广东省汕头市汕头大学医学院第一附属医院康复医学科 广东 汕头 515041
【摘要】目的：建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，观察米诺环素对大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响，为临床应用米诺环素提供实验室数据。方法：采用大脑中动脉线栓闭塞法(线栓法)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，缺血120min后恢复再灌注24h。36只健康成年雄性SD大鼠(250±10)g，随机分为假手术组(n=6)、缺血再灌注组(n=12)、米诺环素治疗组（n=12）。采用TUNEL方法对缺血损伤的神经细胞DNA损伤情况进行观察，评价米诺环素的神经保护作用。结论： 1、大鼠局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO）能使脑组织细胞凋亡增加。2、缺血再灌注组与米诺环素干预组细胞DNA损伤明显。3、米诺环素对缺血半暗带、海马CA1区神经元凋亡有抑制作用，具有神经保护作用。
【关键词】米诺环素，缺血再灌注，凋亡
急性脑梗死的发病率占脑卒中患者的50％～80％，其致残、致死率高，严重危害人民的身心健康。脑缺血再灌注损伤是指脑组织经历一定时间的缺血后恢复血流供应，使缺血性损伤进一步加重的现象。研究表明脑缺血-再灌注损伤后能启动脑细胞调亡，造成脑细胞不可逆的死亡，主动的细胞凋亡在缺血性尤其在缺血-再灌注损伤中发挥重要作用[1]，直接针对凋亡过程的治疗方法，有助于保护半暗带区的神经细胞，对于脑缺血的治疗有着十分重要的意义。
米诺环素为第二代人工半合成四环素类抗生素，其抗菌谱与四环素相似。米诺环素口服后迅速被吸收，脂溶性较高，组织穿透性好，可以通过血脑屏障作用于中枢神经系统。近年表明，米诺环素不仅具有广谱的抗菌作用，且在脑缺血、脑外伤[2]、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化和帕金森病模型上，均有显著的神经保护作用。其中，在全脑和局灶性脑缺血模型上，发现米诺环素具有减少梗死面积等脑保护作用，治疗时间窗较传统的药物更长[3]，所以该药既能抗感染又能保护神经，显示出具有很好的临床应用前途，但其抗凋亡作用机制尚没有完全阐明。
本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注模型，探讨米诺环素对神经元凋亡的影响，探索米诺环素可能的神经保护机制，为米诺环素应用于缺血性脑血管病的治疗提供初步实验依据。
材料与方法
一、实验动物及分组
健康成年SD大鼠36只，体重(250±10)g，随机分为假手术组(n=6，只分离颈总、颈外动脉，不做插线处理)，缺血再灌注组(n=12，拔线后腹腔注射5ml生理盐水，随后每12h注射5ml生理盐水一次)；米诺环素干预组（n=12，拔线后立即腹腔注射米诺环素45 mg/kg，随后每12h给药一次22.5mg/kg)。所有动物均于术后72小时处死。取假手术组4只，缺血再灌注组及米诺环素干预组各8只，用于神经功能评分、TUNEL测定。
二 TUNEL检测细胞凋亡
原理：细胞凋亡的特征是激活的内源性核酸内切酶切割细胞自身的染色质或DNA，出现单链或双链切口，并出现与DNA断点数目相同的3’-OH末端。利用末端脱氧核糖核酸酶(TdT)，可催化DNA片断的3’-OH末端合成多核苷酸聚合物，在DNA片断上加尾，再用带有生物素或荧光素等标记物的单核苷酸掺入到加尾聚合物中，实现对DNA断裂缺口的标记。TUNEL方法的特异性和灵敏度很高，可在细胞凋亡的早期阶段原位显示凋亡细胞及其分布。
三、统计学处理
采用SPSS17.0统计软件，所有检测数据用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。以P<0.05表示差异有统计学意义。
实验结果
一、神经功能缺失体征
对照组、假手术组大鼠未出现任何神经缺失症状；缺血再灌注组大鼠出现不同程度的神经功能缺损，如活动减少，左前肢不能完全伸展，行走时向左侧转圈出现追尾现象、向左跌倒，可伴有右侧Horner征，主要表现为眼裂变小。
二、 TUNEL染色
阳性细胞胞核呈棕色或棕褐色，核浓缩致密，核形不规则，大小不一。假手术组偶可见凋亡细胞，推测系生理性死亡的神经元；缺血再灌注组可见大量凋亡细胞；米诺环素干预组凋亡细胞与正常细胞交错存在，凋亡细胞数明显减少但高于假手术组。各组阳性细胞数比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1，表2)。
讨论
米诺环素(minocycline)化学名为二甲胺四环素分子式：C23H27N3O7。分子量：457。48。于1967年首次制得，具有四环素类药物基本的四环结构和5、6、7三位的特定官能团，其中7位的二甲氨基，可通过结合细菌核糖体的30R亚基，阻止tRNA与受体位点结合， 从而抑制蛋白质的合成，达到抗菌作用[4]。米诺环素具有相对分子质量小、亲脂性高、可通过血-脑屏障、口服易吸收的特点，对金黄色葡萄球菌、链球菌、脑膜炎双球菌等革兰氏阳性及革兰氏阴性球菌等都有较好的抗菌效果，抗菌作用在四环素类抗生素中较强，容易透过血脑屏障到达中枢神经系统，可高效通过血-脑脊液屏障达50%，临床上已广泛用于呼吸道、胆道、尿路和皮肤软组织感染、衣原体肺炎、衣原体感染及立克次体病等。随着对盐酸米诺环素的深入研究，发现其除了有很好的抗微生物作用外，还有其它一些生物学特性，从而为拓宽其临床应用提供了依据。这些特性表现在：抗炎症作用；免疫抑制作用；抗胶原酶活性等。近年来人们通过研究其对卒中、肌萎缩性侧索硬化症、Huntington病、脊髓损伤和帕金森氏病等的治疗作用发现，米诺环素还是一种安全有效的神经保护剂，但其神经保护作用机制尚待阐明，目前认为主要有：阻断小胶质细胞的激活从而抑制炎性介质释放进而抑制细胞凋亡，抑制基质金属蛋白酶的分泌保护血脑屏障，改善神经环境，增加神经发生[5]。并在这些报道中对米诺环素不同剂量对神经元的作用不同进行了阐述。许多动物实验表明在全脑或局灶性脑缺血，短暂或永久性脑缺血中，米诺环素可减小脑梗体积，抑制神经元凋亡，保护血脑屏障，改善神经功能。
另外，米诺环素本身又有神经毒性，尚需大样本动物及临床试验研究，进一步改进米诺环素剂量和给药方式，接下来的实验还需要对米诺环素干预组的不同治疗时间段再进行大样本的组间对比，才能更好的把握米诺环素的最佳治疗时间窗，相信随着研究的深入及对米诺环素分子结构的改良，一种低毒高效既能抗感染又有神经保护作用的新一代抗生素终会诞生，为治疗细胞凋亡相关的神经系统疾病提供更有效手段。
参考文献
[1]LIPtonP。Isehemieeelldeathinbrainneurons。PhysiolRev，1999，79:1431一1568。
[2]Wells JE， RiceTK， NuttallRK，et al。An adverse role for matrix metallo proteinase 12 after spinal cord injury in mice[J]?JNeurosci，2003，23(31): 10107-10115。
[3]WangCX， YangT， NoorR，etal?Delayedminocycline but not delayed mild hypothermia protects against embolic stroke[J]?BMC Neurol，2002， 2: 2。
[4]Yrjanheikki J， KeinanenR， PellikkaM，etal?Tetracyclines inhibitmicroglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia[J]?ProcNatlAcad Sci USA，1998，95(26): 15769-15774。
[5]Liu Z，Fan Y，Won SJ，et al。Chronic treatment with minocycline preserves adult new neurons and reduces functional impairment after focal cerebral ischemia[J]。Stroke，2007，38:146-152。
论文作者:陈雄姿
论文发表刊物:《医师在线》2017年8月下第16期
论文发表时间:2017/11/10
标签：细胞论文; 凋亡论文; 作用论文; 神经论文; 脑缺血论文; 大鼠论文; 损伤论文; 《医师在线》2017年8月下第16期论文;