关志炜[1]2007年在《枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶的研究》文中提出纳豆激酶(nattokinase,NK)是日本传统发酵食品纳豆在发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtils natto)产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。研究结果表明,纳豆激酶不但有很强的溶栓功能,且还有安全性能好,易被人体吸收,作用迅速,药效时间长,可由微生物直接发酵生产因而造价低廉等优点。本研究利用目标菌所具有的耐热性及显著的纤溶活性等生物学特性设计选育方案,从国内外的纳豆产品中分离出了1株纳豆激酶高产菌株—NT-6,并以此为出发菌株,通过盐酸羟胺和紫外线复合诱变处理,利福平抗性平板筛选和发酵筛选相结合的方法,获得了一株突变株—NU9012,其产酶能力比诱变前提高了68%,在未经优化的摇瓶发酵条件下,纳豆激酶的酶活力达到了648IU/mL。在单因素实验和正交试验的基础上,先用Plackett-Burman(PB)方法对影响菌株NU9012液体发酵诸因素的效应进行评价,并筛选出了有显著正效应的木糖浓度和显著负效应的接种量及K2HPO4浓度这3个因素,利用响应面分析法(RSM)确定了它们的最佳工艺参数。实验结果表明,菌株NU9012发酵产NK的最佳培养基组成为:木糖1.88%,胰蛋白胨2.0%,CaCl2 0.03%、MgSO4 0.05%、K2HPO4 0.21%和KH2PO4 0.1%,培养基初始pH值为7.0;最佳的发酵条件为:种龄18h,接种量3.51%,温度30±1℃,装液量100mL/250mL,发酵周期为3d。
谢秋玲[2]1999年在《纳豆激酶液体发酵的条件优化及其调控的研究》文中进行了进一步梳理纳豆激酶(Nattokinase,简称NK)是从日本传统食品纳豆中提取出来的具有溶血栓作用的一种酶。因其与链激酶、尿激酶等溶血栓药物具有同样的功能，故最初被命名为纳豆激酶。但从其性质和结构来看，应属于蛋白酶类。比之现用于临床的溶血栓药物，NK具有安全性好、易被人体吸收、作用直接迅速、作用持续时间长、可由细菌发酵生产因而造价低廉等优点，是一种很有潜力的新型溶血栓药物。 本论文在液体发酵生产NK方面进行了研究。得出如下结果： 首先从纳豆中分离到一株能产NK的菌，经鉴定属于芽孢杆菌属(Bacillus)，可能是纳豆菌(Bacillus subtilis natto)。该菌种所产的NK是一种胞外酶。 液体发酵条件经优化得出：最优氮源是大豆蛋白胨，3％的氮源利于细菌生长，2％的氮源利于产酶；最利于产酶的碳源是木糖，而葡萄糖更利于细菌生长，木糖浓度高会抑制细菌生长，浓度为2％时，产酶量最高；碳、氮比以1：1为合适；离子中以Ca~(2+)的影响最大，以0.02％为最佳浓度，由于大豆蛋白胨中Mg~(2+)含量丰富，Mg~(2+)的是否添加影响不大，磷酸盐以NaHPO_40.2％：NaH_2PO_40.1％为最优，Mn~(2+)抑制酶的合成；表面活性剂的添加可以促进酶的分泌，添加量与添加时间十分重要，几种活性剂中以0.1％油酸钠的效果最好。细菌在40℃时生长最为迅速，细胞量最大，但对产酶来讲，35℃为最佳温度，故选择35℃作为发酵温度；pH7是细菌生长和产酶的最适pH；该菌种是好氧菌，装液量小利于细菌生长和产酶，但装液量过小，水分挥发过快，不利于NK总产量的提高，故选择20mL／100mL；接种量以2％为最佳，种子种龄为24h。 在以上优化的条件下液体发酵产酶，获得的产酶量为1356IU／mL，是最初产酶量的3倍；从所查资料来看，仅黑龙江应用微生物所进行了液体发酵生产NK的工作，他们的产量为200IU／mL。 用木糖和葡萄糖作为混合碳源，该菌种没有二次生长现象，培养基中两种糖的消耗与单一碳源时的消耗趋势相同，因此可知葡萄糖不抑制木糖的吸收；从酶的产量来看，也不存在葡萄糖代谢阻遏现象。从大豆酸沉淀蛋白及其上清液对酶合成的刺激作用，及大豆蛋白胨与胰蛋白胨产酶的比较，可推断大豆蛋白水解后
徐慧[3]2013年在《富硒纳豆激酶的制备及特性研究》文中指出富硒纳豆激酶(SNK)是一种含硒蛋白酶，在纳豆菌发酵产酶的过程中将硒与纳豆激酶结合得到。硒具有极强的抗氧化活性，能够清除自由基，而自由基正是引起血栓形成的重要原因，因此硒具有防止血栓形成的功效。纳豆激酶(NK)是一种新型溶栓剂，具有很强的纤溶活性，能够直接作用于纤维蛋白，也能激活纤溶酶原，具有安全性好、成本低、溶栓效果好、可口服、作用时间长等优点。因此，富硒纳豆激酶兼具硒和纳豆激酶的特性，在防止血栓形成和溶解血栓上具有双重作用，对血栓类疾病有很好的疗效，具有研究和开发的前景。目前，市场上已有富硒纳豆产品销售，其功能性成分即为富硒纳豆激酶，但相关科学研究较少，缺乏对其系统、全面、深入的了解。因此，本课题从富硒纳豆激酶的发酵制备出发，对其进行分离纯化，并考察其酶学特性和抗氧化性等，为后续的深入研究提供基础。本研究首先筛选出一株耐硒性较好的纳豆菌株，优化其液体发酵制备富硒纳豆激酶的培养基组成和培养条件，得到最优培养基组成为：大豆蛋白胨2.5%，葡萄糖2%，Na2SeO310-6mol/L，MgSO40.05%，CaCl20.02%，K2HPO4/KH2PO40.2%/0.1%；最优培养条件为：培养基pH7.0，培养温度37℃，接种量2%，培养时间60h。通过此方法制得的富硒纳豆激酶的酶活(Folin-酚法)最高可达196.81U/mL。运用传统的蛋白分离纯化方法纯化富硒纳豆激酶，具体流程为：硫酸铵分级盐析(30%-70%)-Sephadex G-50凝胶层析-QAE-Sephadex A-50离子交换层析，经此方法纯化得到的富硒纳豆激酶经SDS-PAGE电泳鉴定为单一电泳条带。该纯化方案的纯化倍数为13.09，回收率为25.07%，最终酶的比活为289.58U/mg。测定纯化后富硒纳豆激酶的SDS-PAGE凝胶条带的硒含量为0.060μg/g，远高于同等条件下的不含硒的纳豆激酶的0.013μg/g，证明纳豆菌可通过发酵实现无机硒到有机硒的生物转化，并与纳豆激酶结合，制得了富硒纳豆激酶。酶学特性研究发现，富硒纳豆激酶的最适反应温度为45℃，在4℃、25℃和37℃条件下保存较稳定，当温度超过50℃时，活力损失较快；最适反应pH为8.0，在pH7.0-10.0范围内较稳定；金属离子Mg2+和Ca2+对酶活具有促进作用，Na~+、K~+、Ba~(2+)无明显作用，Mn~(2+)、Co~(2+)、Al~(3+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Ag~+均具有一定的抑制作用，且Pb2+和Ag~+的抑制作用较强。0.1mmol/L的PMSF即可完全抑制酶的活性，10mmol/L的SDS可抑制其46.91%的活性，EDTA和DTT无影响，证明此酶为丝氨酸蛋白酶，非金属蛋白酶，且其结构中不含二硫键。抗氧化性研究发现，富硒纳豆激酶在各项抗氧化指标上均较同等情况下制得的纳豆激酶有所提升，说明富硒纳豆激酶发挥了硒的特性，在抗氧化能力上得到了提升，对防止血栓的形成有一定的效果。本研究通过液体发酵成功制得富硒纳豆激酶，并对纯化后的酶进行酶学特性和抗氧化性的研究，对富硒纳豆激酶有了更深入、全面的认识，为今后的深入研究提供理论基础。
余功保[4]2007年在《高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学性质的研究》文中研究指明纳豆激酶(Nattokinase，NK)是日本传统发酵食品纳豆在发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。研究表明，NK具有很强的溶解血栓功能，与目前临床所用的尿激酶、链激酶等溶栓药物相比，NK具有安全性好，易被人体吸收，作用直接迅速，药效持续时间长，可由纳豆枯草芽孢杆菌直接发酵生产因而造价低廉等优点。因此许多学者预言，NK将是一种很有潜力的新型溶栓药物。本论文通过对原始菌株进行紫外诱变、纤维蛋白平板初筛、摇瓶发酵复筛的方法筛选出一株高产NK的纳豆枯草芽孢杆菌BSN-3菌株，并对BSN-3菌株所产NK的分离纯化及理化性质等展开了系列研究。通过计算紫外照射芽孢的致死率，确定诱变时间为4min。通过纤维蛋白平板筛选和酪蛋白平板筛选结果的比较，发现酪蛋白平板筛选结果并不可靠。通过单因素实验和正交实验研究了液体发酵产NK的最佳条件。结果表明优化培养基组成为：胰蛋白胨6g／L，木糖30g／L，K_2HPO_4·3H_2O 1g／L，MgSO_4·7H_2O0.2g／L。适宜培养温度为30℃，pH8.0，培养时间72h。在优化条件下，用纤维蛋白平板法测得BSN-3菌株的酶活为1120IU／mL。通过研究BSN-3菌株的生长曲线和产NK时间的关系，研究了BSN-3菌株产NK的产酶动力学，结果表明：NK的合成类型是滞后合成型。BSN-3菌株发酵液4800r／min离心10min，上清液用45％的硫酸铵盐析沉淀部分杂蛋白，离心后，上清液用50％的硫酸铵盐析沉淀NK，再用CM-52层析，得到电泳纯的NK。NK的总收率为39％，提纯倍数为10.3。选用纤维蛋白平板法作为检测NK溶纤活性的方法，进行了一系列的理化性质测定，结果表明：NK水溶液在50℃以下对温度不敏感，可以常温保存。该酶在pH3.0～11.0范围内稳定。不同的金属离子对NK酶活的影响不同，Zn~(2+)和Hg~(2+)会抑制酶活。低浓度的Cu~(2+)不影响酶活，高浓度的Cu~(2+)会抑制酶活。不同物质对NK的热稳定性作用不同，其中3‰的明胶对酶的保护作用最好。以上研究结果，可以为NK的生产，为该酶的保藏、运输等提供科学的依据，使NK能尽早开发为溶栓药物。
黎婉园[5]2011年在《纳豆激酶液体发酵的研究》文中研究说明纳豆激酶(Nattokinase,NK)是由纳豆菌发酵大豆产生的蛋白酶。我国研究人员在纳豆激酶高产菌株的筛选、发酵条件的优化、纳豆激酶的纯化及其酶学性质等方面均进行了研究,并取得一定进展,但从目前的研究情况来看,纳豆激酶的产量仍不高,难以满足需要。本研究以实现纳豆菌液体发酵为目的,取得高产量的纳豆激酶。经紫外诱变处理得到菌株ZN-200815,实验证实ZN-200815不仅发酵液单位酶活力高,而且稳定性好,故选取ZN-200815作为生产菌种,其发酵液单位酶活力为1783u/mL。进行了纳豆激酶发酵生产条件100升罐发酵扩大试验,优选出发酵培养基和最佳发酵条件;在500升发酵罐上进行培养基和培养条件的进一步优化,提高了纳豆激酶的表达量,同时降低了生产成本;对液体发酵纳豆激酶的发酵过程进行调节控制:为了提高纳豆激酶的表达量,根据菌株生长速度的快慢,适当控制其接种量和接种时间。改善温度、pH、供气量及拌搅转速发酵条件等,对诱导剂条件改进,使菌体生长与纳豆激酶表达的诱导相调协。100L和500L中试的发酵液的纳豆激酶酶活力在1926～2417U/mL,平均值分别为2242 U/mL、2238.7U/mL,500L罐的表达效率比50升罐提高了18.7%,分泌到胞外的比率提高15.2%。进行了纳豆激酶分离纯化小试和扩大试验,纯化后的纳豆激酶纯度为92.9%。进行了纳豆激酶冻干粉剂的研制,研究出一套纳豆激酶冷冻干燥工艺。进行了纳豆激酶酶学性质的研究,包括温度、pH、离子及EDTA等对纳豆激酶活性的影响和纳豆激酶的保存稳定性试验。
赵静[6]2008年在《蚕蛹深加工研究》文中研究表明本论文以蚕蛹（Silkworm pupae）为原料进行了三方面研究：以蚕蛹为培养基主要成分，以实验室保存的纳豆菌JN-14为出发菌株，采用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶酶活，对纳豆菌固体、液体发酵生产纳豆激酶(nattokinase, NK)的条件进行了研究，对发酵产品进行冷冻干燥，测定发酵产品及冻干粉的成分；对蚕蛹酶解物的抗高血压活性进行了初步研究，以Alcalase碱性内切蛋白酶等六种蛋白酶酶解蚕蛹，以体外ACE抑制活性为指标，对酶解条件进行优化，筛选出体外体外ACE抑制活性最高的蛋白酶。研究复合酶解物体外体外ACE抑制活性。通过动物实验，研究酶解物体内降血压活性。研究结果表明：固体发酵最佳培养条件为：蚕蛹在121℃高压蒸煮20min，培养基含水量20%，物料厚度1cm，葡萄糖0.6%，明胶1%，接菌量3%，37℃恒温发酵24h。纳豆菌在此条件下培养，产纳豆激酶活力为2147.08IU/g。发酵产品主要成分含量：粗蛋白质65.28%，可溶性蛋白质16.85%，总糖9.03%，多糖4.02%。固体发酵冻干粉活力为26563.80IU/g，主要成分含量：粗蛋白85.96%，可溶性蛋白27.12%，总糖16.38%，多糖7.14%。纳豆菌液体最佳培养条件为：蚕蛹0.9%，葡萄糖1%，明胶0.5%，NaCl0.5%，K_2HPO_40.3%，KH_2PO_40.1%，MgSO_40.05%，初始pH7.0；最佳培养条件为：装液量20mL，接菌量2%，摇床转速150r/min，培养温度37℃，培养时间48h。纳豆菌在此条件下培养，产纳豆激酶活力相当于尿激酶1559.08IU/mL。发酵液主要成分含量：粗蛋白质32.08mg/mL，可溶性蛋白质12.21mg/mL，总糖5.23%，多糖2.01%。液体发酵冻干粉活力为43270.13IU/g，主要成分含量：粗蛋白74.04%，可溶性蛋白24.26%，总糖21.71%，多糖14.43%。在所选的六种蛋白酶中，Alcalase碱性内切蛋白酶酶解物的体外ACE抑制活性最高，其最佳酶解条件为：底物浓度15%，加酶量750U/g蛋白质，温度55℃，pH7.0，酶解时间4h，该条件下获得的酶解物体外ACE抑制活性为89.50%。单酶酶解产物的体外ACE抑制活性强于复合酶解物的体外ACE抑制活性。动物实验结果表明：蚕蛹的Alcalase碱性内切蛋白酶酶解物体内降血压活性最强。
高宏[7]2006年在《枯草芽孢杆菌纤溶酶高产菌株选育、发酵条件优化及其分离纯化》文中提出血栓栓塞性疾病是当前致死率高的病因之一，而溶栓疗法是治疗这类疾病的重要手段；纤溶酶可催化血栓的主要基质纤维蛋白水解从而化解血栓，因此纤溶酶作为血栓的特效治疗药剂而成为研究焦点。微生物是纤溶活性酶类的重要来源，日本学者从纳豆中发现纳豆激酶具有良好的纤溶活性；我国和韩国学者则从枯草芽孢杆菌发酵液中分离出相应的血栓溶解酶。由于野生型菌株产酶能力低，本文对一株枯草芽孢杆菌纤溶酶产生菌Bacillus subtilis XZ3④进行N~+离子注入诱变，获得了高产菌株Bacillus subtilis XZI125，并对该菌的发酵条件进行优化，同时研究了枯草芽孢杆菌纤溶酶的分离纯化，旨在为枯草芽孢杆菌纤溶酶的开发应用提供直接理论依据。主要结论如下：1．以能量20 KeV，入射剂量为30×2.6×10~(13) ion／cm~2～200×2.6×10~(13) ion／cm~2的N~+注入枯草芽孢杆菌纤溶酶产生菌B. subtilis XZ3④进行诱变育种，其存活率曲线为典型的“马鞍型”，即随着注入剂量的增加存活率呈现先降后升再降的趋势；筛选284株诱变菌，得到一株稳定的高产枯草芽孢杆菌纤溶酶的菌株B. subtilis XZI125，枯草芽孢杆菌纤溶酶酶活比原始菌株提高了160％，达到1230.45 u·ml~(-1)。2．采用Plackett-Burman设计法，从26个因素中筛选出了影响B. subtilis XZI125液体发酵产枯草芽孢杆菌纤溶酶的9个主要影响因子：麸皮、甘油、硫酸铵、豆粕、植酸、二甲亚砜、发酵温度、发酵时间和装液量。3．在Plackett-Burman实验基础上，通过中心旋转组合设计(Central Composite Rotatable Design，CCRD)法建立了枯草芽孢杆菌纤溶酶酶活对发酵培养基6个关键组份的二次多项数学模型，并利用统计学方法以及后续试验对该模型进行了显著性检验和有效性验证。借助模型方程的响应面图及其等高线图，对关键影响因素间的交互作用进行了深入的研究与探讨，分析得出了各关键营养要素的合适浓度水平范围。对枯草芽孢杆菌纤溶酶模型方程解逆矩阵求得：即在麸皮1.70％、甘油1.30％、硫酸铵0.07％、豆粕3.94％、植酸282.64ppm、二甲亚砜5.84ppm时，获得的枯草芽孢杆菌纤溶酶酶活最大预测值为2382.00 u·ml~(-1)，此预测可信度不仅被统计分析所验证，也被实践所证实。4．在Plackett-Burman和CCRD实验基础上，采用Box-Behnken统计学实验设计方法对影响B. aubtilis XZI125液体发酵产枯草芽孢杆菌纤溶酶的3个关键外界影响因素发酵温度、发酵时间和装液量的最佳水平范围及其交互作用进行了研究与探讨。通过对模型方程3D图及其等高线图的研究，发现在发酵温度31.58℃、发酵时间48.54h、装液量53.81ml的工艺条件下，获得的枯草芽孢杆菌纤溶酶酶活最大预测值可达2665.16 u·ml~(-1)。5．在摇瓶液体发酵实验结果的基础上，于100L发酵罐中初步探索了溶解氧和pH对B. subtilis XZI125分批液体发酵产枯草芽孢杆菌纤溶酶的影响。结果表明：在通气量控制在1.0vvm的前提下，当恒定搅拌转速250rpm，恒定发酵液pH7.0时，下罐发酵粗酶液达到了2876.94 u·ml~(-1)，比摇瓶液体发酵提高了211.78 u·ml~(-1)。6．N~+离子诱变筛选所得的酶活高产菌B. subtilis XZI125的发酵液经微滤(0.1μm无机陶瓷膜)，超滤(中空纤维膜UPIS-503、UEOS-503)和HZD-2弱酸性阳离子交换层析分离纯化出一种电泳纯的枯草芽孢杆菌纤溶酶，其比活力为4291.03 u·mg~(-1)，纯化倍数为18.34，回收率为24.58％，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得相对分子量为27.7KDa。
薛健[8]2005年在《纳豆激酶液体发酵的优化和分离纯化及酶学性质的研究》文中认为纳豆激酶(Nattokinase NK)是纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilsnatto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。最初是从日本传统发酵食品纳豆(Natto)中提取到的,1987年由日本学者须见洋行首先发现。随着生活水平的提高,心血管疾病对人类生命和健康的威胁日益严重,治疗心血管疾病的药物的开发也随之受到人们的重视。现在用于临床的溶血栓药物各有其优缺点,因此研究开发新型的、安全性好、成本低廉的口服性药物是十分必要的。目前的研究表明,纳豆激酶具有很强的溶解血栓功能,与临床所用的尿激酶、链激酶等溶栓药物相比,它具有安全性好,易被人体吸收,作用直接迅速,药效持续时间长,可由纳豆枯草杆菌直接发酵生产因而造价低廉等优点,因此,纳豆激酶将是一种很有潜力的新型溶栓药物,并且还以可开发成为多种保健品和功能性食品。 本论文对纳豆激酶液态发酵优化、分离纯化以及酶学特性等几个方面进行了系统的研究,最终得出以下结果: 1.从实验室保藏的九株产纳豆激酶菌株中,粗选出一株高产菌株,采用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶酶活,从培养基组成和发酵条件两方面优化了纳豆激酶的液体发酵。研究表明,液体发酵培养基的最佳碳源为木糖,浓度为1.5%;最佳氮源为大豆蛋白胨,浓度为2.0%;添加无机盐组分为MgSO_40.05%、CaCl_20.02%、K_2HPO_4/KH_2PO_40.1%/0.1%;发酵培养的最佳温度为37℃;在pH7.0时有利于菌体产酶;装液量为100ml/250ml即能满足菌对氧的需求,又不影响其产酶;接种量以2%为最佳;最适种龄为18h;发酵周期为3天。经过以上系统优化后,进行发酵罐放大试验,在发酵60小时时的酶活达到最高,为1217IU/ml,与摇瓶发酵比较,发酵产酶时间有所提前。 2.采用硫酸铵分级沉淀法纯化纳豆激酶,硫酸铵饱和度为70%。然后透析除盐,再通过SephadexG-200柱层析等步骤,最终分离的纳豆激酶酶液经过SDS-PAGE电泳检测为单一区带。其纯化倍数为11.34倍,收得率为37.10%,最终比酶活为3543.41IU/mg。 3.通过对纳豆激酶的酶学性质的初步研究,表明纳豆激酶作用的最适pH值为pH7.0-8.0,最适温度为45-55℃。
刘诚[9]2000年在《纳豆激酶液体发酵条件及其酶学稳定性研究》文中研究指明纳豆激酶（Nattokinase，简称NK）是一种丝氨酸蛋白激酶，最初是从日本传统发酵食品纳豆（Natto）中提取得到的，纳豆激酶具有与链激酶、尿激酶等溶血栓药物同样的溶解血栓作用，比之现用于临床的溶血栓药物，NK具有安全性好，易被人体吸收，作用直接迅速，作用持续时间长，可由微生物发酵生产因而造价低廉等优点，是一种很有潜力的新型溶血栓药物。 本论文在液体发酵生产NK方面进行了研究，得出如下结果： 1．从实验室保存的产纳豆激酶菌种出发，优化液体发酵条件得出：最佳氮源是豆粕粉，最佳碳源玉米粉，碳氮比以1∶1为合适，离子中以Ca~(2+)的影响最大，以0.02％为最佳浓度，Mg~(2+)的是否添加影响不大，磷酸盐以Na_2HP_4 0.2％∶NaH_2PO_4 0.1％为最优，Mn~(2+)抑制酶的合成，表面活性剂的添加不影响酶的分泌。细菌在37℃时生长最为迅速，细胞量最大，但对产酶来讲，30℃为最佳温度，故选择30℃作为发酵温度，pH7是细菌生长和产酶的最适pH；该菌种是好氧菌，装液量小利于细菌生长和产酶，但装液量过小，水分挥发过快，不利于NK总产量的提高，故选择100ml/500ml。接种量以2％为最佳，最适种龄为24h。 在以上优化的条件下液体发酵产酶，获得的产酶量为1280IU/ml，是最初产酶量的3倍。 2．NK的最适反应温度为45℃～50℃，酶的稳定性在25℃和37℃时较好，25℃下放置24h残存酶活力为95％，37℃下放置24h残存酶活为78％，55℃以上酶活迅速消失；最适反应pH为7.0～7.5，在pH7～8范围内酶活最为稳定，Hg~(2+)可导致酶的迅速失活，Mg~(2+)对酶有激活作用；牛血清蛋白、甘油、丙二醇、海藻酸钠、蛋白胨，明胶都能提高酶的稳定性，以酪蛋白为底物时的Vm=7.76μg/ml min，Km=10.87×10~3μg/ml。
李小丽[10]2009年在《纳豆芽孢杆菌分离及纳豆激酶活性的研究》文中提出纳豆是日本的一种传统食品,具有很高的营养价值,其主要的活性成分——纳豆激酶具有显著的溶解血栓的功能。纳豆激酶作为一种新型的溶栓药物,与目前临床上常用的治疗血栓的药物链激酶、尿激酶比较,克服副作用大、体内半衰期比较短、价格昂贵等局限性,具有安全性高、可口服、溶栓效率高、药效时间长等突出优点,具有广阔的开发应用前景。本文主要是对筛选出的纳豆芽孢杆菌菌株展开生理学的相关研究,探讨纳豆芽孢杆菌的蛋白酶特性、纳豆芽孢杆菌中纳豆激酶的分离及不同理化因子对液体发酵产纳豆激酶的影响,为进一步的研究提供理论依据。本文首先分离纳豆芽孢杆菌。因待分离菌株为纳豆枯草芽孢杆菌,而纳豆枯草芽孢杆菌具有耐盐耐热的特性,故将经高温处理的纳豆菌菌悬液稀释涂布于高盐培养基上进行目的菌株的初筛,选择具有芽孢杆菌特征的革兰氏阳性菌株,将初筛菌株点种于脱脂牛奶培养基进行复筛。最终由纳豆菌粉中获得1株菌株,命名为BN;由自制纳豆中获得5株菌株,分别命名为BN-1、BN-2、BN-3、BN-4、BN-5。对这6株菌株进一步进行生理生化鉴定试验,鉴定出这6株纳豆菌均分属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)种。对纳豆芽孢杆菌蛋白酶的特性进行了一系列的研究。筛选得到的6株菌株均具有产蛋白酶的能力。在pH值、温度、金属离子等理化条件对BN-4菌株蛋白酶活性影响的试验中发现:纳豆芽孢杆菌BN-4菌株蛋白酶活力在pH6.0~10.0范围内变化不大,pH低于5.0和高于10.0时酶活力显著下降;纳豆芽孢杆菌BN-4菌株蛋白酶作用的最适温度为40℃,温度对蛋白酶活力的影响显著;5mmol/L终浓度的金属离子Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+对纳豆芽孢杆菌BN-4蛋白酶活力有明显的抑制作用,抑制率分别为97%、83%、87%、99%,而终浓度为5mmol/L的K+对蛋白酶活力有激活作用,含K+5mmol/L的BN-4菌株粗酶液蛋白酶活力是空白粗酶液蛋白酶活力的125%。硫酸铵饱和沉淀法分离纳豆芽孢杆菌BN-5菌株粗酶液中的纳豆激酶,可先向粗酶液中加适量的硫酸铵至30%硫酸铵饱和度,4℃8000r/min离心20min,弃沉淀;向上清液中继续加适量硫酸铵至70%的硫酸铵饱和度,4℃8000r/min离心20min,弃上清,沉淀即为初步分离得到的纳豆激酶。用试管定量法分别测定了分离得到的6株纳豆芽孢杆菌菌株粗酶液中的纳豆激酶的纤溶活力,BN、BN-1、BN-2、BN-3、BN-4、BN-5菌株纳豆激酶纤溶活力分别为:38.07μg·min-1·ml-1、72.5μg·min-1·ml-1、150.06μg·min-1·ml-1、55.70μg·min-1·ml-1、46.9μg·min-1·ml-1、49.4μg·min-1·ml-1。为确定纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆激酶的最佳条件,以普通发酵培养基为基础,分别改变培养基的成分及含量,考察培养基组成对纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆激酶活力的影响;分别改变培养温度、培养时间等,考察培养条件对纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆激酶活力的影响。以3%的麦芽糖为碳源,1.5%的酵母膏为氮源,0.1%MgSO4,0.04%CaCl2,0.2%Na2HP04,0.1%NaH2PO4,pH 7.5,接种量为2%,装液量为30ml/250ml的条件下,37℃150r/min摇床培养第3d为产酶高峰期。优化后的液体发酵产酶培养基产纳豆激酶活力比基础培养基的酶活力提高了1.5倍。
参考文献：
[1]. 枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶的研究[D]. 关志炜. 山东轻工业学院. 2007
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