赵新利[1]2003年在《人胚脑组织神经干细胞的分离培养与鉴定》文中研究说明神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)是一种终生具有自我更新能力的细胞，可增殖分化产生中枢神经系统的3种基本细胞：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs的发现和深入研究可能为治疗神经系统疾病带来新的契机。但是，在中枢神经系统中，发育阶段不同、部位不同，NSCs所占的比例不同，且普遍比例较低。自NSCs被发现以来，建立体外培养体系，用不同的因素刺激NSCs快速增殖，获取大量的NSCs，寻找影响NSCs分化的不同因素，提高神经元在分化中所占的比例，是国内外许多学者一直研究的方向和目标。白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)是一种多功能的糖蛋白，其分子量为20kD，含有180个氨基酸残基，它能够诱导巨细胞的分化并抑制鼠M1骨髓瘤细胞的增殖。LIF与IL-6(Interleukin-6)、G-CSF(Granulocyte-colony stimulating factor)一起在造血干细胞(Hematopoietic stem cell)的早期调控中具有重要作用。神经节苷脂(Gangliosides)是细胞膜的重要组成成分，在中枢神经系统中含量较高。神经节苷脂与多肽生长因子一样，被认为是与神经细胞发育、分化、存活及病理的所有阶段相关联的营养单位。由于它们调控过程复杂，它们在许多方面的生理角色尚未被揭示。单唾液酸四己糖神经节苷脂(Monosialotetrahex-osylganglioside，GM-1)是哺乳动物神经节苷脂的主要种类，外源性GM-1能够通过血脑屏障，嵌入损伤的神经细胞膜，具有明显的抗神经细胞损伤、促修复和促神经细胞生长的作用。近年来，国内外有关NSCs的研究，多数停留在鼠的NSCs，对人胚NSCs研究相对较少，LIF对NSCs增殖郑州大学2003届硕士研究生毕业论文人胚脑组织神经干细胞的分离培养与鉴定和分化的影响，国外学者做了一些研究工作，而国内文献报道较少，GM一1对人胚中枢神经系统NSCs的作用更为鲜见。本实验，机械分离10周人胚脑室区/脑室下区(V entricular zone/subventricular zone，Vz/Svz)组织，用无血清培养基(各组添加成分不同)对NSCs进行培养，比较不同培养条件下细胞生长情况;在相同或不同条件下诱导细胞分化，比较分化后神经元及神经胶质细胞所占比例;探讨了机械分离法对NSCs培养的适用性和LIF、GM一1对NSCs生长和分化的影响。用免疫细胞化学法检测培养细胞的神经上皮干细胞蛋白困euroePithelial stem cen Protein，Nestin)和增殖细胞核抗原(Proliferating eell nuelear antigen，pCNA)及分化后细胞的神经元特异性烯醇化酶(Neuronspeeifie enolase，NSE)或胶质纤维酸蛋白(Glial fibrill娜acidie拼otein，GFAp)，对NSCs进行了鉴定。 方法:取材于10周人胚VZ/SVZ组织，使用机械分离法分散脑细胞，按基础培养基(DMEM邝12+BZ:)中添加成分的不同，分五组:A组加入bFGF(20ng/ml)，B组加入bFGF(2 ong加l)+EGF(20ng/ml)，C组加入bFGF(20ng/ml)+EGF(ZOng/ml)+LIF(1 on留ml)，n组加入bFGF(Zong/ml)+EGF(Zong/inl)+GM一1(33.5n留ml)，E组为GM一l(33.5ng/ml)，每组两瓶，置入COZ培养箱(5%C02，37℃)进行培养。①自A组、B组、C组中分别取少量细胞悬液，均调制成细胞密度为1 xl护个/m1，接种于%孔培养板，每组12孔，每孔0.lml，置入CO:培养箱培养。于培养的4d、sd用MTT比色法检测各组OD值，了解LIF对NSCs增殖的影响。②自B组、D组、E组中分别取少量细胞悬液，另增加F组(含基础培养基，无添加成分)作为阴性对照，四组均调制成细胞密度为IX10，个/ml，接种于96孔培养板，每组12孔，每孔0.lml，置入eoZ培养箱培养。于培养的4d、8d用MTT比色法检测各组OD值，了解GM一1对NSCs增殖的影响。③对A、B、C、D、E五组来源的NSCs在相同的条件下进行诱导分化或④对同一培养来源(B组)的NSCs在不同的条件( bFGF、LIF、GMI叁个浓度、5%胎牛血清)下诱导分化，用免疫细胞化学方法检测NSE和GFAP表达阳性率，了解LIF、GM一1对NSCs分化方向的影响。⑤对培养的细胞用免疫细胞化学方法检测Nestin和PCNA，结合细胞培养传郑州大学2003届硕士研究生毕业论文代和分化情况，鉴定NSCs。人胚脑组织神经干细胞的分离培养与鉴定 结果:①LIF对NSCs增殖的影响，MTT比色法检测结果显示:C组活力最高，A组活力低于与B组和C组;C组与A组比较有显着性差异(尸<0.05);C组OD值虽高于B组，但二者比较差异无显着性(P>0.05)。②GM一1对NSCs增殖的影响，MTT比色法检测结果显示:D组OD值高于B组，两者之间比较有显着性差异(P<0.05);E组OD值高于F组，两者比较有显着性差异(尸<0.05)，E组OD值与B组比较，无显着性差异 (P>0.OS)。③不同培养基、相同诱导分化条件下，分化结果显示:A组、C组分化后，NsE十率高于B组、D组和E组，GFAP+率低于B组、D组和E组;C组与A组间两项指标的比较无显着性差异(P>0.05)，C组与B组间两项指标的比较有显着性差异(尸<0.05):D组、E组与A组间的比较均有显着性差异(P<O、05)，与B组间的比较均无显着性差异 〔P>o.05)。④同一培养基(B组)来源、不同诱导分化条件下分化结果显示:分化的4d和sd，bFGF组、LIF组NSE+率明显高于其余四组;LIF组与5%
唐少锋[2]2003年在《胎鼠和人胚神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究》文中研究说明脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）所致的完全性截瘫，至今尚无有效的治疗办法。SCI的修复和治疗研究，已经进行了半个多世纪，目前仍然是一个难以解决的世界性难题。研究表明：SCI后的功能恢复关键在于中枢神经再生。而中枢神经再生依赖于两个条件，即有存活的、具有生长潜能的神经元和能促进神经纤维再生的适宜微环境。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的发现为SCI的修复和治疗研究带来了新的希望。与其它干细胞一样，NSCs具有分裂增殖和自我更新能力，在适宜条件下或给予适当的信号能够分化为各种神经细胞。NSCs的自身特点决定了它可以作为神经移植材料的理想来源和基因治疗的理想载体。与较早使用的成纤维细胞、雪旺氏细胞以及目前的另一研究热点--嗅球鞘细胞等其它替代材料相比，移植到损伤局部的NSCs不仅可以起到支架作用，还可以分化为神经元参与补充丢失的神经细胞，分化为少突胶质细胞使再生或脱髓鞘的轴突重新髓鞘化。必要时可进行移植前预分化或调整宿主微环境。如果与基因疗法相结合，把NSCs作为基因治疗的载体细胞，替代的同时表达和分泌特定的目的基因产物，如神经营养因子或轴突生长抑制因子抗体等，就可以提供一种合适的微环境，刺激轴突生长。NSCs的研究为SCI修复和治疗带来诱人的应用前景，而进行这些研究的前提和基础是NSCs的培养。为此本实验第一部分进行了胎鼠NSCs的分离培养，在证实其自我更新能力和多分化潜能的同时检测NSCs特异的Nestin表达以证明本实验分离得到了胎鼠NSCs。由于人和啮齿动物之间存在较大的种属差异，不可能将啮齿动物NSCs最终用于临床实验研究，因此借鉴培养胎鼠NSCs的经验，本实验第二部分进行了人胚NSCs的分离培养，并证实其具有自我更新能力和多分化潜能，依据干细胞的定性标准证明本实验从人胚神经组织分离的细胞群为NSCs。以期为NSCs的体内实验以及移植修复SCI的实验研究奠定基础。第一部分 胎鼠神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究本实验从孕14～16天的胎鼠脑皮质分离细胞，接种于含有bFGF的无血清培养基培养并连续传代，通过倒置显微镜观察细胞形态和一般生长状态；利用透射电镜了解NSCs的超微结构和神经细胞球（neurosphere）的内部结构；采用免疫荧光细胞化学技术、RT-PCR和基因测序法共同检测NSCs标志物Nestin的表达；综合应用单细胞克隆实验、BrdU标记法、流式细胞仪和MTT比色法检测细胞的增殖情况及bFGF对其增殖能力的影<WP=9>响，推测bFGF的作用机制；诱导NSCs分化以证实其多向潜能性，同时设置对照组观察血清对分化表型的影响。实验结果显示：培养细胞以悬浮细胞球的形式生长，单个细胞的超微结构呈现典型的低分化特点，可见不对称分裂细胞，在细胞球内部，除少量凋亡样细胞外，相互间的细胞结构无显着区别；免疫荧光染色观察到细胞球内大量Nestin抗原阳性细胞，RT-PCR检测和基因测序更加确凿无疑地证明这些细胞表达Nestin；细胞克隆分析明确证实单个细胞可分裂增殖形成克隆细胞球；BrdU标记观测到细胞球中含有很多S期细胞及分裂增殖产生的新生细胞；流式细胞仪测定结果显示细胞传代后S期细胞比例及增殖指数（PI）增高；MTT比色法检测结果表明培养细胞具有很强的分裂增殖能力，添加bFGF的实验组干细胞增殖能力显着增强，与对照组相比具有显着差异（P<0.01）；这些细胞经诱导分化可生成中枢神经系统（central nervous svstem，CNS）中所有叁种主要的神经细胞：神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞；血清诱导分化产生的GFAP阳性细胞以类原浆性星形胶质细胞为主，而无血清诱导分化则以类纤维性星形胶质细胞为主。培养细胞经多次传代仍保持多潜能性。实验结果表明：本实验培养得到的细胞能够自我更新，具有多向分化潜能，并表达Nestin产物，证明就是NSCs；这些细胞具有很强的分裂增殖能力，单独使用bFGF即可在体外培养扩增，单个细胞具有形成克隆细胞球的能力；bFGF能够通过改变细胞周期促进NSCs分裂增殖；与对照组相比，血清可促进NSCs分化并影响分化细胞的表型，其机理还有待进一步研究。第二部分 人胚神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究本实验从流产的12周龄新鲜人胚胎脑皮质取材，机械分离制成单细胞悬液，采用无血清培养技术，添加B27，首次协同应用bFGF、EGF和LIF培养原代细胞，然后由N2添加剂取代B27，结合bFGF和LIF维持细胞的生长增殖及传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态和一般生长状况；利用BrdU标记法检测细胞的增殖能力；胎牛血清诱导分化检测细胞的多分化潜能。实验结果显示：原代细胞接种2-3天后，开始形成球形细胞团，并逐渐增多、增大，培养一周余即得到许多悬浮生长的细胞球；这些细胞具有一定的分裂增殖能力，传代后可继续生长形成新的细胞球；与胎鼠脑皮质NSCs相比，这些细胞增殖速度较慢；BrdU标记结果显示，部分细胞呈BrdU抗原阳性；血清诱导分化可生成CNS中所有叁种主要的神经细胞：神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。实验结果表明：12周龄人胚脑皮质含有多潜能的NSCs；本实验协同应用bFGF、EGF和LIF原代培养得到的细胞在bFGF和LIF的协同作用下可连续传代，仍保持其多潜能性；这些
陆华, 蒋云召, 苗宗宁, 周建宏, 唐志放[3]2002年在《人胚脑皮层神经干细胞的分离培养及鉴定》文中研究说明目的从人胚脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞。方法利用无血清培养和单细胞克隆技术在人胚脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞 ,并进行培养、传代、分化观察 ,采用间接免疫荧光检测克隆细胞的神经巢蛋白 (Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果从胚龄10周的新鲜人胚脑皮层中成功分离出神经干细胞 ,该细胞具有连续克隆能力 ,可传代培养 ,表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论人胚脑皮层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。
李学仲[4]2005年在《人胎脑神经干细胞的分离培养、分化及鉴定研究》文中指出目的:探讨人胚胎脑神经干细胞的体外分离培养条件情况,观察其增殖和分化特点。 方法:用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离出单个细胞后,采用无血清培养技术及单细胞克隆技术,协同应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27从8—16周龄人胚胎脑海马、大脑皮层分离出神经干细胞进行培养,用5%胎牛血清将其诱导分化,利用免疫荧光细胞化学化学技术对培养的神经干细胞及分化细胞进行鉴定。 结果:培养得到较大量悬浮生长具有连续增殖能力的神经干细胞,能够传代培养,表达神经干细胞的标志物Nestin;经血清诱导分化后分化为神经元和胶质细胞,表达特异性抗原NF200和GFAP。 结论:在体外培养条件下可以从人胚胎脑海马、皮层分离培养得到具有神经干细胞基本特征的细胞群,可能为临床应用提供材料,进一步用于缺血性脑损伤,为脑血管病的治疗开辟新的天地。
阳运康[5]2005年在《基因修饰人胚神经干细胞促进兔脊髓损伤修复的实验研究》文中进行了进一步梳理脊髓损伤(SCI)所致的完全性截瘫,临床至今尚无有效的治疗药物或手段。SCI的治疗和修复,目前仍是一个难以解决的世界性难题。研究表明,SCI后神经不能再生,关键是缺乏具有生长潜能的神经细胞和能促进神经纤维再生的合适微环境。神经干细胞的发现为SCI的修复和治疗带来新的希望。神经干细胞是一种具有生长和分化潜能的神经祖细胞,能进行分裂增殖和自我更新,在适宜的条件下能够分化为各种神经细胞。神经干细胞的自身特点决定了它可以作为神经移植的理想材料和基因治疗的理想载体。SCI后移植神经干细胞,不仅起到支架、营养作用,也能补充、替代缺失的神经细胞,还能分泌调节因子改善神经再生的微环境;与基因治疗相结合,把神经细胞作为基因治疗的载体细胞,替代的同时表达和分泌特定的目的基因产物,就可以提供一种更理想的微环境,刺激神经的生长。本实验第一部分进行了鼠胚与人胚神经干细胞的培养,并证实其具有自我更新与多分化潜能。本实验第二部分进行了人脑源性神经营养因子(BDNF)的提取,并利用逆转录病毒质粒载体PLEGFP构建了BDNF-PLEGFP质粒。因技术原因,未能生产出大量可用于转染的BDNF-PLEGFP病毒。然后利用PLEGFP质粒生产出大量携带EGFP基因的逆转录病毒,并将其转染培养的神经干细胞,使神经干细胞表达EGFP蛋白,并在荧光显微镜下直接观察到较强的黄绿色荧光。本实验第叁部分制作了兔T_9脊髓全横断模型,并移植经基因修饰表达EGFP的人胚神经干细胞,从形态结构、迁移分化模式及神经功能恢复等方面观察人胚神经干细胞移植对脊髓损伤后神经结构修复和功能恢复的作用并探讨其作用机制,为人胚神经干细胞移植治疗脊髓损伤的临床应用提供实验依据。 第一部分 鼠胚与人胚神经干细胞的培养 目的:从眙鼠与人工流产胚脑皮层分离神经干细胞(NSCs),经克隆及长期培养建立NSCs株并观察其生物学特性。方法:分离孕14天大鼠与10-20周人胚脑皮层来源的NSCs并连续传代培养,通过克隆试验、生长曲线观察、诱导分化实验及免疫组织
汪泱, 邓志锋, 赖贤良, 王共先, 黄学明[6]2004年在《人脑神经干细胞的分离培养及鉴定的研究》文中研究说明目的探讨分离培养人脑神经干细胞的方法及条件。方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,用无血清培养基进行体外培养,bFGF和EGF刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。该细胞可在体外培养条件下传代培养,并表达神经干细胞标志Nestin;分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志NSE。结论在体外培养条件下可从人胚脑中分离培养出神经干细胞。
李晓波[7]2004年在《人胚脑神经干细胞的分离培养和鉴定及bFGF、EGF对脑缺血大鼠自体神经干细胞增殖的影响》文中提出目的：探讨人胚脑神经干细胞的体外生长特性、分化情况和培养条件，为相关实验研究提供条件。 材料与方法：利用神经干细胞的条件培养基，对从9周和12周胚龄的自然流产胎儿分离的前脑、后脑进行神经干细胞培养，比较其生长特性，并分别观察在无生长因子的基础培养基以及含有胎牛血清的培养基中神经干细胞的分化情况。以免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)和分化后神经细胞抗原的表达。 结果：两胚龄前、后脑组织中均分离出神经干细胞，他们均表达Nestin抗原阳性。在无生长因子的基础培养基和含有胎牛血清的培养基中神经干细胞均发生分化，表达神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。9周胚龄的脑组织原代培养形成细胞克隆的比例高于12周胚龄的脑组织。在条件培养基存在的情况下，后脑组织分离的神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。 结论：从人胚脑组织的前、后脑中分离出神经干细胞；较小胚龄的脑组织原代培养时细胞克隆的形成比例较高；后脑组织分离的南京医科大学硕士学位论文神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。
蒋云召, 陆华, 惠国帧, 苗宗宁, 卞林[8]2003年在《高-低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞》文中研究说明目的 从大胚龄人胚脑中分离培养并鉴定神经干细胞。方法 采用高 低密度培养、无血清培养和单细胞克隆技术分离培养出神经干细胞 ,并应用免疫荧光染色鉴定。结果 从 13周龄胚脑中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞 ,它们具有连续克隆能力 ,可传代培养 ,表达神经巢蛋白抗原 ,分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少枝胶质细胞的特异性抗原。结论 高 低密度培养法能成功地分离和培养大胚龄人神经干细胞
祝畅, 张传汉, 刘志恒, 桂伶俐, 高峰[9]2006年在《人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定》文中进行了进一步梳理目的:探讨人胚神经干细胞的长期贴壁培养条件及传代方法。方法:在多种培养条件下,分别从9周和16周人胚脑中分离培养神经干细胞,应用免疫细胞化学的方法对所分离细胞的巢蛋白表达、自我更新能力和多向分化潜能进行鉴定。结果:采用高密度悬浮培养法能有效地从两种胚龄的人胚脑或室管膜下区中分离出神经干细胞,而采用贴壁培养法的人胚神经干细胞能保持干细胞的特性稳定增殖4个月。结论:从大小胚龄的人胚中均可成功分离培养人胚神经干细胞,贴壁培养的人胚神经干细胞能稳定增殖,是进一步进行人胚神经干细胞转基因研究的良好模型。
蒋云召, 陆华, 惠国桢, 苗宗宁, 卞林[10]2003年在《不同胚龄人神经干细胞的分离和培养》文中进行了进一步梳理目的 探索不同胚龄入神经干细胞分离和培养的适宜条件。方法 在多种培养条件下 ,采用无血清培养和单细胞克隆技术 ,从 7周和 13周人胚脑中分离和培养神经干细胞 ,应用免疫荧光染色予以鉴定。结果 从两个不同胚龄的人胚脑中分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞 ,未包被组 7周的人胚脑除高密度悬浮培养法生长不良 ,其它密度及培养法均有克隆球形成 ;13周的人胚脑仅中等密度悬浮培养法及高密度贴壁培养法有克隆球形成 ;包被组各种密度培养均生长不良。结论 人胚脑中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞 ,随着胚龄增大 ,培养难度逐渐加大 ,高密度贴壁培养法适宜各胚龄神经干细胞的分离培养。
参考文献：
[1]. 人胚脑组织神经干细胞的分离培养与鉴定[D]. 赵新利. 郑州大学. 2003
[2]. 胎鼠和人胚神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究[D]. 唐少锋. 第叁军医大学. 2003
[3]. 人胚脑皮层神经干细胞的分离培养及鉴定[J]. 陆华, 蒋云召, 苗宗宁, 周建宏, 唐志放. 中国微循环. 2002
[4]. 人胎脑神经干细胞的分离培养、分化及鉴定研究[D]. 李学仲. 青岛大学. 2005
[5]. 基因修饰人胚神经干细胞促进兔脊髓损伤修复的实验研究[D]. 阳运康. 第叁军医大学. 2005
[6]. 人脑神经干细胞的分离培养及鉴定的研究[J]. 汪泱, 邓志锋, 赖贤良, 王共先, 黄学明. 江西医学检验. 2004
[7]. 人胚脑神经干细胞的分离培养和鉴定及bFGF、EGF对脑缺血大鼠自体神经干细胞增殖的影响[D]. 李晓波. 南京医科大学. 2004
[8]. 高-低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞[J]. 蒋云召, 陆华, 惠国帧, 苗宗宁, 卞林. 江苏医药. 2003
[9]. 人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定[J]. 祝畅, 张传汉, 刘志恒, 桂伶俐, 高峰. 中国康复医学杂志. 2006
[10]. 不同胚龄人神经干细胞的分离和培养[J]. 蒋云召, 陆华, 惠国桢, 苗宗宁, 卞林. 中华器官移植杂志. 2003
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