李玉 蔡路 徐艳霞 孙婷媛 杨丽娟
哈尔滨市疾病预防控制中心 150036
【摘 要】军团菌是军团病是一种急性呼吸道传染病的病原菌，主要存在于中央空调冷却塔冷却水、冷凝水、淋浴水等各种水源中，通过空气吸入传播，因此在疾病预防领域中，对环境中军团菌污染状况的临测工作尤为重要。但传统的军团菌检测方法敏感性较低且耗时冗长，不能满足于军团菌的检测要求。为此我们尝试运用聚合酶链反应（PCR）技术，对哈尔滨市部分共场所空调冷却塔水进行了军团菌的检测。
【关键词】 聚合酶链反应技术；空调冷却塔水；军团菌；检测
[Abstract] Legionella is a pathogen of Legionella disease，which is an acute respiratory infectious disease.It mainly exists in cooling water，condensate water，shower water and other water sources of central air-conditioning cooling tower，and is transmitted by air inhalation.However，the traditional method of Legionella detection is less sensitive and time-consuming，which can not meet the requirements of Legionella detection.To this end，we tried to use polymerase chain reaction（PCR）technology to detect Legionella in some common air-conditioning cooling tower water in Harbin.
[keyword] polymerase chain reaction technology；air conditioning cooling tower water；Legionella；detection
1 材料与方法
1.1 水祥采集与处理
1.1.1 样品来源采集本市各类公共场所中央空调系统的冷却塔循环水样206件，每件约500 mL，置于无菌玻璃瓶中送检。
1.1.2 水样前处理 将水样混匀后，取富集后的50 mL水样经8000rpmX15 min离心，弃去上清液。在沉淀中加人100 p⊥裂解掖混匀，100C煮沸10 min后再经12000 rpmX15 min 离心，取上清薇11 μL备用。
1.2引物
①L5aL9（5' - ACTATAGCGATTTGGAACCA- 3"'）；②L5sR93（5' - GCGATGACCTACTTTCCCAT-3'）。
1.3 试剂
1.3.1 裂解液 OTriton- X一100；②EDTA；③Tris- HCL；④蛋白酶K。
1.3.2 反应液 ①10倍扩增buffter；②引物①、②；③4种dNTPS；④双蒸水。
1.3.3其他①Taq E 1.SU/puL（华美公司产品）；②TBE电解被。
1.4仪器
GENE CYCLE DNA体外扩增仪；万达SCR 300电泳仪。
1.5 PCR方程
在清洁的eppendroff管中依饮加人18 μL反应液、1 5个单位的TaqE.11 pμL备用的样液.覆上石蜡油。然后经：
93℃x5min→﹛93℃x30s﹜x35个循环→72℃x5min
93℃x5min→﹛53℃x30s﹜x35个循环→72℃x5min
93℃x5min→﹛72℃x60s﹜x35个循环→72℃x5min
1 6.1 制板 1.5 %琼脂糖凝胶+溴乙锭显色液1滴混匀后烧板。
1.6.2点样 取10μL反应产物混合澳甲份紫，加人槽中电沐30 min。每次电泳同时做阳性与阴性对照。
1.6.3 产物观察 在紫外灯下观察，若发现与阳性对照在同一高度处出现大小相同的荧光色带，即为阳性结果，反之则为阴性。
2结果
本市各大公共场所冷却水冷凝水的军团菌检出阳性率达17.0%，尤其是医院内军团菌检出阳性率高达26.3%（表1）。
3讨论
源于80年代初的PCR技术有着蛋白质表型检验技术无法比拟的高敏感度，强特异性和快速的报告速度，在对某些生长縵慢，甚至不能在体外生长及其他方法难以确认的病原体检验中具有非常重要的作用，极适合军团菌的临床检验和环境监测要求。本次我们采用PCR技术对本市206份环境水样进行了检测。与此同时，我们还用BCYE平板培养法进行了平行试验。结果平板培养法检测出阳性标本19件，阳性率9.2%；而PCR祛检测阳性35件（含培养法阳性19件），阳性率17.0%，方差分析P<0.01，显示两组方法差异有是著性。PCR法检测的阳性数远高于平板法，这是因为平板培养法的敏感度极其有限，仅能满足103 cfu/mL以上的检测限度，而环境水中军团蘭含量通常是低于103 cfu/mL的，所以造成低检出率。而PCR技术能达到10 cfu/mL水平，其优势是显而易见的。
在本次实验中，我们采用军团菌SsrRNA的rDNA序列片段特异性地扩增全军团菌属.扩增产物为104bpo这组引物是參照欧洲分子生物学实验室（EMBL）DNA数据库p格筛选而成，是根据军团菌编码SsrRNA的rDNA序列片段设计合成的，由于rRNA在细菌进化过程中变异极小，保守性极强，SsrRNA作为全军团菌属共有的基因，其rDNA序列拷贝作为属检测依据是非常可靠的[2）。因此军团菌SsrRNA的rDNA序列片段可以用作军团菌属特异性靶序列来扩增。以往在军团菌的PCR检测中多使用mip基因作引物来扩增，故根据其序列片段设计而成的引物大多只能检测嗜肺军团菌。由于过去一直认为唯有嗜肺军团菌对人致病，故mip基因序列一直为研究人员采用，随着其他各种军团菌致病流行的日益增多，采用全军团菌属共有的稳定的SsrRNA基因序列片段来检测所有种的军团菌意义就非常大了。
PCR技术完全是从细菌的基因水平人手，故而比以往所有传统的外显蛋白质表型检测更为可靠，但是它也有缺陷，即无祛捕捉到话菌，因此在实验中要特别注意防止污染，避免假阳性。合理设计引物、严格遵守操作规程、设置明阳性对照等措施完全可以防止这种现象发生，这个问题需要我们在以后的工作中进一步完善，一旦解决了这个问题，棄合酶链反应技术完全可以应用于临床和环境中军团菌的检测。
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作者简介：李玉（1980-），女，硕士研究生，副主任技师，主要从事细菌检验工作，
论文作者:李玉,蔡路,徐艳霞,孙婷媛,杨丽娟
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2018年7月下第14期
论文发表时间:2019/1/8
标签：军团论文; 阳性论文; 引物论文; 结核论文; 序列论文; 分枝论文; 加人论文; 《中国医学人文》(学术版)2018年7月下第14期论文;