王忠田[1]2000年在《新城疫病毒融合蛋白基因的扩增、克隆及其基因片段在大肠杆菌中的表达》文中进行了进一步梳理本研究利用分子生物学技术对鸡新城疫病毒(NDV)的F基因进行了扩增、克隆和表达研究。F蛋白不仅是NDV主要保护性抗原，而且F蛋白一级结构(氨基酸顺序)决定病毒毒力。因此研究F蛋白基因在构建NDV基因工程疫苗以及其实用化方面具有重要的意义。 本研究利用RT—PCR技术分两段扩增出NL株F蛋白基因F_1、F_2片段并分别进行测序，与已发表的F_(48)E_9株F蛋白基因进行序列及由核苷酸推导出的氨基酸序列比较，结果表明：NL株为一强毒株，其F基因与F_(48)E_9株的F基因同源性为87.81％；氨基酸的同源性为92.01％，且NL株F蛋白在裂解位点的112位与F_(48)E_9株不同，F_(48)E_9为R，NL株为K。 根据重组PCR原理，将NL株F基因的两片段进行连接，扩增出NL株F基因的全长1.7kb并将其克隆到T载体，转化到大肠杆菌JM109中构建PFL质粒菌，经酶切鉴定及部分测序表明克隆的基因为F基因全长，含有翻译的起始密码子和终止密码子及转录的起始引导序列，可以用于F基因的研究及在原核、真核表达系统中表达。 为探讨NDV基因工程苗的研制，我们根据NL株F基因序列，自行设计一对带有酶切位点的引物，对PFL质粒进行PCR扩增，获得与设计结果相符的630bp大小的F基因片段。将该片段经双酶切后克隆到融合表达载体pThioHisB并转化到Top10细胞中，构建了pThioHisB/F质粒，经酶切及PCR鉴定，表明克隆成功。对pThioHisB/F质粒菌用IPTG诱导，经SDS-PAGE分析，在大约为35KD处有一明显的蛋白条带；用HRP标记的兔抗鸡抗体进行Western-blot检测，结果呈阳性。说明克隆正确表达成功且表达量为20％左右。
沈艳[2]2007年在《NDV-F的原核表达及其免疫反应性和鸡Ii链与MHCⅡ的真核共表达》文中研究说明新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)所致疫病鸡新城疫(ND)又称亚洲鸡瘟,是禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性急性败血性传染病,国际兽疫局把ND定为A类传染病,严重危害畜牧业和人类健康。近年来,我国多次出现此疫情,给我国养殖业构成极大的威胁,并导致严重的经济损失。因此,寻找一种理想的免疫保护性抗原用于该病的快速诊断与免疫防治以及加强NDV分子流行病学的研究具有重要实际意义。融合蛋白(Fusion Protein,F)是新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)穿入细胞膜,发挥致病作用重要的糖蛋白,与病毒的致病性和毒力密切相关。F蛋白先是以惰性F0的形式合成,当它转运到高尔基体表面时,被宿主细胞蛋白酶裂解成F1和F2两个亚单位,使病毒具有感染活性。裂解后的活性蛋白一旦到达细胞膜表面即可介导感染细胞与邻近细胞的融合,并逐步扩大感染范围。本课题拟对NDV F48E9株F蛋白为研究对象,在对其克隆测序后,构建pGEX-4T-1-F重组质粒并进行原核表达。旨在从分子水平探讨NDV F48E9株F蛋白结构特征,表达获得大量F蛋白,为下一步制备NDV单克隆抗体、研究其功能提供物质基础,也为进一步研制NDV基因工程疫苗奠定基础。首先,根据GenBank已知NDV F48E9株F基因序列和原核表达质粒PGEX-4T-1的多克隆位点设计一对引物,以含鸡新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株F基因重组质粒pcDNA-F为模板,PCR扩增获得594bp长度的片段,经单酶切鉴定,与GenBank中登录的NDV F48E9株F基因序列含有相同的单酶切位点。其次,PCR产物分离纯化后连接到原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点,经质粒PCR和EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆,构建成F基因片断的原核表达质粒,并命名为pGEX-4T-1-F。将此原核表达重组质粒pGEX-4T-1-F转化大肠杆菌BL21,经37℃和1.0mmol/L IPTG的诱导,SDS-PAGE凝胶电泳表明所克隆的基因片段在大肠杆菌中得到融合表达,表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与F的融合蛋白GST-F,且表达产物主要以包涵体的形式存在。所获得的融合蛋白分子量分别约为46 KD,与预期结果相符。最后,通过优化原核表达条件,确定了原核表达重组质粒pGEX-4T-1-F的最佳诱导时间和诱导剂浓度,我们用优化的原核表达条件对含有pGEX-4T-1-F质粒的BL21菌进行了大量诱导表达,实验中使用反复冻融和超声方法来裂解诱导表达菌,获得了较高浓度的GST-F包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,提取了大量的可溶性GST-F原核融合表达蛋白。Western-Blot免疫印迹分析表明,此融合蛋白能与NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。综上所述,本研究成功地克隆了鸡NDV F48E9株F基因,并进行了原核表达,获得了大量的GST-F原核融合表达蛋白,这些都为进一步研究鸡NDV-F分子免疫学功能及其应用提供了试验材料。这些都为进一步制备NDV单克隆抗体、研究其生物学功能提供了物质基础,也为进一步研制NDV基因工程疫苗奠定基础。MHCⅡ类分子是呈现在免疫系统特定细胞表面的由α链和β链非共价键相连组成的一组高度多态性的跨膜糖蛋白。这些分子提呈经过加工的外来抗原给辅助性T细胞的抗原受体(TCR),导致辅助性T细胞激活和分化,从而在诱发免疫应答中起重要的作用。MHCⅡ类分子不正常表达会引起严重的免疫缺陷疾病。Ii链是一种非多态性的Ⅱ型跨膜蛋白,作为分子伴侣,在调节MHCⅡ类分子的表达和功能方面发挥重要作用。首先,根据GenBank中登录的鸡类MHCⅡ的α链和β链基因及Ii序列与载体pEGFP-C1及pDsRed2-N1的多克隆酶切位点分别设计三对引物,应用PCR技术从重组质粒pGEX-4T-1/α、pGEX-4T-1/β、pcDNA3-Ii中扩增出编码鸡α链(771bp)和β链(798bp)以及Ii(672bp)基因片段。将α、β、Ii片段分别连入绿色荧光蛋白载体上,Ii片段连入红色荧光蛋白载体上,构建真核表达质粒GFP-α、GFP-β、GFP-Ii和RFP-Ii。经PCR和双酶切鉴定,结果表明,所有目的片段均成功插入相应的载体上。其次,由于鸡MHCⅡ分子及Ii链与哺乳动物的同源物之间不仅在氨基酸水平上具有很高的同源性,而且在分子结构上很相似,因此它们应该与其哺乳动物的同源物一样在外源性抗原提呈中发挥重要作用。但是目前还没有关于鸡MHCⅡ分子与Ii链之间的相互作用的报道,在本实验中,我们将GFP-α、GFP-β融合基因与Ii基因共同转染293细胞,荧光显微镜观察结果表明,它们之间存在共定位。最后,我们通过将GFP-α、GFP-β和GFP-Ii同时共转染293细胞,或者将GFP-α、GFP-β和GFP-Ii 36h分别转染293细胞,36h后裂解细胞获得蛋白,再利用免疫印迹法对三者之间的关系进行探讨。结果表明,GFP-α、GFP-β和GFP-Ii三者共同转染时分子量均有变化,但是其原因还不清楚。综上所述,本研究通过对鸡MHCⅡ的α链和β链基因及恒定链Ii基因的真核构建,利用荧光显微镜观察,观察MHCⅡ的α链和β链基因及Ii基因在293细胞上的定位,推断恒定链Ii与MHCⅡ的α链和β链在细胞中可能存在相互作用,为下一步探讨MHCⅡ与Ii之间的关系以及恒定链参与的DNA疫苗研究奠定基础。
赵永许[3]2008年在《鸡新城疫病毒F48E9的纯化及其HN基因片段的原核表达》文中进行了进一步梳理实验室一般采用差速离心和密度梯度离心的方法来纯化病毒,这种方法在工业上难以大量推广。而人用疫苗的纯化则多采用超滤,层析等方法,由于成本较高,在兽用疫苗上很难普遍采用。本研究借鉴蛋白质提纯的相关方法,利用硫酸胺、冷乙醇和PEG6000对鸡新城疫病毒进行了初步提纯,并用红细胞血凝实验对浓缩效果进行了检测,结果发现终浓度为40%时硫酸铵对鸡新城疫病毒的浓缩效果最好,可将病毒的血凝效价提高32倍;在冷乙醇终浓度为30%时对病毒的浓缩效果最好,可以将病毒的血凝效价提高8倍;PEG6000的终浓度为20%时对鸡新城疫病毒的浓缩效果最好,可将病毒的血凝效价提高16倍。本研究结果给兽用疫苗的纯化提供了一定的借鉴意义。新城疫是由新城疫病毒引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病,在世界范围内均被认为是家禽和鸟类最重要的两大疾病之一。目前鸡新城疫尚无有效的治疗药物,疫苗接种是控制其爆发的主要手段,其中基因工程疫苗具有广阔的发展前景。同时鸡新城疫病毒的相关单克隆抗体己广泛用于病毒抗原表位和发病机理,疫病诊断和流行病学分析等各项研究中。本研究选取了鸡新城疫病毒标准中国强毒株F48E9 HN基因中基本上包含了其主要抗原位点的两个基因片段,通过RT-PCR技术,成功地获得了这两个不交叉的基因片段,长度分别为790bp和579bp。而后将这两段基因分别克隆到了pGEM-T vector中,经PCR和酶切鉴定后进行测序,测序结果表明这两段基因已经成功地克隆到了pGEM-T vector中。克隆出的两个HN基因片段HN1、HN2与原核表达系统pET-28a(+)进行了连接,成功地构建了重组表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达;由于pET-28a(+)表达载体在起始密码子之后有His(Tag)标记,表达的目的融合蛋白N端含有His,能与Ni柱中的Ni2+结合,而其它蛋白不能结合在Ni柱上,所以利用Ni亲和层析柱对表达的目的蛋白进行了纯化,通过SDS-PAGE电泳检测,检测出了经过纯化的目的蛋白。本研究中得到的两个HN蛋白为进一步进行鸡新城疫病毒的相关单克隆抗体研究和基因工程疫苗研究打下了基础。
贺奋义[4]2012年在《鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究》文中研究表明鸽I型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus1，PPMV-Ⅰ)病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽I型副粘病毒(Avian Paramyxovirus1， PMV-Ⅰ)引起的一种急性、热性、高度性传染病。PPMV-Ⅰ引起鸽群突然发病，迅速蔓延，临床症状上与鸡新城疫嗜神经速发株引起的十分类似，主要临床特点是肠炎、下痢和神经症状，尤以嗜神经速发型为多见，发病率和死亡率都很高。鸽新城疫病其传播迅速、发病率高，发病后死亡率较高，死亡率可达50-80%以上，严重的可高达95%以上，处于孵化期的种胚感染后可全部死亡。给养鸽业造成的影响和危害巨大，是养鸽业重点防控的传染病之一。鸽新城疫病毒编码两种囊膜糖蛋白，融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)，F蛋白位于囊膜外表面，形成纤突，对鸽新城疫的毒力及感染性起决定性作用，是鸽新城疫的主要免疫原性蛋白；F基因还具有较高的遗传稳定性，是新城疫基因分型的主要依据，也是决定鸽新城疫致病力强弱的关键因素；F基因的遗传变异与鸽新城疫的变异和流行密切相关，是鸽新城疫分子流行病学研究的首选基因，因此，F基因是研究鸽新城疫核酸疫苗的首选目的基因。本文通过鸽新城疫种毒PL株在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究和病毒的灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了鸽新城制苗用病毒最佳制备方法和最佳灭活条件，在此基础上，研制出鸽新城疫油乳剂灭活疫苗和蜂胶佐剂灭活疫苗，经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验、最佳免疫剂量测定，效力试验以及田间应用试验表明，鸽新城疫蜂胶佐剂灭活疫苗不仅均匀度好，粘度低，通针性良好，注射后易被机体吸收，在接种部位不会形成硬结，而且免疫效果好，对鸽群免疫后能起到坚强的保护作用。此外，本文还用RT-PCR方法，从鸽新城疫病毒PL株基因组中克隆、鉴定了融合蛋白基因(F基因)，并在大肠杆菌中进行了高效表达，以纯化的F表达产物为抗原，建立了鸽新城疫病毒抗体间接ELISA检测方法；同时，把鸽新城疫F基因插入酵母表达载体pPic9k和真核表达载体PC-DNA3.1/V5-His中，构建了鸽新城疫F基因毕赤酵母表达系统和F基因真核表达体系，为鸽新城疫F基因生物活性的进一步研究及新型核酸疫苗的研制奠定基础。本项目研究的主要内容包括：1、鸽新城疫种毒增殖规律和灭活方法的研究：采用鸽新城疫PL株为种毒，在鸡胚上连续盲传5代，使其扩大增殖，收获尿囊液做为基础种子毒。通过种子毒在非免疫健康鸡胚上增殖动态的试验研究表明，病毒在羊水、尿囊膜(包含羊膜)、尿囊液中含量较高、增殖动态趋于一致，而在胚体及卵黄中含量较低，接种病毒后72h为最佳收毒时间。经病毒的最佳灭活时间、灭活温度以及甲醛浓度的试验研究，确定了0.05%甲醛在20℃条件下经过48h；70℃的温度条件下经过20min灭活病毒为最佳灭活方法，不仅能有效的完全灭活病毒，而且能使病毒的血凝活性保持在94%以上。2、鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶灭活疫苗的制备：用70℃，20min的灭活方法分别制备尿囊液蜂胶佐剂灭活苗和四元材料(鸡胚尿囊液、羊水、尿囊膜、羊膜)混合蜂胶佐剂灭活苗，用0.05%甲醛在20℃条件下经48h的灭活方法分别制备鸽新城疫尿囊液蜂胶佐剂灭活苗、尿囊液油乳剂灭活苗和四元材料(尿囊液、尿囊膜、羊膜、羊水)混合油乳剂灭活苗。制备的六种疫苗经物理性状检验、安全性检验、急性毒性试验、免疫持续期试验综合分析表明，均具有良好的抗原性和安全性。3.鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗的性能比较试验：用制备的六种鸽新城疫油乳剂灭活苗和蜂胶佐剂灭活苗分别免疫注射乳鸽，结果表明四种蜂胶佐剂灭活苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，二种油乳剂苗免疫抗体消长水平和免疫期基本一致，从而证明四元材料的疫苗与尿囊液毒疫苗的性能基本一致；但四元材料蜂胶佐剂灭活苗和油乳剂灭活苗在抗体产生时间及其达到峰值的时间和数值上有差异，蜂胶苗明显优于油苗。蜂胶佐剂灭活苗在免疫后5d抗体开始上升(平均为2.8log2～2.9log2)，14d抗体可达到高峰(平均为11.2log2～11.4log2)，而油乳剂灭活苗在免疫后9d抗体效价开始上升(平均为3.0log2～3.1log2)，21d才达到峰值(平均为9.0log2～9.2log2)。蜂胶佐剂灭活苗180d仍可维持较高水平(平均为6.6log2～6.7log2)；在免疫后30d、90d、180d用200ELD50强毒株攻击，其保护指数均为100%；对1日龄乳鸽接种1个使用剂量进行急性毒性试验观察，15d生长曲线表明，不影响鸽的生长，甚至有提高的趋势；室温保存3个月，4℃-8℃保存6个月，疫苗的物理性状和免疫保护性没有明显变化。4、鸽新城疫F基因的克隆及序列分析：通过设计一对引物，利用RT-PCR扩增以及亚克隆方法，从鸽新城疫病毒PL株中扩增出F基因，将扩增产物克隆进pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定筛选出阳性菌落并进行序列测定。结果表明：F基因为1662bp，编码553个氨基酸，与国内外报道的其他NDV毒株的F基因氨基酸数量相同；通过BLAST法与GenBank中国内外17个鸽源和鸡源部分新城疫毒株进行相似性比较及对照系统进化树的结果分析，表明我们的分离株（PL株）与17个毒株之间的相似性介于76.3-98.6%；对分离的鸽新城疫F融合蛋白的氨基酸序列与国内外8株新城疫氨基酸序列进行对比分析，结果氨基酸同源性为93.6%-96.7%；F0蛋白裂解位点的氨基酸组成为112R-R-R-K-R-F117，符合强毒株的序列。5、鸽新城疫F基因的原核表达及其生物活性研究：用PCR方法获得了缺失F蛋白信号肽、胞质区和跨膜区的F基因片段，将其亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中，与GST蛋白融合表达，经IPTG诱导和SDS-APGE分析，表明目的蛋白在大肠杆菌BL21中得到高效表达，表达产物分子量约为60Kda；以表达的融合蛋白为抗原初步建立了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，用方阵法确定其最佳反应条件：抗原1∶128稀释即抗原包被量为0.6μg/孔，血清1∶400稀释，与一抗的最佳作用时间为60min，与酶标二抗的最佳作用时间为60min，底物显色的最佳作用时间为15min。6、鸽新城疫F基因在毕赤酵母中表达：根据鸽新城疫F基因序列，设计引物，将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K，用SalI内切酶线性化后电击转化GS115毕赤酵母感受态细胞，用影印法在含G418的YPD平板上筛选高拷贝重组菌，用甲醇诱导表达并进行SDS-APGE分析。7、鸽新城疫F基因的真核表达及其生物活性研究：将鸽新城疫PL株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1V5-Hi中，构建出真核表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F；将构建的真核表达重组质粒免疫接种非免疫新城疫的乳鸽，并在免疫后第28d进行攻毒保护试验。结果表明，在免疫后第7d产生抗体，14d抗体水平达到最高，之后抗体水平开始下降；攻毒保护试验结果显示，对鸽新城疫强毒攻击保护率为33.33%（5/15），具有一定的免疫保护作用。
李本强[5]2015年在《鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究》文中研究指明新城疫目前仍是大多数养禽国危害最严重的禽病之一,不仅对养禽业造成危害,还对哺乳动物和人类健康具有潜在的威胁。新城疫由于传染性强,传播速度快,给国家和地区的贸易限制和封锁造成了巨大的经济损失。我国将其列为一类动物疾病。病毒性传染病目前尚没有特异性药物治疗,只能依靠疫苗免疫等进行预防。因此,研究特异高效的抗病毒药物是防治病毒性疫病所面临的一项紧迫课题。近年来出现的反义RNA、RNAi等基因治疗技术,都试图在细胞内对感染的病毒在核酸水平上进行干预,从而达到抑制病毒合成的治疗目的。随着细胞生物学和抗体工程技术的发展,出现了一种新兴细胞内免疫及治疗技术——胞内抗体技术。胞内抗体技术是将小分子抗体导入细胞内引起细胞的一系列生物过程发生改变的技术,该技术通过特异性干扰或阻断细胞内特定生物大分子合成、加工和分泌过程而发挥作用。鉴于新城疫病毒转录复合体蛋白在病毒复制增殖过程中所处的关键环节,本研究拟研制能够与新城疫病毒转录复合体蛋白之一的磷蛋白结合的胞内抗体。通过胞内抗体与P蛋白在NDV感染的细胞内特异性结合,从而对病毒转录复合物形成进行干扰及对病毒增殖进行抑制,为新城疫病毒特效药物的研发以及病毒复制机制的研究提供一种新的思路。为此,本论文从以下几个方面开展研究。1、鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白的单链抗体(sc Fv)的筛选及鉴定(1)鸡源性单链抗体基因表达文库的建立单链抗体是将抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过一段柔性的连接肽(linker)连接所形成的两个可变区首尾相连的单一肽链。通过用NDV VG/GA型疫苗免疫鸡,提取其脾脏总m RNA。设计鸡抗体编码基因特异性引物,采用RT-PCR和PCR技术扩增出抗NDV单链抗体的轻链可变区和重链可变区基因,利用重叠延伸PCR将VH和VL通过一条linker连接起来(VH-linker-VL)构建sc Fv。将sc Fv基因克隆于原核表达载体p OPE101-XP,该载体主要用于单链抗体的表达和筛选。将构建的重组质粒p OPE101-XP-sc Fv转化感受态细胞E.coli JM109,PCR鉴定为阳性的克隆送检测序。挑选测序正确的阳性克隆经IPTG诱导表达,提取周质腔可溶性sc Fv,SDS-PAGE检验表达结果证明成功构建了鸡源性单链抗体表达文库。经计算单链抗体库库容量为3.8×106,可用于下一步单链抗体的筛选。(2)抗新城疫病毒磷蛋白(P)单链抗体的筛选及鉴定根据Genbank中已经发表的禽源性新城疫病毒F48E9磷蛋白的基因序列,设计了一对特异性引物,运用RT-PCR方法从基因组中扩增出P蛋白编码基因的c DNA。P蛋白编码基因全长1287 bp,编码429个氨基酸。同时将测序正确的P蛋白基因序列连接原核表达载体构建重组原核表达质粒p ET-28a-P,进而表达出P蛋白,为筛选针对磷蛋白的单链抗体提供抗原。以纯化后的新城疫病毒磷蛋白为抗原,建立并优化可用于筛选抗NDV磷蛋白sc Fv的间接ELISA方法。从上述构建的单链抗体库中进行筛选,获得两株亲和力较高的阳性克隆sc Fv ZL.17和sc Fv ZL.103。对鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体的基因序列分析,结果表明高变区主要集中于CDR区,碱基变化很大。Western blot分析表明两株单链抗体都能够与病毒的磷蛋白特异性结合。2、抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体在细胞中的表达及生物活性分析为获得针对NDV磷蛋白的细胞内抗体,本研究将上述两个单链抗体编码基因克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+),成功构建了针对磷蛋白的胞浆型胞内抗体表达质粒pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17。采用脂质体分别将pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17导入细胞内,通过RT-PCR和Western blot分析证明,在细胞内,其编码胞内抗体的m RNA获得转录,胞内抗体成功表达,间接免疫荧光技术也进一步证实胞内抗体在细胞内获得表达。流式细胞证明重组胞内抗体对宿主细胞活性无显著影响;并且通过Western blot和免疫共沉淀实验评估了表达的胞内抗体在细胞内与新城疫病毒磷蛋白的结合能力,证明胞内抗体能够在细胞内与磷蛋白能够特异性结合。通过亚细胞定位实验发现胞内抗体主要分布于细胞质,与磷蛋白的分布区域正好重叠。抗磷蛋白胞内抗体与新城疫病毒相互作用后,血凝实验检测病毒滴度,结果表明转染细胞内的胞内抗体pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17能够阻断病毒对细胞的侵染,因而对NDV感染的细胞具有保护效果,依次是p CDNA3.1-sc Fv ZL103>p CDNA3.1-sc Fv ZL17>BHK21。通过荧光定量PCR证明,胞内抗体具有干扰c RNA、v RNA和m RNA合成的效果,具有抑制病毒产生的功能。3、可穿膜的重组胞内抗体融合蛋白的表达及生物活性研究上述抗体需要通过脂质体才能导入细胞,既繁琐,效率也不高。为了探索能顺利将抗体导入细胞的方法及构建穿膜型胞内抗体,本研究选择报道的融合穿膜肽HIV-TAT衍生片段CTP512,将其分别和上述筛选的两个单链抗体表达基因融合,导入原核表达载体p ET28a(+),构建穿膜型胞内抗体表达质粒p ET28a-sc Fv ZL-CTP。进行了穿膜抗体生物学特性研究,设计不同穿膜抗体浓度进行穿膜实验,筛选出最佳的穿膜浓度为3μM;MTT法检测CTP融合穿膜抗体对细胞活性的影响,检测发现与对照组相比,穿膜抗体蛋白对细胞的增殖和活力无明显影响;间接免疫荧光实验分析显示,穿膜抗体定位于细胞浆,能与磷蛋白分布区域重叠;TCID50检测穿膜抗体对DNV感染细胞的保护效果,结果显示,穿膜抗体对细胞有明显保护效果,依次是p ET28a-sc Fv ZL103-CTP>p ET28a-sc Fv ZL17-CTP>Control,与空白对照相比差异显著(P≤0.05);荧光定量PCR检测穿膜抗体对细胞内NDV复制及转录的影响,结果显示,穿膜抗体显著降低了NDV的c RNA、v RNA和m RNA的含量,表明其具有抑制NDV复制的功能。本研究结果不仅为跨膜型胞内抗体研究提供了一种新思路,也为研究外源蛋白导入细胞膜的转膜技术提供了有益借鉴。本研究利用基因重组技术,首先成功构建了库容量为3.8×106鸡源性单链抗体库,并从库中筛选到针对磷蛋白的两株单链抗体;根据胞内抗体构建策略,研制了针对新城疫病毒磷蛋白的胞内抗体,实验证实胞内抗体对细胞具有保护效果及干扰新城疫病毒基因在细胞内的复制及转录;成功构建跨膜型胞内抗体导入质粒,使胞内抗体与蛋白跨膜转运区域融合表达,实验证实穿膜抗体定位于细胞浆,且对细胞具有保护效果;荧光定量PCR鉴定穿膜抗体能够干扰新城疫病毒感染细胞后的复制及转录。本研究为研究NDV在细胞内复制增殖机制,筛选细胞内有效抗NDV抗体,进而探索细胞内治疗NDV等病毒感染新途径进行了有益探索。
刘一尘[6]2008年在《鸡IL-18变构基因与新城疫病毒HN基因融合表达载体的构建及体外抗马立克病肿瘤细胞的研究》文中研究表明新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一种溶癌病毒,可在肿瘤细胞内增殖、抑制并裂解肿瘤细胞。研究发现,NDV的包膜糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因是NDV抗肿瘤的功能性基因,是NDV抗肿瘤作用的重要分子基础。IL-18具有明显的抗肿瘤作用,在肿瘤治疗和肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用前景。为探讨HN基因及IL-18基因融合后抗肿瘤作用及其机制,本研究分别构建了HN基因、ChMIL-18基因及HN基因和ChMIL-18基因融合后的重组表达载体pPICZαA-HN、pPICZαA-ChMIL18和pPICZαA-HN-ChMIL18,经诱导表达后,其目的蛋白均具生物学活性,进而以鸡马立克病肿瘤细胞系-MSB-1为体外研究对象,对MSB-1细胞的增殖抑制作用及其机制等方面进行了初步研究,结果表明,HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均可抑制肿瘤细胞生长,HN-ChMIL18融合蛋白对细胞抑制作用明显强与HN蛋白,其原因可能是ChMIL-18蛋白对HN蛋白致肿瘤细胞凋亡有增强作用,而ChMIL-18蛋白虽具有淋巴细胞增殖活性,但对肿瘤细胞无明显的抑制作用,其为进一步研究HN基因和ChMIL-18基因融合蛋白体内抗马立克肿瘤奠定了基础,具有重要的理论和实际意义。1目的基因的获得及生物信息学分析1.1 ChMIL-18目的基因的获得根据Genbank中鸡IL-18成熟蛋白基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR技术,从外周血淋巴细胞中扩增到了鸡IL-18成熟蛋白基因全序列,将其克隆至pMD18-T载体并测序,对测序结果进行生物信息学分析,结果表明:序列全长为507bp,其理论分子量为19.5KD,等电点为6.36,无糖基化位点,具抗原性等。为提高具有生物活性的ChIL-18的表达量,应用反向长距离PCR定点突变技术对鸡IL-18成熟蛋白基因第28位和第37位的Arg密码子进行同义突变,将毕赤酵母中低频密码子CGA突变为高频密码子AGA,获得突变体pMD18-T-ChMIL18,将其转化至E.coli JM109中,抽提质粒,经酶切和PCR鉴定后,进行测序,测序结果与原ChIL18比对表明突变成功,获得了目的突变基因。1.2 HN基因的获得应用RT-PCR方法对NDV LaSota株HN基因进行了扩增与克隆,得到大小约为1.7Kb的LaSota株HN基因,与Genbank中登录的HN基因大小一致:扩增序列经PCR、酶切鉴定及序列测定证实与预计结果相符:用DNAStar及在线分析软件对HN基因的生物信息学进行分析,其结果为:HN基因共577个氨基酸,理论分子量为63.0KD,等电点为7.54,12个半胱氨酸残基,5个N-糖基化位点,与B1、Clone30、LaSota、JI1和HB92核苷酸同源性在98.8%-99.8%,氨基酸同源性分别为98.8%-99.5%。1.3 HN-ChMIL18融合基因的获得根据表达载体pPICZαA及克隆载体pBluescript SK+(pBS SK+)的多克隆位点,设计HN基因的引物(含柔性接头),在两端分别引入KpnI和BamHI酶切位点,以及变构体MIL-18引物(含柔性接头),在两端分别引入BamHI和NotI酶切位点。分别以pMD18-T-HN、pMD18-T-ChMIL18为模板扩增得到融合基因片段HN~f和ChMIL-18~f,并克隆至pMD18-T载体,构建了克隆载体pMD18-T-HN~f、pMD18-T-ChMIL18~f。重组质粒pMD18-T-HN~f和pBS SK+分别用/KpnI/BamHI双酶切,片段回收产物按适当比例连接,转化E.coli JM109感受态细胞,重组质粒命名为pBS SK+-HN。然后,重组质粒pMD18-T-ChMIL18~f和pBS SK+-HN分别用BamHI、NotI双酶切,回收产物按适当比例连接,转化E.coli JM109感受态细胞,重组质粒鉴定正确后命名为pBS SK+-HN-ChMIL18,经酶切、PCR鉴定及序列比对表明获得了目的基因HN-ChMIL18。2表达载体的构建、诱导表达及表达产物的活性检测2.1表达载体pPICZαA-ChMIL18的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pMD18-T-ChMIL18和pPICZαA分别用EcoRl、KpnI双酶切,电泳回收纯化ChMIL18和pPICZαA双酶切产物,按适当比例进行连接,转化到E.coli JM109感受态细胞中,鉴定结果表明获得了重组质粒pPICZαA-ChMIL18。将重组质粒pPICZαA-ChMIL18用SacI酶切线性化,电脉冲方法克隆至Pichia Pastoris(P.Pastoris)X-33感受态细胞中,经高抗性筛选、PCR鉴定结果表明pPICZαA-ChMIL18已整合入P.Pastoris X-33染色体中,用1%甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明目的蛋白存在于上清中,分子量约为23KD,Western blot结果表明表达产物具良好的免疫原性,淋巴细胞转化试验结果表明ChMIL18具有促淋巴细胞增殖的活性。2.2表达载体pPICZαA—HN的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pPICZαA和重组质粒pMD18-T-HN分别用KpnI/NotI双酶切,电泳回收纯化HN和pPICZαA片段,按适当的比例进行连接,克隆至E.coli JM109感受态细胞中,经酶切及PCR鉴定,结果表明获得了重组质粒pPICZαA-HN。重组质粒pPICZαA-HN用SacI酶切线性化,电击转化入P.Pastoris X-33感受态细胞中,经高抗性筛选、PCR鉴定证明pPICZαA-HN已整合入X-33的染色体上,对其进行诱导表达,SDS-PAGE、Western-blot及血凝试验结果表明上清中有目的蛋白,其分子量约为97KD,且具良好的免疫原性和凝集红细胞的活性。2.3表达载体pPICZαA-HN-ChMIL18的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pBS SK+ -HN-ChMIL18和pPICZαA分别用KpnI/NotI双酶切,电泳回收HN-ChMIL18与pPICZαA双酶切产物并纯化,按适当比例进行连接,克隆至E.coliJM109感受态细胞,酶切及PCR鉴定结果表明获得了重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18。重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18用SacI酶切线性化后,电击转化入酵母菌X-33感受态细胞中,高抗性筛选和PCR鉴定结果表明pPICZαA-HN-ChMIL18已整合入X-33染色体上,对其进行诱导表达,SDS-PAGE、Western-blot结果表明目的蛋白为分泌性表达,分子量约为103KD,具良好的免疫原性,同时,淋巴细胞转化试验、血凝试验证明表达产物具有促进淋巴细胞增殖和凝集红细胞的活性。3体外抗马立克肿瘤细胞系MSB-1的初步研究以马立克氏病肿瘤细胞系-MSB-1为体外研究对象,分别将ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养后,通过增殖抑制试验、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等方法探讨其抑制机制,MTT结果表明HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白对MsB-1细胞的增殖有抑制作用,并呈剂量相关性,而ChMIL-18蛋白无抑制作用;琼脂糖凝胶电泳分析发现,ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养一段时间后,HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均出现DNA断裂现象;ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养后,流式细胞仪检测发现HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均引起MSB-1细胞出现了凋亡,而且HN-ChMIL18融合蛋白引起的凋亡数量比HN蛋白多,而单独的ChMIL18不能引起MSB-1细胞凋亡。
刘玉良[7]2005年在《从cDNA克隆产生感染性ZJI株鹅源新城疫病毒》文中进行了进一步梳理新城疫(ND)是由副粘病毒科、禽副粘病毒属(Avulavirus)中的新城疫病毒(NDV)引起多种禽类发生感染和高度死亡的一种急性、接触性传染病。强毒感染易感禽常呈败血症经过,传播迅速,常给养禽业造成重大经济损失。在国际动物卫生组织(OIE)的疾病分类中ND属A类病。水禽曾被认为对NDV有较强的抵抗力,感染后一般不会引起发病和死亡,但是,自1997年以来,我国很多地区鹅群中被相继报道感染NDV强毒,造成较为严重的发病和死亡,严重威胁着我国养鹅业及其他禽类养殖的发展,引起了众多业者的密切关注。系统阐明鹅群中NDV的来源、病原特性、遗传演化以及研制有效的新型疫苗来防制该病在鹅群中的继续感染和流行等研究工作迫在眉睫。近年基于病毒基因组cNDA克隆技术基础上发展起来的反向遗传技术己成为分子病毒学研究的一个重要工具。本实验室从发病鹅群中分离到数十株NDV强毒,并对其部分生物学特性进行了鉴定。同时,对其中的ZJI分离株进行了全基因组测序,首次研究发现该毒株的基因组核苷酸总数为15192bp而不是以往所报道的15186bp。在此基础上,本研究构建了含该毒株NP、P和L基因的表达载体并对P基因进行了融合表达鉴定:利用ZJI株NDV微型基因组对3个表达载体进行了功能鉴定:应用基因定点突变技术对该毒株全基因组cDNA克隆进行了定点突变:将基因组cDNA克隆和辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞继而接种SPF鸡胚后,拯救出了有感染性的ZJI株NDV强毒,并通过血凝(HA)和血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察和序列测定等方法对获救病毒进行了鉴定:同时,对获救病毒与野生型病毒进行了部分生物学特性比较,结果表明拯救出的NDV强毒株与野生型病毒具有相同的生物学特性。鹅源NDV强毒株的拯救成功为国内外首次报道,所建立的鹅源NDV反向遗传系统将成为NDV功能基因组研究和新型疫苗研制等研究中强有力的研究工具。 1.ZJI株鹅源NDV NP、P和L基因表达载体的构建及功能鉴定 根据已登录GenBank上的ZJI株NDV全基因组序列(登录号:AF431744)设计3对引物,以抽提的ZJI株NDV基因组RNA为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
梁雪芽[8]2002年在《减毒沙门氏菌作为鸡新城疫口服DNA疫苗载体的基因免疫研究》文中认为细胞内感染性细菌减毒后作为DNA疫苗载体是目前基因免疫研究的热点之一。沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种较为常见的侵袭性胞内菌，通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，可直接将真核表达质粒携带进入动物细胞内表达相应的蛋白而诱导特异性的免疫应答反应。但目前国内外还未见用减毒沙门氏菌作为载体传递禽类DNA疫苗的报道。 新城疫(Newcastle Disease, ND)是目前危害世界养禽业最严重的传染病之一。该病的病原新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)属副粘病毒科，为有囊膜的负链RNA病毒。融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)是NDV的主要宿主保护性抗原，以F基因和HN基因为免疫原研制的DNA疫苗能诱导一定程度的免疫应答，但注射免疫或基因枪免疫途径因实际操作和成本等问题难以推广应用，而直接口服重组质粒DNA免疫效果不理想。本研究探讨了利用沙门氏菌dam基因和phoP基因双突变株为载体传递NDV DNA疫苗的免疫原性和可行性。 本研究应用RT-PCR扩增了新城疫病毒强毒株F_(48)E_9株融合蛋白(F)基因，并将其插入到pcDNA_3的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3-F。序列测定结果表明，克隆的F基因全长1668 bp，编码553个氨基酸。序列分析和二级结构预测表明，F_(48)E_(9)株F蛋白含有3个分别由25个氨基酸组成的疏水区，存在6个潜在的糖基化位点，13个半胱氨酸残基，裂解位点区域的氨基酸序列为RRQRRF，说明F_(48)E_9株是一株典型的强毒株。氨基酸序列同源性比较发现，F_(48)E_9与鸡源NDV毒株的同源性在91.3%-95.5%，其中与Australia-victoria株同源性高达95.5%，而与鸽源的Ch/98-1株和鹅源的ZJ1株的同源性相对较低(90.6%)。 将真核表达质粒pcDNA3-F高压电转化dam和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株(ZJ111/pcDAN3-F)，并直接转染Vero细胞，分别提取细胞总DNA和总RNA，DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行间接免疫荧光试验可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测结果表明，转染后48hF蛋白开始表达，随后逐渐增多。SDS-PAGE和免疫印迹可检测到55kD的蛋白条带。上述试验结果证实减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给Vero细胞，而且还得到了转录和表达，表达的F蛋白具有免疫反应性。 小鼠安全性试验表明，ZJ111/pcDNA3-F菌株只有在10~9cfu高剂量口服后引起个 别小鼠的死亡，其它各口服剂量组菌没有出现死亡。将ZJ帅CDAN3f以10、fu 的口服剂量口服接种3 日龄非免疫来航鸡，未见任何不良反应，也不影响鸡只的增 重，脾脏、肝脏等主要器官的沙门氏菌在二次免疫后2周己被鸡体的免疫系统所清 除，表明利用 ZJlll作为载体传递 DNA疫苗具有相对安全性。用酶切和 PCR鉴定 法证实在体内外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌 ZJ 111菌株内比较稳定， 表明 ZJ 111为载体传递 DNA疫苗具有良好的稳定性。上 为了进一步探讨利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递NDV DNA疫苗的免疫原 性，将 ZJlll／pCDNA3F菌株分别给 3日龄非免疫鸡以 10、fu、10、fu和 10、fu的 剂量进行首兔，2周后H免，H免后4周攻击强毒株F。止。，观察其免疫原性；同时 设只含空载体pCDNA3的 ZJlll／pCDNA3菌株对照及口服 PBS对照组。结果表明： 重组 ZJlll／PCDNA3F菌株 10、fu和 10、fu免疫组均具有良好的免疫原性，对强毒 株攻击的保护率达66．7％，略高于 10、fu兔疫组K0％人 ZJll帅CDNA3F菌株的 各免疫剂量组于至二免后二周开始出现抗体，随后逐渐上升，10、fu组、10’。u组 10’。刊组至二免后第3周和第4周达到较高水平，但三者并无统计学差异（P＞0刀5）， 而且抗体产生规律也基本相似。ZJll l／pCDNA3F菌株免疫组二免后 4周诱导产生 的法氏囊 B淋巴细胞和胸腺 T淋巴细胞增殖反应显著高于 ZJlll／pCDNA3对照组 （P＜0刀5人这些结果表明ZJ 111 ／pCDNA3＊菌株10、fu为比较理想的免疫剂量， 并提示减毒沙门氏菌为载体不仅可直接将F基因呈递给鸡体细胞进行表达，而且还 能诱导产生抗NDV的体液兔疫和细胞免疫应答。 本试验还比较了减毒沙门氏菌为载体传递NDV DNA疫苗、裸质粒DNA疫苗 和弱毒疫苗的免疫效果。ZJlll／pCDAN3F 以 10bfu的剂量口服免疫，裸质粒 PCDNA3F以 200叱肌肉注射免疫，NDV 11系弱毒疫苗按常规方法滴眼和滴鼻免疫， 2周后每组各以相同的剂量和途径进行二免，二免后4周攻击致死剂量的强毒株 F。术。，观察其免疫效力。结果表明：ZJll l／pCDNA3F免疫组对强毒株的攻击保护 率为66．7％，高于pCDNA3f裸质粒肌肉注射组u0％人11系弱毒疫苗的保护率可三 达 93．3％。三种疫苗都能诱导雏鸡产生NDV抗体，ZJlll／pCDAN3F组和 pCDAN3－
崔平福[9]2007年在《新城疫病毒融合蛋白高效表达及其特异性单克隆抗体的研制和初步应用》文中研究表明用RT-PCR方法从新城疫病毒(NDV)标准强毒株F48E8扩增出融合蛋白(F)基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF。经测序正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中切下并插入到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,得到重组转移载体pFastBac1-NDF;将该载体转座含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,筛选出重组穿梭质粒rBacmid-NDF,并转染Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒reBac-NDF;间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)结果表明,新城疫病毒F48E8株F蛋白在昆虫细胞中获得高效表达。以重组杆状病毒reBac-NDF感染昆虫细胞72-96hr,收获细胞,腹腔免疫BalB/c小鼠。取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用感染了NDV F48E8株的CEF进行IFA检测杂交瘤细胞上清,筛选出5株分泌抗NDV F蛋白的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为NDV-F1D10、NDV-F2F12、NDV-F4D9、NDV-F6C4、NDV-F5C6;经过亚克隆后,所有杂交瘤细胞均保持了分泌抗体的能力;效价测定结果表明,单抗腹水IFA效价分别为1:1600、1:1600、1:1600、1:3200、1:800; IFA显示五株单克隆抗体能与野鸭源NDV和Lasota株感染的CEF反应,均不与MDV、REV、IBDV感染的CEF反应,证明所得的五株单抗是针对NDV F蛋白的特异性单抗,抗NDV F蛋白单抗的获得为NDV F蛋白的相关研究提供了良好的材料。用五株抗NDV F蛋白的单抗检测两种重组MDV CVI988转移载体质粒pucUS10-NDF和pucUS10-eGFP-IRES-F转染COS-1细胞,结果5株单抗中有两株单抗NDV-F1D10和NDV-F2F12 IFA在IFA中呈现亮绿色荧光,表明单抗NDV-F1D10和NDV-F2F12能识别COS-1上暂态表达的F蛋白,可以用于表达F蛋白基因工程苗的检测。
陈礼朋[10]2012年在《鸡新城疫病毒HNO9-69株主要基因的克隆、原核表达及鉴定》文中研究说明新城疫(Newcastle disease.ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽的高度接触性传染病,主要引起呼吸道,神经系统或肠道病变。NDV是单股负链的RNA病毒,为副黏病毒科副黏病毒亚科禽腮腺炎病毒属中的一个成员,基因组编码NP、P、M、F、 HN、L6种主要结构蛋白。另外,P基因可以通过“RNA编辑”方式编码产生额外的两个非结构蛋白——V蛋白和W蛋白。从1926年发现该病以来,NDV传播到世界各个国家和地区,并对世界养禽业及国际贸易造成巨大的经济损失。2009年本实验室从中牟某发病鸡场采集病料,并经病毒分离、鉴定和致病性实验,证明病原为强毒NDV，并命名为HN09-69株。本试验以HN09-69分离株为研究对象,对主要基因分别进行了克隆、原核表达及鉴定。首先根据GenBank录入的NDV的各基因组序列设计5对引物,运用RT-PCR技术从HN09-69分离株的基因组中分别扩增出NP、P、M、F、HN基因的全长ORF序列并测序。对NP、P、M、F、HN基因核苷酸同源性进行比较、序列和进化分析,得出HN09-69株与传统疫苗株La Sota、Clone-30、VG/GA、F48E8、Mukteswar同源性较低,而与水禽分离株FPI-02、SD09、SF02、SDWF02、ZJ1同源性较高,均在96%以上，并与两鸭源分离株SD09、SF02在同一进化分支上,从基因分型上得出HN09-69株属于当前流行的Ⅶd型。对各基因进行基于氨基酸序列的生物信息学分析,表明F、HN存在信号肽和跨膜区。其次,分别以构建的克隆质粒为模板,用上下游分别含BamH I、Xho I立点的引物,亚克隆NP、P、V基因的ORF及M(1-798bp)、F(1119-1506bp)、HN(675-1116bp)基因片段插入到原核表达载体pET-28a(+)中,成功构建了重组原核表达质粒。将鉴定正确的原核表达质粒分别转化BL21(DE3)宿主菌，经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,格重组质粒在BL21(DE3)菌中获得了告效表达,分别在相应位置上出现明显的目的蛋白条带，且NP、P蛋白以可溶性蛋白形式表达,M、F、HN、V蛋白以包涵体蛋白形式表达。然后对各蛋白表达的条件进行优化,并对蛋白进行Western-blot鉴定。用Ni亲和层析柱对NP、P进行大量纯化,后与适量的佐剂混合乳化,做成疫苗,免疫42日龄SPF鸡(300μg/只)。二免后第7天开始采血,并每隔7天采血一次,第21天用F48E8株进行攻毒,观察结果La Sota免疫组的保护率为100%,NP蛋白免疫组和对照组保护率为0,P蛋白免疫组保护率为20%。综上所述,本研究成功克隆了HN09-69株主要基因,构建了原核表达质粒,并实现了其在宿主菌中的高效表达。纯化了NP、P融合蛋白,并进行SPF鸡免疫保护实验,为进一步研究各蛋白的免疫原性和亚单位疫苗奠定基础。
参考文献：
[1]. 新城疫病毒融合蛋白基因的扩增、克隆及其基因片段在大肠杆菌中的表达[D]. 王忠田. 河南农业大学. 2000
[2]. NDV-F的原核表达及其免疫反应性和鸡Ii链与MHCⅡ的真核共表达[D]. 沈艳. 安徽农业大学. 2007
[3]. 鸡新城疫病毒F48E9的纯化及其HN基因片段的原核表达[D]. 赵永许. 西北农林科技大学. 2008
[4]. 鸽新城疫疫苗的研制及其F基因的克隆表达和生物活性研究[D]. 贺奋义. 甘肃农业大学. 2012
[5]. 鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究[D]. 李本强. 上海交通大学. 2015
[6]. 鸡IL-18变构基因与新城疫病毒HN基因融合表达载体的构建及体外抗马立克病肿瘤细胞的研究[D]. 刘一尘. 四川农业大学. 2008
[7]. 从cDNA克隆产生感染性ZJI株鹅源新城疫病毒[D]. 刘玉良. 扬州大学. 2005
[8]. 减毒沙门氏菌作为鸡新城疫口服DNA疫苗载体的基因免疫研究[D]. 梁雪芽. 浙江大学. 2002
[9]. 新城疫病毒融合蛋白高效表达及其特异性单克隆抗体的研制和初步应用[D]. 崔平福. 扬州大学. 2007
[10]. 鸡新城疫病毒HNO9-69株主要基因的克隆、原核表达及鉴定[D]. 陈礼朋. 河南农业大学. 2012
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