速离心使其形成小球形聚集体,并在聚丙烯离心管中进行培养。在培养相同时间后,分别检测能够反映髓核细胞合成硫酸化蛋白聚糖能力的35S摄取率来比较两种培养体系里髓核细胞的合成代谢能力。并采用组织学技术比较两种培养方法所培养的髓核细胞在形态上的异同。为了评估髓核细胞在治疗椎间盘退变中潜能,我们选择PG合成能力较强的叁位小球法培养的髓核细胞,将其移植到经皮穿刺髓核抽吸术后的兔L2/L3、L3/L4和L4/L5椎间盘内,用培养液椎间盘内注射作为对照。并在手术14天后分别采用MRI和病理学检查,观察兔椎间盘的变化。结果:两种培养体系里的兔髓核细胞形态较为稳定。两种培养体系里的髓核细胞35S摄取率均随时间增加,但叁维小球法培养的髓核细胞35S摄取率高于单层培养的髓核细胞。MRI检查显示髓核抽吸组椎间盘发生T2信号降低的椎间盘多于单纯穿刺组,病理分级显示,髓核抽吸组椎间盘退变程度重于单纯髓核穿刺组,可以导致更多和程度更重兔椎间盘退变。MRI检查显示移植组发生T2信号降低椎间盘数少于对照组,病理分级结果移植组椎间盘退变程度轻于对照组组。结论:(1)叁维培养的髓核细胞蛋白聚糖的合成能力高于单层培养的髓核细胞。(2)经皮穿刺髓核抽吸术可诱发兔椎间盘退变。(3)移植髓核细胞可抑制髓核抽吸术后兔椎间盘的退变。
闫中胜[8]2012年在《组织工程纤维环—髓核双相支架的制备与性能评估》文中研究指明目的：以天然猪骨脱钙基质明胶(BMG,主要成分含Ⅰ型胶原)和软骨细胞外基质(CECM,主要成分为Ⅱ型胶原/GAG)为材料,利用仿生学原理研制新型纤维环-髓核双相支架,并探讨其作为组织工程椎间盘支架的可行性。方法：1.纤维环支架：取猪股骨近端松质骨,环钻钻取外径10mm、内径5mm、厚3mm的中空环状骨环,高压水冲洗,依次进行脱脂、脱钙、脱细胞等处理,制成中空环状脱钙骨基质明胶为材料的椎间盘纤维环支架。评估支架材料的孔径和孔隙率、吸水率,采用微型力学测试机行力学测试,采用分离培养的兔脂肪干细胞和MTT法分析支架浸提液毒性。2.纤维环-髓核双相支架：将猪关节软骨粉碎采用梯度离心法选取5μm～100μm软骨微丝,脱细胞等处理后制备成质量体积比为3.5%的悬液,将软骨浆料悬液注入中空环状脱钙骨基质纤维环支架中央冷冻冻干,采用紫外线以及化学交联剂碳化二亚胺等对支架进行交联。行组织学及扫描电镜观察,测定支架孔径和孔隙率、吸水率。将兔脂肪干细胞种植在支架上,倒置显微镜以及扫描电镜观察细胞在支架上的粘附以及生长情况。3.双相纤维环支架：取猪掌骨中央圆形区域,锯取厚5mm的皮质骨-松质骨环,冲洗、脱钙、脱细胞制成皮质骨-松质骨环双相纤维环支架。观察支架的孔径及孔隙,测定吸水率及孔隙率,用微型力学测试机行力学测试。结果：1.纤维环支架：以松质骨脱钙骨基质明胶制备的纤维环支架为乳白色的环形多孔结构,孔径大致均匀,孔隙相通。湿性状态下质地柔软。HE染色显示组织内无细胞结构残留。光镜及扫描电镜示支架孔隙均匀,支架纤维环部孔径为401.44±13.1μm,孔隙率为62.12±1.52%,吸水率为409.774±11.34%。生物力学结果示支架的弹性模量为47.75±6.32MPa。细胞增殖曲线显示不同浓度支架浸提液与对照DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.纤维环-髓核双相支架：以松质骨脱钙骨基质明胶与软骨细胞外基质构建的纤维环-髓核双相支架为淡黄白色的圆形多孔结构,孔隙相通,湿性状态下质地柔软。孔径大致均匀,纤维环部孔径大于髓核部,支架髓核部孔径为101.3±22.5μm,孔隙率为83.24±4.31%,吸水率为421.45±8.43%,支架总体弹性模量为53.45±3.21MPa。HE染色显示组织内无细胞结构残留。光镜及扫描电镜示支架孔隙均匀。倒置显微镜下细胞在支架上粘附良好。扫描电镜下细胞在支架上有良好的粘附,分布均匀,生长良好。3.纤维环双相支架：以皮质骨-松质骨环制备的的纤维环双相支架为淡黄色类圆形多孔结构,孔径、孔隙率以及吸水率比松质骨纤维环支架小,孔隙率为51.41±2.71%,吸水率为350.15±3.21%。结论：1.以松质骨脱钙骨基质明胶制备的纤维环支架具有良好的孔隙率、孔径、吸水率、生物相容性,弹性模量与纤维环在同一数量级。2.以松质骨脱钙基质明胶和软骨细胞外基质制备的纤维环-髓核双相支架具有良好的孔径、孔隙率、生物力学强度和物相容性,在基质成分上与正常椎间盘细胞外基质类似,可作为组织工程椎间盘的支架材料。3.以皮质骨-松质骨环制备的双相纤维环支架具有一定的发展前景。
李培[9]2017年在《离体椎间盘模型中压应力对髓核组织的生物效应及促退变机制的研究》文中认为背景椎间盘退行性疾病是一种人群高发性疾病,其发病机理复杂。该疾病现有的临床治疗策略主要以缓解症状为主,不能从病因上防治椎间盘退变进程。因此深入研究和认识椎间盘退变机制具有重要的科学价值,将为寻找新的椎间盘退行性疾病的防治策略提供理论依据。压应力作用是椎间盘退变进程中的重要外部病理因素,以往临床观察和基础研究表明压应力对椎间盘退变发生率和椎间盘细胞的生物学行为具有重要的调控作用。一方面,过度压应力刺激可促进椎间盘退变的发生,另一方面,特定条件的应力刺激可逆转椎间盘退变或维持椎间盘的健康状态。这正反两方面的不同效应提示压应力对椎间盘细胞可能存在“窗口”式生物学效应。此外,相关研究表明髓核细胞凋亡和衰老可能是相关病理因素导致椎间盘退变加速的重要原因。虽然已有研究表明高负荷压应力是椎间盘退变加速的重要外部病理因素,但关于高负荷压应力促进椎间盘髓核细胞凋亡和衰老的作用处于初步研究阶段,其机制有待深入阐明。离体椎间盘器官培养模型是椎间盘研究领域的新兴模型。相对于以往动物体内模型和细胞培养模型而言,它既保留了椎间盘结构的完整性,又可精确地控制应力施加条件和其他理化因素。但由于难以保证椎间盘中央髓核组织充分的营养供应和维持培养环境的稳定性,故维持髓核组织的生物活性是建立离体椎间盘器官培养模型的技术瓶颈。课题组前期自主研发了一种“智能化仿生组织培养系统”,该系统可实时反馈调控培养环境,并能施加不同参数的仿生应力刺激,为建立离体椎间盘器官培养模型提供了技术设备支持,并使压应力生物学效应的研究背景更加接近生理条件。因此,本研究在该智能化仿生组织培养系统的基础上,通过相关策略改善椎间盘中央髓核组织营养供应并优化相关培养参数,优效建立了离体椎间盘器官培养模型;然后在该模型中,通过施加不同参数的仿生压应力,观察了压应力对椎间盘髓核细胞的生物学效应“窗”;最后,深入研究了高负荷压应力促进椎间盘退变的可能途径及其机制。方法第一部分1.分离兔椎间盘,去除两端骨性终板保留软骨终板,随后将离体兔椎间盘随机分为对照组和实验组,实验组中对椎间盘进行预处理,即手术去除约1/3外层纤维环后,低浓度胰酶控制性疏松残余外层纤维环组织;对照组中椎间盘不做该处理。2.椎间盘预处理后,体外用亚甲蓝扩散实验观察两组椎间盘中溶质扩散效率,用组织形态学染色(HE)观察椎间盘软骨终板和内层纤维环的结构变化。3.将两组椎间盘置于智能化仿生组织培养系统中进行灌注培养,在第7和14天时分析两组髓核细胞活力、组织形态学变化(甲苯胺蓝和HE)、髓核细胞胞外基质代谢相关分子的基因表达、髓核组织胞外基质大分子(aggrecan和collagen II)的表达、髓核组织中生化组分(糖胺多糖GAG和羟脯氨酸HYP)含量;另外,在第14天时将两组椎间盘髓核组织生物活性与新鲜椎间盘髓核组织比较。第二部分1.按第一部分方法分离猪椎间盘并进行椎间盘培养前预处理。2.利用该智能化仿生组织培养系统,首先将猪椎间盘置于不同葡萄糖水平(低糖:1.0 g/L;普糖:2.0 g/L;高糖:4.5 g/L)、不同渗透压水平(低渗:330 m Osm/kg,等渗:430 m Osm/kg,高渗:550 m Osm/kg)和不同血清水平(5%,10%和20%)培养环境中进行灌注培养7天,通过检测髓核细胞活力、髓核细胞胞外基质代谢相关分子的基因表达和髓核组织中生化组分(GAG和HYP)含量,筛选出最能维持髓核组织生物活性的葡萄糖水平、渗透压水平和血清水平。3.将猪椎间盘在上述优化的培养环境中进一步培养14天后,与新鲜椎间盘髓核组织比较,分析髓核细胞活力、组织形态(阿利新蓝和HE染色)、髓核细胞分布、髓核组织MRI T2加权像、髓核细胞胞外基质代谢相关分子的基因表达、髓核组织胞外基质大分子(aggrecan和collagen II)的表达、髓核组织中生化组分(GAG和HYP)含量。第叁部分1.按第一和第二部分方法进行猪椎间盘分离和椎间盘培养前预处理,并建立离体猪椎间盘器官培养模型。2.利用该智能化仿生组织培养系统对灌注培养中的椎间盘进行施力刺激7天,分别观察不同仿生压应力大小(0.1 MPa、0.2 MPa、0.4 MPa、0.8 MPa和1.3 MPa,其他应力参数为:1.0 Hz的应力频率,2 h每天的应力施加时间)、不同仿生压应力频率(0.1Hz、0.5 Hz、1.0 Hz、3.0 Hz和5.0 Hz,其他应力参数为:0.4 MPa的应力大小,2 h每天的应力施加时间)和不同仿生压应力作用时间(1 h/每天、2 h/每天、4 h/每天和8 h/每天,其他应力参数为:0.4 MPa的应力大小,1.0 Hz的应力频率)对椎间盘髓核组织的生物学效应。没有进行压应力刺激的椎间盘视作对照组。3.培养结束后,分析各组中髓核细胞凋亡、组织形态学变化(阿利新蓝和HE染色)、髓核细胞胞外基质代谢相关分子的基因表达、髓核组织胞外基质大分子collagen II的蛋白表达、髓核组织中生化组分(GAG)含量。第四部分1.按第一部分方法分离大鼠椎间盘,获取中央髓核组织后,用胰酶和I型胶原酶消化法获取髓核细胞,采用双相接种的方法将髓核细胞接种至支架材料上。然后将含髓核细胞的支架材料置于该智能化仿生组织培养系统中进行灌注培养5天。同时,每天对髓核细胞施加不同负荷的压应力刺激4 h,具体分组为无应力对照组、低负荷压应力(2%压缩形变)组和高负荷压应力(20%压缩形变)组,压应力频率为1.0 Hz。同时,在高负荷压应力组中,利用通路抑制剂SB203580和清除剂NAC观察p38 MAPK通路和胞内活性氧(ROS)蓄积在高负荷压应力对髓核细胞影响中的作用。培养结束后,分析各组髓核细胞增殖情况、衰老相关β-半乳糖苷酶活性、G 1期细胞周期阻滞比例、衰老相关标志物(p16和p53)的基因和蛋白表达、端粒酶活性、胞内ROS蓄积情况、髓核细胞胞外基质代谢和p38 MAPK通路活性。2.分离大鼠椎间盘后,利用该智能化仿生组织培养系统,建立大鼠离体椎间盘器官培养模型。对离体大鼠椎间盘组织进行施力灌注培养10天,分组为:无压应力对照组、低负荷压应力(0.1 MPa)组和高负荷压应力(1.3 MPa)组,压应力施加频率为1.0 Hz,每天施加时间为4 h。培养结束后,分析各组髓核细胞衰老相关β-半乳糖苷酶活性、衰老相关标志物(p16和p53)的基因和蛋白表达、端粒酶活性、胞内ROS蓄积情况、髓核细胞胞外基质代谢和p38 MAPK通路活性。第五部分1.按第一部分分离大鼠椎间盘,获取中央髓核组织后,用胰酶和I型胶原酶消化法获取髓核细胞,采用双相接种的方法将髓核细胞接种至支架材料上。2.将含髓核细胞的支架材料置于该智能化仿生组织培养系统中进行灌注培养5天。同时,每天对髓核细胞施加不同负荷的压应力刺激4 h,具体分组为无应力对照组、低负荷压应力(2%压缩形变)组和高负荷压应力(20%压缩形变)组,压应力频率为1.0Hz。施力培养结束后,分析髓核细胞凋亡情况、Caspase 3活性、凋亡相关分子(Bcl-2,Bax,Caspase 3)的基因表达、凋亡相关分子(Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase 3)的蛋白表达、N-CDH的基因和蛋白表达,PI3K/Akt通路活性及下游GSK-3β的活性。3.将髓核细胞进行N-CDH过表达处理后接种至支架材料上,然后给予高负荷压应力刺激,并进行上述指标检测。4.高负荷压应力刺激下,用通路抑制剂LY294002抑制N-CDH过表达髓核细胞中PI3K/Akt通路活性后,再次进行上述指标检测。结果第一部分1.椎间盘器官培养前经该预处理方法处理后,内层纤维环和上下端软骨终板没有明显结构性破坏,并且溶质分子更加容易扩散至椎间盘髓核组织。2.培养周期中,与对照组椎间盘相比,实验组椎间盘髓核组织细胞活力明显增高、胞外基质大分子的基因和蛋白表达升高、胞外基质降解酶的基因表达下调、髓核组织主要胞外基质组分的含量明显升高。3.培养14天后,与新鲜椎间盘比较时,实验组中椎间盘髓核组织在细胞活力和胞外基质代谢方面更加接近新鲜椎间盘髓核组织。第二部分1.椎间盘在不同葡萄糖水平、不同渗透压水平和不同血清水平培养7天后,发现高糖(4.5 g/L)、等渗(430 m Osm/kg)和10%血清的培养条件能较好地维持椎间盘髓核组织细胞活力、胞外基质大分子及基质降解酶抑制因子的基因表达、胞外基质主要生化组分(GAG和HYP)的含量,同时这些培养条件可一定程度上降低基质降解酶的基因表达。2.与新鲜髓核组织比较,椎间盘在该优化培养环境中(高糖、等渗、10%血清)培养14天后,髓核组织在细胞活力、细胞形态及分布、组织亲水性,和胞外基质合成代谢方面仍保持较好的生物活性。第叁部分1.各压应力组间比较,在1.3 MPa组、5.0 Hz组和8 h组中,椎间盘髓核组织中细胞凋亡率明显增高,胞外基质大分子表达降低,基质降解酶的表达升高,髓核组织GAG的含量下降,髓核组织collagen II蛋白表达降低。2.与无压应力对照组比较,其他压应力大小(0.1-0.4 MPa)组、压应力频率(0.1-3.0Hz)组和压应力作用时间(1-4 h)组在髓核细胞活力、髓核组织胞外基质代谢相关分子的表达和髓核组织GAG含量上可保持相对“健康”的状态。第四部分1.髓核细胞叁维培养模型和椎间盘器官培养模型中,相对于低负荷压应力组和对照组而言,高负荷压应力可增加髓核细胞衰老相关β-半乳糖苷酶活性,抑制髓核细胞增殖活性和端粒酶活性,上调衰老相关标志物(p16和p53)的表达,降低髓核细胞胞外基质生物合成能力。同时,高负荷压应力可显着增加胞内ROS蓄积,并增加p38 MAPK通路活性。2.髓核细胞叁维培养模型中,在高负荷压应力下,加入ROS清除剂NAC后,发现衰老相关β-半乳糖苷酶活性降低,髓核细胞增殖活性和端粒酶活性增加,衰老相关标志物(p16和p53)的表达下调,髓核细胞胞外基质生物合成能力也有增强。另外,NAC可有效地减少髓核细胞胞内ROS蓄积,但NAC对p38 MAPK通路的活性无明显影响。3.髓核细胞叁维培养模型中,在高负荷压应力下,加入抑制剂SB203580抑制p38MAPK通路后,发现髓核细胞胞内ROS蓄积减少,衰老相关β-半乳糖苷酶活性和衰老相关标志物(p16和p53)的表达降低,髓核细胞增殖活性、端粒酶活性和髓核细胞胞外基质生物合成能力增加。第五部分1.相对于对照组和低负荷压应力组而言,高负荷压应力下髓核细胞凋亡率和Caspase 3活性明显增加,抗凋亡分子Bcl-2的表达降低,促凋亡分子(Bax和Caspase3/Cleaved-caspase 3)的表达增加。同时发现高负荷压应力下,N-CDH的表达和PI3K/Akt通路活性明显降低,但GSK-3β蛋白活性增强。2.高负荷压应力下,髓核细胞过表达N-CDH后,发现细胞凋亡率和Caspase 3活性降低、抗凋亡分子Bcl-2的表达升高,促凋亡分子(Bax和Caspase 3/Cleaved-caspase3)的表达下降,同时PI3K/Akt通路活性增加,但GSK-3β蛋白活性减弱。3.高负荷压应力下,LY294002抑制N-CDH过表达的髓核细胞中PI3K/Akt通路活性后,发现髓核细胞凋亡率和Caspase 3活性增加,抗凋亡分子Bcl-2的表达降低,促凋亡分子(Bax和Caspase 3/Cleaved-caspase 3)的表达增加。同时发现GSK-3β蛋白活性增强,但N-CDH的表达不受抑制剂LY294002的影响。结论1.本研究建立了一种椎间盘培养前预处理方法,该预处理方法可促进溶质分子扩散至椎间盘中央髓核髓核组织;在14天的离体椎间盘器官灌注培养周期中,该方法能保持较稳定的髓核细胞活力和胞外基质合成。2.本研究在智能化仿生组织培养系统的基础上,优化了椎间盘体外培养时的培养基条件,发现高糖(4.5 g/L)、等渗(430 m Osm/kg)和10%血清组合的优化培养条件能使椎间盘髓核组织保持与新鲜髓核组织相近的生物活性。3.本研究中证明高强度、高频率及长时间的压应力刺激均可促进离体椎间盘髓核组织中细胞凋亡并破坏胞外基质的自稳态;但一定范围的压应力大小(0.1-0.4 MPa)、压应力频率(0.1-3.0 Hz)和压应力作用时间(1-4 h)可使离体椎间盘髓核组织保持相对“健康”的生物活性。4.高负荷压应力可能通过激活p38 MAPK通路后增加胞内ROS蓄积,进而促进椎间盘髓核细胞衰老。这一机制可能是高负荷压应力加速椎间盘退变的可能途径。5.高负荷压应力可通过下调N-CDH表达降低PI3K/Akt通路活性,继而增加下游GSK-3β的活性,后者可促进髓核细胞经线粒体途径发生凋亡。这一机制可能是高负荷压应力加速椎间盘退变的另一可能途径。
徐辰[10]2017年在《间充质干细胞来源外泌体促进椎间盘退变修复的作用及机制研究》文中提出【研究背景与目的】下腰痛(Low Back Pain)及颈肩痛(Neck pain)作为现代社会最为常见的疾患之一,严重影响着人们的生活质量。流行病学调查显示大约超过80%的人,一生中有过一次或多次下腰痛或肩颈痛的经历,其中超过15%的人其严重程度需要住院治疗才能达到缓解。作为医院门诊患者就诊的常见病因之一,每年因上述症状造成的直接或间接社会经济损失巨大。目前对于引起下腰痛及颈肩痛主要的病因学研究显示,超过40%的下腰痛及20%的颈肩痛患者主要是由于他们的椎间盘退变(Intervertebral Disc Degeneration,简称IDD)及IDD所继发的一系列病变导致的。对于IDD患者而言,目前有效的治疗方法离不开外科手术对退变椎间盘的切除治疗。然而在切除退变椎间盘的同时需要植入融合器并予螺钉固定,在牺牲患者脊柱活动度的同时给患者经济上带来严重的负担。因此,寻找新的椎间盘退变治疗或椎间盘再生的方法一直是该领域的研究热点之一。随着干细胞研究领域的发展,以干细胞为主的再生医学以及生物治疗方法引起学者广泛关注。通过使用干细胞移植、组织工程移植和改变局部微环境诱导干细胞再生等创新的医疗手段的帮助下,能够达到修复受损的组织、重建病变等目的。目前研究较多的具有组织再生及修复能力的细胞中,由于间充质干细胞(MSC)的获取相对容易、分化能力强以及研究较为深入等原因使其成为应用最为广泛而可靠的种子细胞,是目前再生医学的研究热点之一。以MSC为主的再生医学治疗方式有望为椎间盘退变患者带来手术以外的另一种治疗选择。但几乎所有MSC等干细胞都存在有创采集、分离数量少、年龄依赖性强及体外扩增能力有限等缺点极大限制其临床应用。作为能够起到治疗作用的多能干细胞,其在人体内正常新陈代谢的过程中其数量会不断减少、修复能力不断减弱。其次,由于其数量稀少,在采集与体外扩增时常会混入非干细胞的成体细胞,最终在体外扩增及治疗中影响干细胞的纯度以及疗效。再者,以MSC为主的成体多能干细胞,其在体外扩增的过程中亦会不断发生细胞衰老(Senescence),并在此过程中丧失其多向分化潜能。而在椎间盘退变方面,由于髓核的结构特殊使得其内环境处于低氧且营养物质匮乏的状态,传统的MSC移植后成活效率较低。此外,由于髓核体积小、周围有坚固的纤维环包裹、含水量多等特点,使其仅可容纳少量的MSC进入髓核,极大限制了其治疗的效果。综上所述,对于椎间盘退变的再生医学治疗而言,迫切需要寻找一种易获取、形状稳定、免疫原性低、修复效果好的干细胞替代物来弥补上述的不足。为了寻找合适的干细胞替代物,学者们从干细胞修复受损组织或促进组织再生的机理方面进行了深入的研究,并发现MSC不仅通过自身增殖分化替代受损组织,更可以通过旁分泌重要的微环境调控物质——外泌体(Exosomes)来改变受损组织周围微环境,从而调控细胞增殖、分化、凋亡等生物学功能,间接实现修复治疗作用。外泌体(Exosomes)是细胞通过出芽方式分泌的纳米级(40-120nm)双层膜结构的囊性小泡。由于其具有如同细胞膜般的双层磷脂膜结构,因此具有良好的渗透性与稳定性,能够与靶细胞进行融合;其内富含细胞来源的m RNA、mi RNA以及蛋白质成分,且上述成分能够在参入靶细胞后对靶细胞的功能及信号起到重要的调控作用;由于近乎所有细胞均会分析外泌体,而不同细胞来源外泌体内成分差异较大,因此其被认为是重要的局部微环境调控介质,同时也是干细胞对诸多脏器修复起作用的重要成分。目前已有许多文献报道MSC来源外泌体具有与MSC相似的功能,如其能够对损伤的组织进行修复、抑制炎症反应、调节免疫反应等。与单纯MSC应用相比,MSC外泌体具有诸多的应用优势,如性质稳定、易于保存、没有免疫原性、获取容易且方便改造等诸多优势,为多种疾病的治疗提供了新的手段。而具有上述特点的MSC来源外泌体可能成为弥补传统MSC治疗方法在椎间盘退变修复中的不足的理想替代物。课题组在前期研究中已经发现MSC来源外泌体能够显着促进髓核细胞ECM的合成。作为髓核ECM重要合成酶,CHSY同时参与多种疾病的发生发展过程中。CHSY的功能异常会导致硫酸软骨素(CS)的合成减少,其与IDD的发生亦密切相关。基于上述内容,我们推测MSC来源的外泌体可能通过激活髓核细胞ECM合成相关酶CHSY的表达来促进椎间盘的修复。第一部分:间充质干细胞外泌体的分离与鉴定方法:(1)将将冲洗下来的液体制成单细胞悬液,经过商品化Percoll密度梯度离心剂离心分离和收集有核细胞,再利用含15%胎牛血清的DMEN培养基重悬管中细胞进行骨髓间充质干细胞进行原代培养。(2)利用流式细胞仪器检测CD105,CD34,CD44,CD14,CD90,CD45,CD19等间充质干细胞表面标志物的表达;利用商品化成骨、成脂分化诱导培养基对细胞进行诱导鉴定。(3)将二代后的MSC细胞于T75以上培养瓶中进行扩增。待细胞达到90%融合度时更换低血清培养基,通过每两天一次收集培养基的方式进行连续收集,利用超速离心机对收集的上清液进行外泌体体离心纯化。(4)通过SDS-PAGE电泳及Western-Blot检测外泌体中特定的蛋白表达情况。通过透射电镜或Nanosight可以分析外泌体的大小、形态。(5)利用PKH67实验明确外泌体的融合能力。结果:(1)通过8例骨髓收集,成功进行骨髓来源MSC原代培养7例,均状态良好。(2)流式细胞学检测MSC标志物CD105,CD34,CD44,CD14,CD90,CD45,CD19示原代培养MSC符合国际界定MSC指标。成骨及成脂诱导后,原代培养MSC显示出明显的钙结节及脂肪滴。(3)通过大量培养MSC并收集上清进行超速离心,获得明显的沉淀并进行再次离心纯化。(4)通过Western Blot检测发现收集得到的沉淀物表达外泌体特异性CD81及CD63,Nanosight及电镜检测均显示收集得到的沉淀为外泌体。(5)利用PKH67染料染色外泌体并加入至MSC中,结果显示MSC能够被外泌体染色,提示收集得到的外泌体具有膜融合能力。结论:我们通过骨髓MSC细胞的原代培养获得了符合国际标准的骨髓MSC细胞。对原代MSC细胞进行扩增及上清的收集后,利用超速离心的方法能够得到较为纯的外泌体。同时利用外泌体标记物及功能实验明确收集得到的确为外泌体。第二部分:间充质干细胞来源外泌体对退变椎间盘的影响方法:(1)收集30-50年龄段的正常髓核组织进行原代培养。(2)利用超速离心后的上清液作为去外泌体上清作组,即对照组;利用未培养过细胞的原始培养基通过超速离心作为空白对照组;利用HEK293细胞的培养上清进行外泌体的分离,得到的外泌体作为阴性对照组;而MSC来源外泌体作为实验组处理原代髓核细胞。(3)通过加入蛋白定量后不同浓度的上述样品至髓核细胞,培养24h后通过PCR、Western Blot以检测处理后髓核细胞细胞外基质分泌表达情况。(4)通过加入定量后不同浓度的上述分组样品至髓核细胞,培养24h后通过PCR、Western Blot检测处理后髓核细胞ECM降解相关MMP、ADAMTS的表达情况。(5)同上处理后通过PCR、Western Blot检测处理后髓核细胞ECM合成相关CHSY等酶的表达情况。结果:(1)通过原代培养髓核组织,成功建立体外髓核细胞系6株。(2)成功收集MSC培养上清分离得到的外泌体、去外泌体上清、原始培养基以及HEK293来源外泌体。(3)分组处理后实验组髓核细胞其2型胶原、蛋白聚糖表达量均高于对照组及阴性对照组。(4)分组处理后实验组髓核细胞MMP1、MMP2、MMP7表达较对照组及阴性对照组出现显着下调。(5)分组处理后实验组髓核细胞CHSY1、CHSY2、CHSY3表达较对照组及阴性对照组出现显着上调。结论:通过原代培养髓核组织获得正常人髓核细胞株5株。通过BCA法对分组样品进行定量,定量后处理细胞发现MSC来源外泌体具有上调髓核细胞ECM合成酶以及ECM合成的作用,并降低ECM降解酶的表达。第叁部分:MSC外泌体通过上调CHSY保护椎间盘髓核细胞方法:(1)利用高通量RNA测序技术检测外泌体处理后髓核细胞的转录组表达变化。(2)生物信息学分析MSC来源外泌体促进髓核细胞ECM合成酶的机制。(3)利用高通量测序技术检测外泌体中的micro RNA分子,并筛选与CHSY结合的椎间盘退变相关mi RNA并通过双荧光素酶报告基因实验验证。(4)过表达预测的候选mi RNA,研究其对CHSY以及髓核细胞ECM分泌的变化。(5)双荧光素酶实验明确外泌体内micro RNA对CHSY的靶向机制。结果:(1)利用高通量转录组测序技术发现MSC外泌体处理后髓核细胞转录组水平基因表达与对照组相比存在显着差异。(2)利用GO分析发现MSC外泌体能够显着影响髓核细胞转录后调控因子的改变,提示外泌体促进CHSY的表达可能与转录后调控有关。(3)利用高通量mi RNA测序技术发现MSC来源外泌体较对照及HEK293外泌体具有较高的micro RNA表达。(4)靶基因预测分析发现MSC外泌体内含有能够显着抑制CHSY负向调控因子,IL-1以及TNF-α通路下游因子NF-κB的mi RNA。(5)靶向实验验证了MSC外泌体中的候选mi RNA能够直接抑制NF-κB的表达,从而促进CHSY降低MMP的表达。结论:利用高通量检测联合生物信息学分析,我们发现了MSC来源外泌体能够显着提高髓核细胞转路后调控因子的表达,意味着mi RNA等转录后调控因子与外泌体促进IDD中ECM合成密切相关。利用高通量mi RNA组分析MSC来源外泌体并结合生物信息学预测技术,我们发现了一批CHSY抑制性NF-κB的靶向性mi RNA,并利用相应实验对其进行了验证。小结本研究通过探究MSC来源外泌体对髓核细胞的作用,利用高通量转录组及mi RNA组学分析手段,首次发现了髓核细胞退变引起的ECM合成酶的降低主要是通过IL/TNF等促炎因子诱导的CHSY靶向性mi RNA引起的。我们发现了mi R-194、mi R-515在IDD中发现显着上调,而通过功能学验证明确了上述mi RNA确实能够引起CHSY表达的变化,而且上述mi RNA还直接受到IL/TNF的调控。通过上述研究启发了关于CHSY的调控机制。在MSC外泌体提高CHSY表达的发现基础上,我们进一步针对外泌体中富含的mi RNA成分进行深入研究分析,发现在MSC外泌体中高表达的mi RNA中mi R-199、-16、-195能够结合NFκB,而NFκB作为IL/TNF的重要上游调控元件,对椎间盘退变以及ECM合成的减少具有至关重要的作用。后续研究进一步证实了外泌体能够通过传递mi R-199、-16、-195影响髓核细胞IL/TNF的生成,从而减少CHSY表达的降低促进椎间盘退变的恢复。
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