何晓兰, 侯喜林, 吴纪中, 刘桂华, 钦佩[1]2004年在《叁角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的克隆及序列分析》文中认为以藜科植物山菠菜甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)基因的保守区设计引物 ,通过RT PCR技术 ,从叁角叶滨藜cDNA中分离了两个BADH基因片段BADH3 和BADH5,并利用巢式PCR、cRACE以及 3′ RACE获得全长BADH3 。测序结果表明 ,BADH3 和BADH5之间的核苷酸同源性为 81 % ,其推测的氨基酸序列同源性 80 %。全长BADH3 核苷酸序列长 1 81 5bp ,79～ 1 5 78bp为一个开放阅读框架 ,推测的氨基酸序列全长 5 0 0个氨基酸残基 ,相对分子质量为 5 4 70 0 ,pI为 5 5。其核苷酸序列和推测的氨基酸序列与山菠菜同源性分别为 95 %和 93%。由叁角叶滨藜 3′端部分BADH基因的克隆gBADH1 和gBADH2 推测的外显子序列分别与BADH5和BADH3 完全一致 ,且gBADH1 和gBADH2 的内含子插入位置和大小有较大差异。表明叁角叶滨藜BADH基因是一个多基因家族 ,至少存在 2个成员
何晓兰[2]2003年在《叁角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因的克隆》文中提出根据甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因保守域设计一系列特异引物和兼并引物，利用RT-PCR技术从耐盐蔬菜叁角叶滨藜中分离了两个基因序列BADH3和BADH5，并利用cRACE和3′-RACE技术获全长BADH3(GenBank登录号：AY256971)。测序结果表明，BADH3和BADH5，彼此核甘酸和推测的氨基酸序列同源性分别为81％和80％。表明叁角叶滨藜BADH基因是一个多基因家族，至少存在两个成员。全长BADH3 cDNA核苷酸序列长1.815 kb，78～1580bp为一个开放阅读框架，推测的氨基酸序列全长500个氨基酸残基，分子量为54.7KD，pl为5.5。BADH3推测的氨基酸序列与藜科滨黎属植物和藜科其它属植物的同源性较高，同源性分别为93％-96％和84％-86％。与其它科植物的同源性相对低些为61％-79％。表明BADH3与其它植物的同源性基本符合种属划分标准。植物BADHs分子进化树分析表明BADH3和BADH5可能分别属藜科和苋科的两个分支成员，叁角叶滨藜BADH基因家族可能在藜科和苋科植物分化之前己进化为至少两种差异较大的基因。 根据全长BADH3序列设计引物，通过RT-PCR技术从叁角叶滨藜中扩增并克隆了该基因ORF，同时在5′端和3′端分别引入BamH1和SacI酶切位点。利用BamH1和Sacl酶切位点将ORF_(BADH3)连接到pCAMBIA2301的多克隆位点，并把CaMV35S启动子和nos终止子分别连接到ORF_(BADH3)的上游和下游的多克隆位点上，获重组植物表达质粒pCBAMATBADH68，转入根癌农杆菌LBA4404中，获LBA4404(pCBAMATBADH68)菌种。用农杆菌介导法把叁角叶滨藜ORF_(BADH3)转入甘蓝型油菜中，获得15株具有卡那霉素抗性小植株。对其中5株进行了PCR鉴定，1个呈阳性，初步证明该基因已经插入油菜基因组中。 根据叁角叶滨藜BADH3 5′端序列设计特异引物，用反向PCR技术从叁角叶滨藜总DNA中扩增并克隆了该基因的5′侧翼区约855bp的片段。距起始密码子ATG 77bp处的T碱基为可能的转录起始位点。在-25bp～ -30bp、-260bp～ -265bp、-337bp～ -342bp以及-715bp～ -720bp含有推测的TATA-boX(TATAAA)，在-389bp～ -393bp和-720bp～ -724bp含有推测的CAAT-box(CCAAT)，以及在-1 12bp～ -1 16bp和-397bp～ -401bp含有推测的ABA作用元件CACGT。仅其-33bp～ -173bp区与中亚滨藜BADH基因启动子区高度同源，同源性为90％。该BADH3基因5′侧翼区与其它植物BADH基因的启动子无同源性。
参考文献：
[1]. 叁角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的克隆及序列分析[J]. 何晓兰, 侯喜林, 吴纪中, 刘桂华, 钦佩. 南京农业大学学报. 2004
[2]. 叁角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因的克隆[D]. 何晓兰. 南京农业大学. 2003