赵文军[1]2002年在《番茄环斑病毒及转基因产品的分子检测技术研究》文中认为番茄环斑病毒(tomato ring spot virus ToRSV)广泛分布于欧美，危害多种重要经济作物，严重者导致绝产，目前国内尚未发现，因此被我国列为一类检疫有害生物，应实施严格检疫。 目前广泛应用的植物病毒检测方法为血清学检测，其灵敏度及可靠性不能达到出入境检验检疫的要求。反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction RT-PCR)是一种快速灵敏的分子生物学检测方法，但存在漏检和假阳性现象。 本试验在RT-PCR的基础上设计了杂交诱捕引物及杂交探针，优化了杂交诱捕参数，建立了杂交诱捕RT-PCR-ELISA(hybridization capture RT-PCR-ELISA HC-RT-PCR-ELISA)。该方法的基本步骤是：将5'端氨基化的反向引物共价交链在PCR管上，在一定条件下特异性诱捕核酸粗提液中的靶标核酸，然后洗掉杂质及聚合酶抑制物质，完成核酸的诱捕。固相引物既参与核酸的诱捕，又参与PCR扩增。扩增中，在Taq酶的作用下，扩增产物沿着该引物延伸，形成一条固定在管壁上的链称之为固相产物。对液相产物进行凝胶电泳检测的同时对固相产物进行杂交检测。该方法将PCR与ELISA有机结合起来，利用了PCR的高效性与ELISA的高特异性，而建立的一种新的分子生物学检测技术。 作为一种新的检测方法，与传统的RT-PCR相比有如下改进：1)改变了核酸提取方法，利用杂交诱捕法直接从核酸粗提液中诱捕核酸，尤其适合于病毒含量低、Taq酶抑制物质含量高的植物材料，减少了核酸提取的时间及试剂费用。2)结果可靠：杂交特异性诱捕靶标片段的同时去除了核酸中存在的PCR抑制物质，减少了因核酸提取不纯造成的漏检现象，减少了非特异性扩增，结果输出通过双重判定，保证了结果的可靠性。3)灵敏度高：通过杂交进行结果判定，灵敏度比传统的RT-PCR大约高10倍，可以检测出10ug植物材料中的ToRSV。 实时荧光PCR(real time fluorescent PCR RT-F-PCR)是一种不需要进行凝胶电泳，而是在PCR反应中直接通过荧光探针杂交检测扩增产物的的方法。将杂交诱捕与实时荧光 PCR结合起来，诱捕后直接进行反转录 RTfPCR（HC－RTfPCR）检测，该方法检测灵敏度可达到 10fig。HC－RTfPCR方法比 HC－RTICRELISA方法减少了操作步骤；同时由于不走电泳也减少了核酸污染的可能，节省了检测时间，从核酸诱捕到病毒检测完成只需3h，提高了检测效率。 HC－RT－PCR－ELISA和 HC－RT－F－PCR同时作为的检测方法，结果输出都是通过探针杂交后仪器输出，灵敏度相当。前者仪器操作简单，费用低，易于推广应用。后者自动化程度高，工作量小，更快速，结果输出更直观，是一种很有应用前景的病原物检测方法，但目前仪器昂贵，试剂费用高，暂时还难以推广。 利用所建立的 HC－RT－PCR－ELISA和 HC－RT－F－PCR对法国进口的 6株怀疑感染有ToRSV的葡萄种苗进行了检测，发现四株带有TORSV，两种方法检测结果完全一致。从南瓜花叶病毒kquash mosaic virus SqMV）RNAZ保守序列设计引物，用HC－RTPCRELISA检测北京郊区采集的南瓜材料上的SqMV，结果发现所用的6个样品全部带有 SqMV，用巢式 PCR（Nest PCR）对检测结果进行了验证，证明了HC－RT－PCR－ELISA检测结果完全正确。 由于转基因产品（genetically modified organisms GMOs）潜在的非安全性及国际贸易争端，包括中国在内的许多国家，尤其是欧盟要求对进口产品进行转基因检测。355启动子、NOS终止子及 NPT 11基因是目前转基因检测常用的 3个基因。将180hp的 DNA片段包被到 PCR管上进行核酸诱捕，洗掉杂质后直接在该管内作PCR，结果3个基因全部检测出。而非转基因样品未检测到任何基因，证明了HC－PCR检测结果的准确性。
缪建锟, 章桂明, 李大伟, 王颖, 程颖慧[2]2011年在《大豆检疫性真菌、病毒及转基因成分高通量检测体系的研究》文中指出本研究以大豆上的16种检疫性真菌、病毒以及转基因成分为研究对象,应用常规PCR、单重实时荧光PCR、多重实时荧光PCR及滚环扩增-基因芯片技术建立相应的检测方法,并构建了检疫性真菌分子检测标准物质,最终建立了大豆检疫性真菌、病毒和转基因成分一揽子检测技术体系,据此首次成功搭建了基于单一作物所有检测对象的高通量检测平台,取得如下结果:(1)针对大豆上的6种检疫性真菌和1种危险性真菌,对73种128个供试真菌菌株进行特异性测试,成功建立了大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、南美大豆猝死综合症病菌、大豆茎褐腐病菌和大豆拟茎点种子腐烂病菌的单重实时荧光PCR检测方法。(2)针对大豆上的5种检疫性病毒,对11种22个供试病毒菌株特异性测试,成功建立了烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、南芥菜花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的常规PCR和实时荧光单重PCR检测方法。(3)在大豆检疫性真菌单重实时荧光检测方法基础上,首次成功建立了大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种子腐烂病菌的4重实时荧光PCR检测方法,实现一次PCR可同时检测四种目标真菌,检测灵敏度均达到100 fg。(4)综合利用滚环扩增和基因芯片检测技术首次分别建立了大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、南美大豆猝死综合症病菌和大豆茎褐腐病菌等6种真菌同时检测方法;烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、南方菜豆花叶病毒、南芥菜花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒等5种检疫性病毒同时检测方法;并针对Lectin基因、35S启动子、Nos终止子、CP4EPSPS基因及Roundup Ready 品系等5种转基因结构基因和品系特异性基因的同时检测方法;以及针对以上所有检疫性真菌、病毒和转基因成分共16个目标同时检测的高通量方法。所建立检测方法仅需要8小时,大幅度缩短了检测时间,提高了检测效率。
朱常香[3]2005年在《烟草病毒的检测和防治新技术研究》文中研究表明烟草病毒病是全世界烟草栽培区发生普遍,危害严重的一大类病害。目前世界上已报道发现的侵染烟草的病毒达47 种,我国有17 种。在田间,常表现为多种病毒混合侵染,给烟草生产造成重大损失,重病田减产20～50%,夏烟减产70%以上。对病毒病的快速检测和监控技术是病毒病防治的基础性工作,可提高病毒病防治的针对性和时效性;而植物抗病毒基因工程的发展,特别是RNA 介导的病毒抗性策略的提出,为植物病毒病的防治提供了新的途径。围绕着烟草病害的防治,本研究进行了两方面的探索。其一,分离、提纯马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯X 病毒(PVX)、烟草环斑病毒(TRSV),克隆了6 种病毒的外壳蛋白(CP)基因,并进行了序列分析,首次明确了PVY、PVX 和CMV 山东分离物在分类学上的归属地位。制备了不同病毒的抗体和酶标抗体,建立了以点免疫结合技术(DIBA)为基础的快速、多元的病毒检测体系,对山东烟草病毒病进行了初步调查,明确了主要病毒种类。其二,RNA 介导的病毒抗性策略应用于烟草病毒病防治的研究。在已获得不同抗病类型的转非翻译PVY-CP 基因烟草的基础上,研究了RNA 介导的病毒抗性遗传及外源基因的整合方式与RNA 介导的病毒抗性产生的关系,明确了RNA 介导的病毒抗性可稳定地遗传;揭示了转基因的结构对于诱发病毒抗性产生可能起关键的作用,并进而设计了发夹结构DNA 进行了验证。在此基础上,以烟草上危害最为严重的PVY、CMV和TMV 为材料,克隆并构建了包含3 种病毒部分CP 基因的发夹结构DNA 的植物表达载体,转化烟草,首次培育获得了抗3 种病毒转基因烟草。研究结果将为烟草病毒病的防治提供理论依据和技术支持,具有很好的理论和应用价值。具体研究结果如下:1. 烟草病毒的检测新技术研究—烟草病毒病快速、多元检测技术的建立及应用1.1 病毒的分离从山东感病的烟草和马铃薯上,分离纯化了马铃薯Y 病毒(PVY-SD-TA)、马铃薯X 病毒(PVX-SD1)、烟草花叶病毒(TMV-SD1)、烟草蚀纹病毒(TEV-SD1)、黄瓜花叶病毒(CMV-SD1)和烟草环斑病毒(TRSV-SD1)等6 种烟草上常见的病毒。1.2 病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析
马平[4]2009年在《云南省外来入侵物种调查及检疫性有害生物的风险分析》文中研究表明外来生物入侵是国际性问题,引起了国际上公众、科学家、有关组织和各国政府的广泛关注。鉴于云南省外来入侵生物的严重危害现状和严峻发展趋势以及我省对防止生物入侵的紧迫需求和我国现在对区域性有害生物入侵的风险分析工作很少的情况,为了保护云南农林业的健康发展和生态环境,促进对外贸易,把好云南边境口岸一线的国门关,本文通过对云南外来入侵物种的调查与分析,针对潜在的和局部危害的检疫性有害生物,进行入侵风险分析的研究,加强外来有害生物的预警,对控制云南省外来入侵物种的危害,有重要的意义。本文主要的结果和结论如下:1.云南外来入侵物种现状通过早期实地调查和查阅文献资料整理分析,云南省共查明外来入侵物种209种,植物158种,占全省外来入侵物种的75.6%。无脊椎动物22种,占外来入侵物种的10.53%。病原微生物13种,占外来入侵物种6.22%,脊椎动物16种,占外来入侵物种的7.66%。2.云南边境口岸截获有害生物情况通过云南口岸截获统计资料整理分析,1998年~2007年,云南省进境植物检疫中共截获有害生物479种,其中昆虫361种,占75.3%;线虫44种,占9.2%;真菌42种,占8.8%;病毒7种,占1.4%;杂草10种,占2%;螨类9种,占1.9%;其它6种,占1.3%。3.云南地区经济水平与外来入侵物种的关系研究研究为探讨地区经济因素对当地的外来入侵物种数量的关系,通过线性回归的方法对云南地区经济指标(GDP和进出口贸易额)同当地的外来入侵物种数量的关系分析进行了分析,构建了线性方程,分别为:y=3.289+0.077504x;y=3.5593+0.095914x。结果表明,地区的GDP值与外来入侵物种数量无线性关系,而进出口贸易额与外来入侵物种数量存在显着的线性关系。根据分析结果,提出了防止外来物种入侵的一些措施。4.云南外来入侵有害生物多指标综合评价体系的建立研究以国际植物检疫措施标准(ISPMs)为依据,通过对云南外来有害生物入侵现状的分析,总结国内外在有害生物风险分析中的研究成果,建立云南外来入侵有害生物多指标综合评价体系。该体系中的目标层(R值),包含了5个准则层(Pi),其下级为指标层(Pij),由17个多指标因子组成,并根据各层次之间的相互关系建立数学模型。R值的分值范围在0和3之间,并对其进行4个等级分级:0.5(不含0.5)以下为低度风险,0.5~1.5(不含1.5)为中度风险,1.5~2.5(不含2.5)为高度风险,2.5以上为极高风险,以此为据确定云南入侵有害生物风险等级。5.云南重要检疫性有害生物的风险评估外来入侵生物已引起了云南省的重视,尤其是外来入侵害虫,给云南农业生产带来了巨大损失。通过实验筛选,选择21种重要的检疫性有害生物,利用云南检疫性有害生物多指标综合评价体系进行风险评估,给出了量化的风险值,并针对不同物种和风险值提出了相应的风险管理措施。6.基于GIS与气候相似性的谷班皮蠹在云南适生区的预测根据谷斑皮蠹生物学及生态学特性的研究,利用气候相似距原理分析该虫在气候因子影响下云南可能适生分布地区,结合运用GIS对谷斑皮蠹的寄主在云南分布的分析,利用GIS将气候适生区和寄主分布区图层迭加,得出了谷斑皮蠹在云南的可能适生区。结果表明,谷斑皮蠹在云南可能的适宜分布范围主要在云南南部的热带和亚热带气候地区,适生区主要有思茅、西双版纳、红河、楚雄、临沧、德宏等地区,云南的东北和西北地区无明显的谷班皮蠹适生环境。
高焕利[5]2007年在《番茄黑环病毒和建兰花叶病毒检测方法的研究》文中研究表明番茄黑环病毒(Tomato black ring nepovirus, TBRV)和建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是我国进境植物检疫法规中明确规定的危险性有害生物。目前,国内在两种病毒的检疫检测方法如生物学检测、电镜检测、血清学检测、分子生物学以及分子检测方法的灵敏度的报道相对比较少。本文就两种病毒的检疫检测方法进行研究,取得了以下的成果。1研究结果表明:通过汁液摩擦接种的方法接种几种鉴别寄主,筛选出检测TBR的一套鉴别寄主。2建立了TBRV酶联免疫吸附检测方法;首次建立了TBRV的免疫电镜观察方法,在血清学检测阳性的样品中可清楚观察到病毒粒子,病毒粒子球形。3根据国际基因库中已公布的TBRV的外壳蛋白基因和运动蛋白基因,设计了4对特异性引物,首次建立了TBRV的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕获反转录(IC-RT-PCR)检测方法;选取了TBRV的3个分离物的保守区段,设计了特异性引物和MGB探针,建立了TBRV的实时荧光PCR检测方法;采用质粒稀释梯度的方法来进行TBRV的分子生物学的灵敏度检测,灵敏度检测结果表明:能检测TBRV最低病毒量为:10-8ug/ml水平,与普通的PCR相比,检测的灵敏度提高了100倍。4根据已经公布的CymMV的外壳蛋白的序列设计了两对引物,采用RT-PCR、IC-RT-PCR方法对口岸进境后监管的兰花上的建兰花叶病毒进行分子生物学检测。RT-PCR、IC-RT-PCR方法结合序列测定,可以准确的检测建兰花叶病毒;质粒稀释方法对CymMV的分子生物学检测的灵敏度的结果表明:检测到的CymMV的最低病毒含量为10-7μg/ml水平,即检测的最小拷贝数为428个。
蔡群芳[6]2006年在《利用RNA介导技术培育番木瓜广谱抗环斑病毒品种（系）的初步研究》文中指出番木瓜是着名的热带亚热带水果之一,素有“岭南佳果”的美称,而番木瓜环斑病毒(PRSV)现已成为制约番木瓜生产的世界性严重病害的病原。PRSV是植物病毒中最大—马铃薯Y病毒属的一个重要成员,是引起番木瓜病毒病的最主要的病毒之一。为研究番木瓜高抗谱抗病毒的机制以及培育出适合在我国栽培的高抗谱抗环斑病毒且安全性好的番木瓜新品系。本项目采用RNA介导抗病毒基因工程策略,通过对海南、云南、广西和广东等不同番木瓜生产区的PRSV-CP的序列进行分析比较,并且利用RT-PCR方法克隆了PRSV-CP同源区段,设计特异引物克隆PRSV-CP的3’端278bp高度同源的DNA区段,并构建六种RNA介导的植物表达载体,分别为:p2301CP+、p2301CP-、p2301CPu、p2301CPuL、pBCP+、pBCP-。然后采用花粉管通道技术将含有CP基因同源DNA片段的表达载体导入soloⅡ,并对导入时花朵大小、导入液类别、环境因子等参数进行了较系统的探研,获得了比较理想的导入条件:①均在晴朗的天气,气温不宜超过30℃,也不宜低于10℃;②花粉供体花一般采用两性花;③质粒导入液的浓度为1μg/μL,受体花一般长为2.0-4.0厘米;④农杆菌为导入液的OD值一般为0.8-1.0,另附加Silwet L-77(0.5μl/mL),受体花一般长3.0-4.5厘米;从而建立了利用质粒DNA和农杆菌为导入液的花粉管通道技术平台。目前已经获得了6种载体的转基因番木瓜果实以及转基因幼苗,并且通过PCR检测初步检测到了部分阳性植株。这为获到广谱抗番木瓜环斑病毒的优良新品种(系)打下了良好的研究基础。
董文勇[7]2013年在《进境台湾葡萄有害生物风险分析研究》文中研究指明葡萄是世界重要的果树树种，其栽培面积和产量曾长期位居世界五大重要水果之首。台湾葡萄约在300多年前的清朝初年由先民自大陆引入，但其真正发展仅50余年。台湾虽然地处亚热带至热带地区，地理位置及气候条件均在葡萄适栽范围之外，但经数十年栽培经验的积累，已成功发展出亚热带地区独特的栽培模式。目前栽培种绝大多数为葡萄Vitis viniferaL.和美洲蘡薁V. labrusca L.的杂交种。台湾葡萄以进口为主，但也有少量出口，日本和泰国为两大主要出口市场，近年欲开辟中国大陆这一新兴出口市场。本研究应台湾欲出口葡萄至大陆的要求，通过分析其提供的葡萄技术资料，查阅相关专着、数据库（如CABI、维普、TaiBNET）以及重要国际与国家组织官网（如EPPO、NLBIF、ScaleNet），按照《检疫性有害生物风险分析，包括环境风险和活体转基因生物分析》（ISPM第11号）提出的分析方法和步骤，并部分参考孙楠等建立的进境水果果实有害生物风险分析实用方法中的分析要素，运用半定量方法对进境台湾葡萄开展有害生物风险分析，经过风险评估，确定高风险5种，即香蕉肾盾蚧、木槿曼粉蚧、日本臀纹粉蚧、烟草环斑病毒和番茄环斑病毒；中风险9种，即螺旋粉虱、橘小实蝇、槟栉盾蚧、刺盾蚧、台湾黄毒蛾、丝鳞粉蚧、南洋臀纹粉蚧、大洋臀纹粉蚧和美澳型核果褐腐病菌；低风险3种，即腹突皱针蓟马、葡萄苦腐病菌和葡萄枝枯病菌。根据ISPM第11号中“检疫性有害生物”的定义，均将其列为进境台湾葡萄检疫性有害生物。根据上述风险评估结果，对于超过“很低”风险的有害生物，提出一系列风险管理措施：包括果园管理、包装厂管理、包装要求、冷处理要求、出口前检疫和证明文件要求在内的装运前要求；包括证明文件核查和进境检验检疫在内的进境要求；以及不符合要求的处理。这些措施的实施，可将进境台湾葡萄的风险降至可接受水平。
刘勇[8]2006年在《云南烟草病毒检测及防治研究》文中指出烟草病毒病是危害烟叶生产最重要的病害之一，危害烟草的病毒种类多达30多种，花叶型病毒病田间常见，曲叶型病毒病的危害呈上升趋势。为了弄清云南烟草病毒病的种类，对云南省烟草花叶型和曲叶型病毒病样品进行了血清学和分子检测，并对烟草病毒病控制进行了研究。采用抗原直接包被法和双抗体夹心法对采自云南烟草花叶病样本进行了病毒种类检测，并利用叁抗体夹心法对黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的亚组类型进行了鉴定。在云南采集的520个病毒病样本中，烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、CMV和马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)总检出率分别为71.74％、55.01％和6.35％，云南、湖南和福建64个CMV阳性样品中，属亚组Ⅰ的样品为57个，占89.1％，属亚组Ⅱ样品为10个，占15.6％。采用烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus，TbCSV)、云南烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Yunnan virus，TbLCYNV)、中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV)的特异引物，对云南烟草曲叶病样本的病原进行了PCR检测；采用粉虱传双生病毒PA和PB通用引物，对代表性样品进行了扩增、克隆测序和序列比对。检测表明云南烟草曲叶病是由TbCSV、TbLCYNV和TYLCCNV叁种病毒引起的。109个烟草曲叶症状的样本中，TbCSV总检出率为41.3％、TbLCYNV总检出率为16.5％、TYLCCNV总检出率为53.2％。其中两种或叁种病毒复合侵染的检出率为8.2％。500 bp序列比较表明，这些病毒分离物之间的相似性为77％～100％。依据500 bp序列构建的同源关系树上，所有TYLCCNV的分离物因地理隔离聚为两大类，一类为保山分离物，相互间核苷酸序列相似性为93％，另一类为文山和红河分离物，相互间核苷酸序列相似性为95％，两类之间核苷酸序列相似性为89％。对其中一个分离物Y264 DNA-A的全序列测定表明，Y264 DNA-A全长2741个核苷酸(nts)。具有典型的begomoviruses结构，共编码6个开放读码框(ORFs)。DNA-A全长与中国番茄黄化曲叶病毒分离物Y10的相似性最高，为91.3％，各ORFs编码的氨基酸序列与TYLCCNV的相似性最高。因此，Y264为TYLCCNV的一个分离物。采用叁抗体夹心法对云南烟草漂浮苗样本进行了病毒种类检测，在云南采集的1400多个烟草漂浮苗样本中，TMV的检出率占总阳性样本数的95％以上；CMV和马铃薯Y属病毒(包括PVY和TEV)的检出率占总阳性样本数的5％以下。在漂浮苗移栽后至团棵期，在发病率高(20％以上)的田块中采集的480个花叶病样本中，不同田块TMV检出率48.1％～100％，而CMV和马铃薯Y属病毒(包括PVY和TEV)检出率0％～12.2％。表明危害云南烟草漂浮苗的主要病毒种类为TMV。采用半叶法测定了9种药剂对烟草病叶汁液中TMV的钝化效果，采用叶面喷雾法测定了药剂对烟草的药害浓度与药害症状。室温下一定浓度的药剂与1：10000的TMV病叶汁液等体积混合3 min时，30％有效氯漂白粉10倍液、98％磷酸叁钠·12H_2O 10倍液、7％有效氯次氯酸钠150倍液、美国消毒剂125倍液和75％酒精TMV的抑制率可达100％；10％二氧化氯200倍液和40％育宝150倍液与TMV混合30 min时对TMV的抑制率可达100％和96.30％；0.6％菌毒净125倍液、3.95％病毒必克800液和24％毒消800倍液与TMV混合30 min时对TMV的抑制率低于80％。除0.6％菌毒净较安全外，供试消毒剂在常用浓度下接触烟草叶片，产生较严重药害，症状因消毒剂种类不同，主要为褪绿斑点、坏死斑点和畸形。试验了在漂浮育苗池中使用消毒剂对TMV的钝化效果和烟苗出苗和生长的影响。枯斑寄主测定表明：与TMV病叶汁液2万倍稀释液接触12 hr，对TMV的抑制率高于80％的消毒剂及浓度为：30％有效氯漂白粉15 mg／L和150 mg／L；7％有效氯次氯酸钠2μl／L和20μl／L；美国消毒剂5μl／L和50μl／L。漂浮池水中加入低浓度消毒剂，出苗率和成苗率与对照差异不显着，但对烟苗后期长势的影响因消毒剂种类而有差异。对烟苗长势有促进作用的消毒剂有：磷酸叁钠15mg／L～300mg／L、硫酸铜50mg／L～100mg／L、高锰酸钾10mg／L～40mg／L和24％毒消10μl／L。对烟苗长势低浓度无明显影响而高浓度有抑制作用的消毒剂有：40％育宝、30％有效氯漂白粉、7％次氯酸钠、美国消毒剂和0.6％菌毒净。为避免消毒剂对烟苗生长的影响，池水中消毒剂使用终浓度不能超过下列浓度：40％育宝100μl／L、30％有效氯漂白粉300mg／L、7％次氯酸钠20μl／L、美国消毒剂50μl／L、0.6％菌毒净100μl／L。
青玲[9]2005年在《双生病毒及伴随卫星DNA之间的互作》文中进行了进一步梳理本论文对中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10分离物(Y10)和烟草曲茎病毒(TbCSV)Y35分离物(Y35)及其伴随的卫星DNAβ(Y10β及Y35β)分子之间的互作及DNAβ分子的变异进行了研究。 将Y35+Y35β、Y35+Y10β、Y10+Y10β及Y10+Y35β分别接种本氏烟、心叶烟及三生烟,Southern印迹分析表明,Y10β及Y35β均可被异源辅助病毒复制,但Y10β或Y35β作为异源DNAβ分子时的积累量明显低于伴随其同源辅助病毒时的积累量。症状观察表明,无论Y10还是Y35伴随同源或异源DNAβ时诱导的症状明显不同,Y10β及Y35β作为异源卫星时与其辅助病毒诱导的症状也不同于与其同源辅助病毒引起的症状,且Y10β伴随异源病毒Y35时致病性更强,Southem印迹显示,病毒及卫星的积累量并不完全与症状严重程度直接相关。 当Y10β及Y35β同时伴随Y10或Y35侵染本氏烟及心叶烟时,PCR及Southem印迹显示,异源DNAβ到侵染后期均丢失。当两种病毒同时伴随Y10β或Y35β共同侵染本氏烟时诱导的症状比一种病毒伴随一种卫星引起的症状轻,表明有拮抗作用发生,但侵染心叶烟仅在前期观察到拮抗现象,PCR及Southem印迹显示Y10在侵染后期已丢失,而本氏烟中两种病毒及卫星均存在。当两种病毒伴随两种卫星共同侵染本氏烟及心叶烟时,在整个侵染过程中两种病毒及卫星在本氏烟中始终存在,而在心叶烟中仅在侵染前期能检测到Y10及Y10β。 对Y10β及Y35β伴随不同辅助病毒及在不同寄主中的种群变异的研究表明,与伴随同源辅助病毒时相比,Y10β及Y35β伴随异源辅助病毒时其种群结构具有更强烈的变异趋势及更丰富的种群遗传多样性,且Y35β及Y10β种群在两种不同寄主中的变异水平存在差异,表明病毒及寄主在卫星DNAβ种群进化中可能具有重要作用。变异数据分析显示,Y10β及Y35β种群基因组内在SCR区及βCl编码区内均没有任何位点发生突变,而突变区域主要集中在A-Rich区。Y35β及Y10β种群中突变类型是多样化的,包括碱基替代、插入或缺失,还发现有多个克隆在同一核苷酸位点发生相同类型的突变,这种突变积累现象的生物学意义及其在病害流行中的作用有待进一步研究。 Y10β及Y35ββCl基因缺失突变体(Y10△Clβ及Y35△Clβ)能介导对同源
于云奇[10]2017年在《小RNA深度测序在柑橘新发病毒的鉴定及TuMV诱导的抗病毒新机制中的研究》文中研究说明我国果树资源丰富,各类水果总产量位居世界首位,因此其经济重要性不言而喻。病毒病害可影响果树植株的正常生长,甚至给相关产业造成严重损失。果树病毒病害种类较多,其中部分病害的病原至今未能确认,因此果树病毒病害的检测与鉴定对于生产及防治至关重要。果树病毒往往缺乏相应的草本寄主,在木本植物内的复制积累量低,分布不均且具有季节性差异,存在潜伏侵染的现象,且果树组织中多富含多糖多酚等复杂成分,这些因素限制了传统病毒检测方法在果树病毒上的鉴定工作。高通量测序技术(如小RNA深度测序技术)的发展大大加快了果树病毒检测和鉴定的效率,用于可鉴定包括柑橘在内的果树未知病毒,挖掘更多病毒种类。小RNA(small RNA,sRNA)深度测序技术具有快速、准确及高通量等优点,为植物病毒快速检测鉴定的新方法。本研究利用sRNA深度测序技术,鉴定两种不同种类的柑橘病毒,并以此探讨该技术在果树病毒鉴定中的应用;同时本文将对病毒侵染寄主植物(拟南芥及柠檬)后sRNA表达谱进行分析,以期为果树病毒的致病机理的研究及其防治提供新思路。通过sRNA深度测序技术,从采自重庆地区的表现黄化脉明症状的柠檬样品中鉴定到柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)。通过序列拼接最终获得了该病毒全长基因组序列,研究发现其分离物CQ与CYVCV土耳其分离物Y1、云南分离物YN及巴基斯坦分离物PK的序列一致性分别为97.3%、98.8%及97.6%,同时对病毒编码的开放阅读框(Open reading frame,ORF)也进行了分析。聚类分析表明,分离物CQ属于甲型线性病毒科(Alphaflexiviridae)柑橘病毒属(Mandarivirus)。除此之外,本文首次分析了CYVCV侵染柠檬后的病毒小RNA(virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs)表达谱特征,CYVCV vsiRNAs以21-及22-nts两种为主,它们在CYVCV基因组上连续且不均匀分布,源于病毒负链的vsiRNAs丰度比正链高。本研究对CYVCV vsiRNAs 5’-端碱基偏好性也做了分析,结果暗示了这些vsiRNAs可能与柑橘体内不同的Argonaute(AGO)蛋白结合进而行使各种生物学功能。该样品为CYVCV单独侵染。柑橘褪绿矮缩病(Citrus chlorotic dwarf disease,CCDD)也是柑橘上发现的一种病毒病害,最早发现于土耳其。本章继续利用sRNA深度测序技术对采自中国云南地区的表现褪绿畸形症状的柠檬样品进行病原鉴定。对sRNA表达谱分析后发现,类似于CYVCV,源自于病毒的contigs几乎覆盖了分离物CCDaV-TK4(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV,GenBank No.JQ920490)的全基因组。通过引物设计及实验成功获得该病毒基因组全长信息,全长为3642-nts。序列分析发现其与分离物CCDaV-TK4的基因组核苷酸序列一致性高达99.3%,其基因组与其它双生病毒结构类似,如单链环状dna、茎环结构及其内部的九核苷酸序列等。聚类分析表明该分离物ccdav-cn001属于双生病毒科(geminivididae)。本研究同样分析了ccdavvsirnas的表达谱,vsirnas以22-、21-及24-nts为主,病毒正义链vsirnas的丰度要高于反义链。结合vsirnas表达谱,预测并验证了该病毒基因组反义链存在一个内含子结构。分离物ccdavcn001是ccdav的第二条全长基因组序列,其发现丰富了ccdav的序列信息。通过上述两种不同种类柑橘病毒的鉴定,表明了srna深度测序技术在果树病毒快速鉴定方面的优势,同时对两种病毒vsirnas表达谱的分析,进一步加深和推动了我们对柑橘抗病毒分子机理的理解。基因沉默是真核生物体内广泛存在的一种基于srna活性的基因表达调节机制,目前抗病毒基因沉默的研究多集中在草本植物上,木本植物上的研究相对较少。本研究将继续利用小rna深度测序技术对拟南芥的抗病毒机理进行分析研究,以期为包含柑橘在内的果树抗病毒分子机理研究提供思路。本章研究对象为芜菁花叶病毒(turnipmosaicvirus,tumv-gfp),它是侵染十字花科植物的一种重要病毒。本研究通过对tumv-gfp侵染拟南芥后诱导的小rna表达谱进行分析,发现与黄瓜花叶病毒突变体病毒(cucumbermosaicvirus-Δ2b,cmv-Δ2b)侵染拟南芥的结果类似,tumv-gfp侵染拟南芥后也能够诱导一类21-ntssrna的富集,此类srna由拟南芥1000多个编码基因产生,主要集中于基因的编码区域和及核糖体rrna的负链,由于此类srna是由病毒诱导所致,因此它们被命名为vasirnas(virus-activatedsirnas)。进一步数据分析及杂交实验验证了vasirnas的合成依赖于rdr1(rna-dependentrnapolymerase1)及dcl4(dicer-like4)。拟南芥突变体ein5(ethylene-insensitive5)健康植株本身可以产生一类21-ntssrna,而当接种tumv-gfp后ein5中vasirnas的积累量明显提高,表明ein5可以增强vasirnas通路;tumvmrna在ein5植株中的积累量降低和在rdr1中积累量升高,表明此通路可能具有抗病毒活性。cmv-Δ2b与tumv-gfp侵染拟南芥后诱导的rdr1共同靶标基因有369种,表明两种病毒侵染拟南芥均可诱导上百种内源基因产生vasirnas,该结果暗示了拟南芥的vasirnas合成通路针对不同病毒的侵染可能具有普遍性。vasirnas可导致寄主内源基因表达下调,基因功能分析发现这些内源基因多与植物基本的生命活动相关,推测这些编码基因的表达为病毒提供了其复制增殖需要的能量及原料,寄主关闭这些内源基因或对病毒在寄主细胞内的复制增殖造成不利影响,从而起到抗病毒的作用。本研究试图探究拟南芥vasirnas通路在柑橘上是否同样具有普遍性,以cyvcv侵染柠檬后的小rna表达谱为研究对象,以甜橙作为参考基因组,分析发现来源于柠檬编码基因及rrna区域的21-ntssrna,其丰度在cyvcv侵染前后基本不变,该结果说明CYVCV侵染柠檬后,并没有产生类似于拟南芥vasi RNAs的通路或柠檬体内vasiRNAs通路不明显,其背后原因尚待进一步研究。该结果为vsiRNAs机制在果树寄主上的首次尝试。
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[10]. 小RNA深度测序在柑橘新发病毒的鉴定及TuMV诱导的抗病毒新机制中的研究[D]. 于云奇. 西南大学. 2017