应智伟[1]2001年在《对虾杆状病毒1197基因的表达和产物纯化的研究》文中进行了进一步梳理1993年以来，我国沿海省份相继发生养殖对虾大批死亡现象，损失严重，引起国内外研究者的重视。经过一段时间的努力研究后，我们率先报导了引起该病的病原是一种无包含体的杆状病毒。以后，该病毒的一些其他特性及引起对虾的病理学及组织学的变化又陆续见诸于报导。我们已经报导了该杆状病毒的一个早晚期基因1197bp的克隆和序列分析，并针对此基因设计了二个核酶，在体外成功地对此基因进行了切割。为今后利用核酶来抑制对虾病毒的增殖和控制对虾病毒病打下进一步研究的基础。本文我们用基因克隆的方法将该病毒的早晚期基因1197基因克隆到pGEX-3X、pTXB11和pTYB12表达载体中。该基因从我们构建的病毒基因库用PCR的方法进行扩增。合成的引物根据已测得1197基因读框3′及5′端顺序合成寡聚核苷酸片段。其上游引物1197S1：5′CG GGA TCC ATG TTT AGT GAG AAT TTT G3′，下游引物1197S2：5′CG GAA TTC TTA ACC GCA GCT GCA GTT TC3′。PCR产物用低熔点胶方法回收片段。纯化产物用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，pGEX-3X用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，产物经低熔点胶回收方法进行纯化，进行常规连接，转化。转化的菌株为DE3钙细胞。用酶切和PCR方法筛选并鉴定含1197基因的重组表达质粒pGEX3X-1197，然后经测序确证读框正确。诱导的条件为IPTG0.2mM浓度，37℃诱导5-6小时。冰浴下进行超声波破菌，离心得上清，经谷胱甘肽S-转移酶 （GST）亲和层析并解离得到初步纯化的融合蛋白。因蛋白表达量很高， 表达菌株形成包涵体，超声波破菌后上清含量极少，且杂蛋白GST的 量很高，给纯化蛋白造成一定的困难，用GST亲和柱分离到的蛋白其 中GST蛋白含量显着大于融合的蛋白的量，所分离到的蛋白没有进行 下一步实验的意义。于是另外构建了表达质粒 pTXB1 97和 pTYB1 97表达质粒。经测序证明克隆正确。但是不能进行有效的表 达。由于该两个表达质粒是新产品，所以原因无法考证川 pGEX3X1 97 表达质粒的诱导表达产物超声波破菌后的包涵体，进行处理，得到尿素 变性后的高浓度融合蛋白的混合物。用梯度的尿素进行透析，不能恢复 蛋白原先结构，而不能与GST亲和柱结合，也因此不能分离到蛋白。 将该蛋白混合物用FPLC的方法进行分离，分离的柱为CM阴离子交换 柱，用不同梯度的盐浓度进行洗脱，收集到纯的融合蛋白。
傅玲琳[2]2008年在《对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的构建与VP28卵黄抗体的制备及其抗病性研究》文中进行了进一步梳理对虾白斑综合征(WSS)是全球对虾养殖业所面临的危害性最大的病害之一,至今已席卷了世界各国的对虾养殖地区,造成巨大的经济损失。但目前尚无有效的防治手段。因此,如何预防和控制该病毒病一直是近年来研究的热点。本研究在构建wssv重组VP28抗原蛋白枯草芽孢工程菌(B. subtilis-VP28)与卵黄抗体(VP28-IgY)的基础上,经口服途径免疫克氏原螯虾,进行保护螯虾抵抗WSSV感染的效果试验,并初步研究B.subtilis-VP28和VP28-IgY的抗病机理。主要研究内容和结果如下：1新型穿梭分泌性表达载体pBES的构建在多功能穿梭克隆载体pBEC(来源于B.subtilispUB1 10和Ecoli pGEM3载体)的基础上,引入B.subtilis强启动子PEσ43和一段新天然信号肽序列,构建了一新型Bsubtilis-E. coli穿梭分泌性表达载体pBES。为评价所构建载体的表达与分泌效率,引入β-葡聚糖酶报告基因,进行分泌量动态分析。经SDS-PAGE分析及不同时间酶活测定表明,β-葡聚糖酶报告基因成功获得分泌表达,在强启动子PEσ43作用下,其单位发酵液总酶活最高可达283.45 U／ml。然而,胞外酶活最高为116.95 U／ml,分泌比例为41.26%,可见此天然信号肽分泌能力有限,还需作进一步的突变筛选。2 B. subtilis信号肽结构区域氨基酸组成与分泌效率的关系从野生型天然信号肽N区正电荷数与H区疏水性改造的角度出发,构建了一系列(15个)信号肽突变体,研究信号肽结构区域氨基酸组成与信号肽功能的关系。实验结果表明,N区的正电荷有利于提高信号肽分泌能力,但过高的电荷反而使分泌效率有所下降；H区疏水性对分泌效率影响较大,过高或过低的疏水性都不利于分泌识别过程；同时具有N区高正电荷及H区高疏水性的信号肽,反而分泌效率低；在N区高正电荷的情况下,H区中度疏水性的信号肽分泌能力最强。本研究筛出了两条具有高分泌能力的突变信号肽：H3N2 (MRARKIAGM ATSGGVAQPSSAVA)、H3N23 (MRRRKIAGMATSGGVAQPSSAVA),报告基因胞外分泌量分别达到80.28%与80.66%,比亲本天然信号肽均提高1.95倍。本试验成功筛选并构建得到基于强启动子PEσ43与高分泌能力信号肽H3N2、H3N23的枯草芽孢杆菌高效分泌表达载体pBES-H3N2和pBES-H3N23。3 vp28基因的高效分泌表达及分泌动态分析利用构建的Bsubtilis高效分泌表达载体pBES-H3N2和pBES-H3N23,以低蛋白酶活性的B.subtilisWB600作为宿主菌,构建了重组VP28蛋白枯草芽孢工程菌B.subtilis (pBES(H3N2)-VP28)和B. subtilis (pBES(H3N23)-VP28),vp28基因成功获得胞外分泌表达。用兔抗anti-VP28 IgG检测,具有免疫反应性。对分泌效率进行动态分析,结果显示,两株高效表达菌株均在22 h时达到最大VP28蛋白分泌量,分别为45.6 mg／L和47.4 mg／L,22 h之后分泌量略有下降,最后趋于稳定。4特异性VP28-IgY的制备与稳定性研究将表达纯化的WSSV重组VP28抗原蛋白免疫150日龄的海兰白蛋鸡,免疫叁次,每隔2周免疫一次。对卵黄中特异性VP28-IgY的抗体效价及其变化规律进行检测。结果显示,在首免后第14天即可检测到特异性抗体(P/N=2.555,1：400)；第56天抗体效价达到最高(P/N=14.920,1：3200)；至120天试验结束时,抗体效价仍维持在较高水平(P/N=9.265,1：1600)。用水稀释法结合50%、33%饱和硫酸铵沉淀提纯IgY的方法,可得到特异性IgY估测纯度约为83.6%。SDS-PAGE分析提纯的IgY,发现重、轻链分别约为60 kDa与25 kDa,估算其总分子量约为170 kDa。对VP28-IgY稳定性研究表明,其在温度低于70℃、pH3.0-10.0范围内有较好的稳定性；对胃蛋白酶和渗透压具有较强的耐受性。5口服工程菌B.subtilis-VP28和VP28-IgY的螯虾体内保护效果制备芽孢期和营养期形式的工程菌Bsubtilis-VP28,并研究口服工程菌的保护效果。结果显示,以芽孢形式免疫组rVP28-bs的螯虾相对存活率均高于营养期形式组rVP28-bv,在免疫后第3、14、28天攻毒,前者相对存活率分别为65.4%、78.3%和59.7%,后者相对存活率分别为38.2%、51.7%和36.8%。为研究口服VP28-IgY中和病毒产生的保护效果,以0.01%、0.05%和0.1%的添加量添加至虾饵料,连续投喂20天后口服攻毒,相对存活率分别为48.3%、86.0%和88.3%。以上结果表明,工程菌Bsubtilis-VP28的芽孢形式,具有较理想的口服免疫效果；而以中和作用为主的VP28-IgY,其保护效果较为理想的最低添加量为0.05%。6B.subtilis-VP28和VP28-IgY抗病性机理初步研究对B.subtilis-VP28保护机理初步研究表明,工程菌Bsubtilis-VP28能特异性降低WSS的发病率,并同时激发螯虾体内非特异性免疫因子及提高抗氧化能力,从而增强虾体对WSSV的抵抗性。根据光镜、电镜观察结果推测,口服VP28-IgY(0.05%添加量)组,在攻毒后初期,螯虾体内大部分病毒被中和,另一小部分病毒侵入血细胞及其它组织细胞,但在未达到致死量或未使组织达到严重损伤时,即逐步被中和清除。Bsubtilis-VP28和VP28-IgY能中和与清除螯虾体内的病毒,并由此抑制或缓解WSSV引发的大量细胞凋亡。
邹键[3]2003年在《鹅副粘病毒SF02全基因组克隆与序列分析及锤头状核酶对病毒复制的抑制作用》文中研究表明禽副粘病毒(Avian Paramyxovirus virus, APMV)共有9个血清型,即APMV1~9。APMV-1只有新城疫病毒(Newcastle disease, NDV)一个成员。NDV对不同宿主致病力差别很大，鸡最为敏感，鸽子等飞禽也能感染发病，而鸭和鹅等水禽可能被感染但不表现出临床症状。1999年12月上海地区部分养鹅场爆发了一种急性烈性传染病。其病原鉴定表明该病是由一种鹅副粘病毒(Goose paramyxovirus, GPMV)所引起。该病毒命名为SF02。经分离鉴定确定其分类地位为副粘病毒科，属于APMV-1，即NDV的成员之一。但初步实验表明，与传统的NDV株相比，其致病性与NDV有显着不同。NDV只对鸡、鸽等飞禽具有致病性，而该病毒对鹅、鸡、鸽、鹌鹑、番鸭等飞禽和水禽均具有很强的致病性。本研究内容包括：第一部分，前已证明NDV与GPMV在致病性上有重要的区别。本研究进一步分析了二者在细胞水平的感染能力差异。采用NDV强毒株F48E9，中毒株Komarov，弱毒株La Sota和无毒性株V4/66，以及SF02分别感染鸡胚和鹅胚成纤维细胞。结果表明，尽管在整体动物水平NDV与GPMV的致病性差异显着，但在离体培养的成纤维细胞中，二者的感染性并无明显差别。这表明，NDV与GPMV在感染水禽时的致病性差异并不是因为诸如细胞膜受体等细胞水平的因素不同而造成的。第二部分，为了进一步分析NDV与GPMV致病性差异的机理，本研究完成了对GPMV SF02的全基因组测序分析。根据已知的NDV毒株的基因组序列设计引物，用RT-PCR和Ligation-anchored PCR方法，克隆和测定了SF02的全基因组序列。序列的计算机分析结果表明，SF02全基因组长15 192 nt，与NDV相比，在NP基因和P基因之间的非翻译区多了6 nt；全基因组与NDV一样，都由3' -NP-P-M-F-HN-L- 5'六个ORF组成，但在SF02基因组的1960-1412位还存在有一<WP=4>个反义ORF，该ORF在序列已知的NDV毒株中并不存在。相似性分析表明，SF02基因组与NDV毒株的基因组的相似性达80%以上。分子进化分析表明，SF02属于VIIa基因型NDV。根据GPMV与NDV F基因的序列差异，设计叁条引物，用多重RT-PCT的方法，成功的区分了GPMV和NDV。这对有针对性地防治GPMV和NDV具有重要指导意义。第叁部分，核酶是治疗病毒性疾病的潜在有效药物之一。本研究中，针对在GPMV生活史中起膜融合和毒力决定作用的F基因，我们设计了锤头状核酶RzF598。体外切割实验表明，RzF598可以成功剪切SF02 F基因的mRNA。将RzF598转入鸡胚成纤维细胞中，以无核酶功能的突变体dRzF598和pcDNA3空质粒为对照，分析核酶对病毒增殖的抑制作用。结果表明，表达正常核酶RzF598的细胞对病毒感染具有很高的抗性，其存活率达到80%以上。未转染任何质粒的细胞和转染pcDNA3空质粒的细胞经SF02感染后存活率只有约5 %。分析可能由于反义RNA的作用，转染dRzF598的细胞对病毒也具有一定抗性。本工作在病毒基因水平研究和探讨了NDV与GPMV致病性差异的原因，并为进一步深入研究其具体机制打下了基础。同时，初步探索了锤头状核酶对治疗该病毒引起的疾病的可行性。
黄艳青[4]2009年在《大黄鱼头肾SSH cDNA文库构建及两个重要生理功能分子（BPI、DP1）的生物学特征和功能研究》文中指出大黄鱼是我国近海特有的主要经济鱼类和当前最主要海水养殖鱼类之一,目前关于大黄鱼的基础免疫学和生理学方面的研究还比较少。为了获得涉及大黄鱼的基础免疫学和生理学方面的重要的差异表达基因,本研究以肽聚糖为免疫刺激剂,用抑制性差减杂交技术(SSH)构建了大黄鱼受肽聚糖刺激后头肾差异表达基因的cDNA文库,并结合RACE-PCR技术对其中2个重要生理功能的分子(BPI、DP1)进行了克隆鉴定及生物学特征和功能研究。本研究取得的主要结果包括3个方面：1cDNA文库分析结果在构建好的cDNA文库中,随机挑取克隆测序得到196个EST,组装后得到149个unique gene, GenBank编号为EB643250-EB643371和GO271613-GO271637,其中26个有明确的注释,根据其功能和作用可以被分为10类,其中5个与免疫反应相关,3个线粒体基因,3个信号转导分子,5个蛋白激酶类分子,2个癌基因,2个微卫星基因,2个细胞骨架基因,1个RNA水平相关因子,1个雄性不育基因和1个核糖核蛋白。2大黄鱼杀菌通透增强蛋白Pc-BPI的生物学特征和功能研究该基因cDNA全长为1919bp (GenBank序列号：DQ917778),开放阅读框长1419 bp,编码472个氨基酸。大黄鱼Pc-BPI的氨基酸序列与其他物种的同源物的相似性为25-36%。在Pc-BPI的N末端(5.02e-31)和C末端(1.93e-32)分别包含一个典型的哺乳动物BPI/LBP/CETP的结构域。Pc-BPI在正常大黄鱼各组织中为普遍性表达,在鳃、脾、头肾中的表达量比其它被检组织表达高,其表达水平可被福尔马林灭活的诺卡氏菌(FI-Ns)和福尔马林灭活的溶藻弧菌(FI-Va)诱导。表达了大黄鱼Pc-BPI基因的N末端和C末端的原核重组蛋白(rBN、rBC),和Pc-BPI全蛋白的真核表达产物(rBO)。rBN有强烈杀灭哈维氏弧菌的作用,对从患病海水养殖鱼类中分离到的溶藻弧菌和副溶血弧菌也能有效杀灭。制备了针对rBN的兔抗血清,免疫组化研究显示,Pc-BPI的表达在肾组织中的阳性反应较弱,而脾和头肾组织中阳性反应强烈,且主要在各组织细胞的实质性细胞和脾脏血窦的内皮细胞及肾小管的上皮细胞的细胞质中进行表达,在实质性细胞的细胞核中也有轻度的表达。3大黄鱼重要的生理功能分子——转录因子Pc-DP1的生物学特征和功能研究克隆和表达了大黄鱼重要的生理功能分子——转录因子Pc-DP1 (GenBank序列号：DQ821446)。其cDNA全长1427 bp,具有一个1239 bp的读码框,编码412个氨基酸。大黄鱼Pc-DP1蛋白是一个结构和功能上都非常保守的蛋白,Pc-DP1的氨基酸序列与斑马鱼的DP1的相似性最高(88%),与爪蟾、人和鼠的相似度均为78%。Pc-DP1氨基酸序列中包含一个典型的保守DNA结合区域(113-148)和一个与E2F亚家族蛋白结合为二聚体的区域(149-209)。大黄鱼Pc-DP1蛋白的N端多为碱性氨基酸,而C端多为酸性氨基酸。Pc-DP1的mRNA在所检测的各组织中均有表达,在心脏、脾脏和肠中表达量相对较高,在头肾中表达量最少.Pc-DP1在大肠杆菌中高效表达,并制备了针对该重组蛋白的兔抗血清。EMSA实验结果表明,该重组蛋白具有一定的DNA结合能力,且这种结合能力具有序列特异性。免疫组化结果表明,阳性反应主要发生在脾、头肾、肾的实质性细胞的细胞质里和鳃丝的上皮细胞的胞质中。
宋小瑞[5]2016年在《长牡蛎免疫系统的发生和发育机制的初步研究》文中研究说明长牡蛎是世界范围内重要的海水养殖品种,也是软体动物门,冠轮动物超门最具代表性的物种之一。然而近年来长牡蛎大规模死亡事件频发,特别是夏季苗种繁育时期稚贝的大量死亡,逐渐成为制约养殖业健康持续发展的一个限制性因素。本论文主要采用分子免疫学等技术,分析了长牡蛎幼虫在早期个体发育过程中的免疫防御能力,探讨了造血相关转录因子在个体发育过程中的表达模式,并据此对长牡蛎发育过程中的造血作用进行了初步分析。研究结果进一步深化了无脊椎动物免疫系统发生和发育的研究,同时对贝类病害防控具有重要的指导意义。一、长牡蛎早期发育过程中免疫能力的检测在早期D形幼虫(17 hpf)中观察到吞噬现象发生于面盘区域。此外,模式识别分子(integrinβ-1、caspase-3和C-type lectin 3)和免疫效应分子(IL17-5)的蛋白定位在面盘和消化腺区域,推测它们为免疫系统发生的潜在位点。孵化期(9 hpf)为胚胎期和浮游期之间的过渡阶段。抗氧化酶(EC-SOD和CAT)和溶菌酶的活性,以及12个候选免疫因子的m RNA表达水平在孵化期处于发育过程中的最低水平。随后在担轮幼虫期(15 hpf),3种酶的活性和7个候选免疫因子的m RNA表达量均开始上升。个体发育至D形幼虫期(50 hpf),6个候选免疫因子的m RNA表达水平出现上升趋势,壳顶幼虫期(120 hpf),12个候选免疫因子的m RNA表达水平均出现稳定的上升趋势。灿烂弧菌刺激后,D形幼虫中12个候选免疫因子的m RNA表达水平均显着上调。上述结果表明幼虫在孵化期时免疫能力相对较低,当发育至担轮和D形幼虫期,免疫系统开始发生发育,在病原菌的刺激下,免疫系统能够被进一步激活。壳顶时期的幼虫已经具备较为完善的免疫系统,能够对外界刺激产生有效的免疫应答。二、长牡蛎Cg-SCL基因的鉴定与功能分析克隆获得长牡蛎造血相关转录因子Cg-SCL基因的c DNA序列,发现其含有一个保守的b HLH结构域,并与脊椎动物及海胆中的同源SCL基因具有较高的相似性。Cg-SCL在牡蛎成体血细胞、鳃和外套膜组织中有较高的m RNA和蛋白表达水平。在长牡蛎早期个体发育过程中,Cg-SCL的m RNA表达水平从受精后缓慢上升,担轮幼虫早期(10 hpf)达到峰值,然后下降,直至个体发育至壳顶幼虫期(120 hpf)。整体免疫荧光定位显示Cg-SCL最先出现在囊胚期(4 hpf),呈现为近似对称性的两点,并且这一表达模式持续到原肠胚期(8 hpf),至担轮幼虫期Cg-SCL分布于背部区域并呈现为清晰的环形结构,D形幼虫期,Cg-SCL蛋白在背部区域特化为两个窦穴状结构,同时以纤维状贯穿整个幼虫体内。灿烂弧菌刺激后,D形幼虫和壳顶幼虫中Cg-SCL m RNA表达水平均出现显着上调。在成体长牡蛎中,Cg-SCL的干扰会引起血细胞特异性基因(Integrin和Ec SOD)和造血相关转录因子(GATA3,C-Myb和c-kit)的显着下调。上述结果说明Cg-SCL可以作为长牡蛎造血作用的标记分子,从其表达模式推测长牡蛎中造血作用类似于果蝇,存在胚胎和幼虫两次造血过程。胚胎造血发生于囊胚时期,幼虫造血则发生于担轮幼虫时期,Cg-SCL可能在两次造血过程中均发挥重要的作用,可以作为长牡蛎造血作用的潜在标记分子。叁、长牡蛎Cg-Runt基因的鉴定及其时空表达模式克隆获得长牡蛎造血相关转录因子Cg-Runt基因的c DNA序列,生物信息学分析发现它含有一个保守的Runt结构域,同源于Runx家族分子中的Runx1基因。在血细胞、鳃和外套膜组织中检测到较高的Cg-Runt m RNA和蛋白表达水平。在长牡蛎早期个体发育过程中,Cg-Runt在受精卵和胚胎期均有表达,且在担轮幼虫早期(10 hpf)达到表达峰值,但进入D形幼虫期后,Cg-Runt m RNA表达水平显着降低。整体免疫荧光定位显示Cg-Runt蛋白在囊胚期(4 hpf)不规律地分布于整个胚胎,原肠胚期(8 hpf)分布于植物极,在担轮幼虫期(15 hpf)则分布于背部区域并呈现清晰的环形结构,在D形幼虫早期(22 hpf),Cg-Runt蛋白在消化腺区域特化为窦穴状结构,D形幼虫期(50 hpf)以后蛋白信号呈纤维状贯穿整个幼虫体内,并且在壳顶幼虫(120 hpf)期,信号更加强烈。研究结果表明Cg-Runt参与幼虫造血过程,此外还可能在个体发育早期和幼虫后期参与细胞分化和组织形成。四、长牡蛎Cg-GATA-2/3基因的鉴定与功能分析克隆获得长牡蛎造血相关转录因子Cg-GATA-2/3基因的c DNA序列,生物信息学分析发现它含有两个串联重复的Zn F_GATA锌指结构域,与脊椎动物中的GATA-2和GATA-3,以及海洋动物中的同源GATA基因聚为一个大的类群。在血细胞、鳃和外套膜组织中检测到较高Cg-GATA-2/3的m RNA和蛋白表达水平。整体免疫荧光定位显示Cg-GATA-2/3蛋白在囊胚(4 hpf)和原肠胚期(8 hpf)不规律地分布于整个胚胎。随着胚胎不断发育在担轮幼虫期(15 hpf)迁移至背部区域并呈现为清晰的环形结构,在D形幼虫早期(22 hpf)在背部区域特化为两个窦穴状结构,并持续到D形幼虫中期。随着个体发育为壳顶幼虫(120 hpf),Cg-GATA-2/3蛋白的表达增多,集中分布于背部区域及面盘处。在成体长牡蛎中,Cg-GATA-2/3的干扰引起血细胞特异性基因Ec SOD和造血相关转录因子C-Myb的显着下调,同时导致循环血细胞和鳃组织中的新生细胞数目显着减少。以上研究结果表明Cg-GATA-2/3参与了胚胎和幼虫两次造血,对长牡蛎血细胞的生成具有重要的调控作用,可能主要通过调控Cg-SCL而间接参与胚胎造血,并协同Cg-SCL、Cg-Runt共同调控幼虫造血。综上所述,在长牡蛎的早期个体发育过程中,母源免疫物质在胚胎早期为个体提供重要的免疫保护作用。个体免疫系统在担轮幼虫期开始发生发育,胚胎造血和幼虫造血相继发生在囊胚期和担轮幼虫期,其中转录因子Cg-SCL和Cg-GATA-2/3可能参与胚胎造血,Cg-SCL、Cg-Runt和Cg-GATA-2/3共同参与幼虫造血作用;随着幼虫的发育,D形幼虫的血细胞开始具有吞噬能力,免疫系统在壳顶幼虫时期基本发育完善。
刘问[6]2010年在《白斑综合征病毒对锯缘青蟹的致病性及致病机理研究》文中提出锯缘青蟹(Scylla serrata Forskal)俗称青蟹,是我国重要的海水养殖蟹类。近年来,浙江、福建、广东等青蟹主要养殖地区出现了严重的青蟹病害。2006～2008年对浙江省养殖青蟹的发病原因和流行病学调查发现,白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)在病蟹中的检出率为34.82%,提示WSSV与青蟹发病可能存在较大相关性。为进一步研究WSSV对青蟹的致病性和致病机理,作者采用白斑综合征病毒悬液,分别以1∶10、1:100、1:1000、1∶10000浓度注射感染健康青蟹,结果表明1:10、1:100感染组的青蟹死亡率达100%,1:1000感染组死亡率为66.7%,1:10000感染组死亡率为38.9%。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)确定WSSV攻毒悬液中的病毒浓度,计算出WSSV对青蟹的半数致死量(LD_(50))为1.10×10~6拷贝/只(7.34×10~3拷贝/g组织)。PCR检测感染组濒死青蟹的血淋巴,显示感染组死亡青蟹的WSSV检出率为100%,表明WSSV对青蟹有很强的致病力。分析WSSV感染濒死蟹的血清酚氧化酶(PO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)等主要酶指标,发现病毒感染后青蟹的PO、POD和SOD活力明显低于对照组,其中PO比对照组下降了84%、POD比对照组下降78.6%、SOD比对照组下降3.82%,提示WSSV感染可能导致机体免疫防御机能和抗氧化能力下降。而ALP、GPT和GOT的活力则明显高于对照组,其中GPT和ALP分别比对照组升高了226.6%和173.5%,GOT升高了38.3%,提示病毒感染致使青蟹组织器官损伤,从而造成机体功能严重受损,最终导致青蟹死亡。透射电镜观察WSSV感染蟹的鳃上皮细胞,可见细胞核中存在大量杆状、椭球状的病毒粒子。组织病理分析显示,鳃上皮细胞的细胞核明显肥大,并可见较多嗜碱性病毒包涵体。用WSSV单克隆抗体,对感染蟹进行免疫组化分析,表明WSSV主要侵染青蟹的鳃、甲壳下表皮、心脏、肠、胃等组织的上皮细胞。为进一步研究WSSV对锯缘青蟹的分子致病机理,采用双向电泳(2-DE)技术分析了感染WSSV的青蟹血清的蛋白表达谱,检测到26个显着差异表达的蛋白质点;采用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,成功鉴定了22个显着差异表达的蛋白质点(12个蛋白质点的表达上调、10个蛋白质点的表达下调),表达上调蛋白包括血蓝蛋白亚单位1(hemocyanin subunit 1)、血蓝蛋白亚单位(hemocyanin subunit)、α-2巨球蛋白(alpha 2-macroglobulin)、热休克蛋白70(heat shock protein 70)、细胞溶质锰超氧化物歧化酶(cytosolic manganese superoxide dismutase)、过氧化氢酶(catalase)、假血蓝蛋白(cryptocyanin)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)、精氨酸激酶(arginine kinase)和核糖体蛋白S28(ribosomal protein S28);表达下调蛋白包括酚氧化酶原(prophenoloxidase)、热休克蛋白90-2(heat shock protein 90-2)、假血蓝蛋白1 ( cryptocyanin 1 )、3-磷酸甘油醛脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、肌动蛋白(actin)、原肌球蛋白(tropomyosin)、突触相关蛋白(synaptosomal-associated protein, putative)和转座酶(transposase)。这些差异蛋白介导了机体的免疫防御、抗氧化防御、应激、氨基酸代谢及糖代谢等反应,对差异蛋白在WSSV致病过程中的作用机制的分析探讨,为进一步阐明WSSV对青蟹的分子致病机理、寻找与病疾相关的生物标记物及有效的疾病防控方法提供了重要的理论依据。
袁志峰[7]2004年在《基于系统创新理论的产学研合作机制研究》文中研究表明产学研合作作为技术创新的有效形式已为我国的经济发展发挥了巨大作用，其中健康的产学研合作机制是其作用得以发挥的关键，产学研合作机制研究也因此成为一项颇具意义的课题。 本文首先分析了我国产学研合作的实施背景和当前中国发展形势对产学研合作研究的新要求，从而明确了系统创新理论对本文的指导地位。 其次对产学研合作的概念和历史进行了回顾并引入两种典型的系统创新理论模型：国家创新体系理论模型和合作创新系统理论模型。在此基础上构造了产学研合作创新系统模型。 最后，以产学研合作创新系统模型为指导，从两个角度对产学研合作机制进行了研究：一、合作生命周期角度；二、系统角度。本部分重点通过五个典型案例，对新形势下产学研合作创新系统中产、学、研、政府、制度、文化等系统要素及其相互关系对产学研合作的影响和作用机理作了深入探讨，揭示了当前产学研合作机制存在的重大问题并提出了改进的建议。 本文的主要结论如下：一、现代企业制度重于技术；二、产权清晰是合作利益机制乃至合作成功的基石；叁、开放的科技体制和创新文化是合作成功的保证；四、产学研合作作用的充分发挥有赖于产、学、研各要素的均衡发展。
参考文献：
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[2]. 对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的构建与VP28卵黄抗体的制备及其抗病性研究[D]. 傅玲琳. 浙江大学. 2008
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