苏良科[1]2003年在《马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗的研制》文中指出马链球菌兽疫亚种引致的猪链球菌病主要发生在我国，国外报道较少。该菌可引起牛、马的子宫内膜炎，流产，牛乳腺炎，猪的化脓性关节炎和败血症。它的致病因子包括非抗原性的透明质酸荚膜、透明质酸、链溶素O、链激酶、IgG Fc受体蛋白、肽聚糖和类M蛋白。在这些毒力因子中，最重要的是类M蛋白。它不但具有抗吞噬作用，而且还是链球菌良好的免疫原。所以它一直是研制链球菌疫苗的焦点。国内外迄今尚无理想的猪链球菌病疫苗。本试验的宗旨是从我国具体情况出发，研制安全高效、针对性强的马链球菌兽疫亚种类M蛋白的亚单位疫苗。 要研制疫苗，良好的免疫原是关键。为此，本文进行了以下方面的工作：首先用热酸法提取了马链球菌兽疫亚种中国株ATCC35246的类M蛋白，并克隆表达了ATCC35246类M蛋白位于胞外的、保守的抗原表位。再将热酸提取的类M蛋白、重组表达的类M蛋白和灭活的ATCC35246全菌分别免疫小鼠，通过对小鼠的保护率筛选出热酸提取的类M蛋白免疫原性最好。 亚单位疫苗由于仅含保护性免疫所需要的抗原，抗原表位不够丰富，免疫原性往往较弱，一般使用佐剂来弥补。为提高类M蛋白亚单位疫苗的免疫效果，将热酸提取的类M蛋白于铝胶、CpG和ISA206佐剂配合，免疫小鼠，拟筛选出免疫增强效果最好的一种佐剂。试验结果显示ISA206佐剂能激发快速长期的免疫反应，抗体效价高，而且对小鼠的刺激性弱，显示出该佐剂有望与类M蛋白亚单位疫苗配合，用于预防猪链球菌病。 为进一步了解类M蛋白的致病机制，本文以通用的HEp-2细胞为模型，研究了ATCC35246类M蛋白的粘附作用。试验结果表明，类M蛋白是ATCC35246株的粘附素之一，它可能是以N末端与HEp-2细胞表面受体结合；热酸提取的类M蛋白要比重组表达的类M蛋白对细菌粘附细胞的抑制作用要强，但两者都不能完全抑制粘附，显示链球菌还有其它有待发现的粘附机制存在。
袁娟[2]2011年在《马链球菌兽疫亚种全菌结合类M蛋白亚单位灭活疫苗的研制》文中研究说明马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi Subsp.zooepidemicus, SEZ)是引发猪链球菌病的主要病原之一,主要引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎、及突发性死亡。其引起的动物疫病呈世界性分布,是目前危害我国猪群最严重的细菌性传染病之一。马链球菌兽疫亚种的类M蛋白(M-like protein, SzP)是一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗抗体的吞噬细胞对其的吞噬作用。本实验对具有免疫原性的类M蛋白进行原核表达,以期制造出可以对马链球菌兽疫亚种引致的猪链球菌病进行有效预防的疫苗。根据已经发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi Subsp.zooepidemicus)猪源菌株的类M蛋白序列设计合成一对引物,以CY株基因组为模板,通过PCR技术,扩增类M蛋白基因并定向克隆于pMD-18T载体中,鉴定阳性质粒插入片段的正确性,将目的基因片段定向克隆至pGEX-4T-1表达载体的BamH I和Xho I位点之间。重组质粒经限制性酶切鉴定和测序,以验证其阅读框架的正确性。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,可获得分子量约为64kD的融合蛋白。通过和类M蛋白的多克隆抗体免疫印迹分析表明,表达的融合蛋白同时具有类M蛋白的抗原性。以不同含量的融合蛋白加入马链球菌兽疫亚种全菌灭活疫苗分别免疫仔猪5头,同时以马链球菌兽疫亚种全菌灭活疫苗免疫对照组仔猪,免疫后21d用2倍MLD的CY菌(105CFU)进行攻毒,结果显示所制混合疫苗的免疫保护率优于全菌灭活苗；且联合疫苗的最小免疫剂量可为重组蛋白(0.125mg)+CY(8×108CFU)。
王建, 刘佩红, 沈素芳, 沈莉萍, 王永康[3]2005年在《马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗小鼠免疫试验》文中提出马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)是我国引致猪链球菌病的主要病原之一。为获得安全高效的疫苗,试制马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗。应用热酸法提取马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白,并分别采用羟基磷灰石(HAT)层析和冷酒精沉淀法进行纯化,结果得到较纯的类M蛋白。用热酸提取的粗制类M蛋白、两种纯化的类M蛋白及全菌苗免疫小鼠,结果保护率分别为92%(11/12)、100%(12/12)、100%(12/12)和83%(10/12)。表明类M蛋白亚单位疫苗有进一步开发的必要。
王建, 刘佩红, 沈素芳, 沈莉萍, 王永康[4]2006年在《马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗小鼠免疫试验》文中认为为获得控制猪链球菌病安全高效的疫苗,本试验进行了马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗的研制。应用热酸法提取马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白,并分别采用羟基磷灰石(HAT)层析和冷酒精沉淀法进行纯化,结果得到较纯的类M蛋白。用热酸提取的粗制类M蛋白、2种纯化的类M蛋白及全菌苗免疫小鼠,结果保护率分别为92%(11/12)、100%(12/12)、100%(12/12)和83%(10/12),表明类M蛋白亚单位疫苗有进一步开发的必要。
范红结[5]2003年在《猪源链球菌类M蛋白基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验》文中研究表明马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)和猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)是重要的人兽共患病的病原，能引起猪和人类的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及突发性死亡，对养猪业造成巨大的经济损失。马链球菌兽疫亚种表面的类M蛋白(M-like protein)和猪链球菌2型表面的溶菌酶释放蛋白(Muramidase released protein,MRP)是重要的毒力因子和保护性抗原。本文在分子水平对以上毒力因子进行了较系统的研究，并将二者进行了串连表达及猪体免疫试验，为猪链球菌病的防制进行了有益的探索。 1 马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因克隆，序列分析及猪源链球菌类M蛋白基因检测 根据已发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的类M蛋白基因序列，设计和合成一对引物，以猪源马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a(+)中，测定其序列，在GenBank登录，接收号为AY263781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框，全长为1137bp，编码379个氨基酸残基。经DNA Star软件分析，ATCC35246株类M蛋白基因与马源兽疫亚种W60株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为86.9％、30.8％、29.4％；推导的氨基酸序列的同源性分别为84.3％、21.9％、23.4％。但ATCC35246株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验，检测34株猪源链球菌类M蛋白基因，发现所有C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因，而所有猪链球菌(Streptococcus suis)1型和2型菌株及B群、D群链球菌均不能检出类M蛋白基因。 本研究首次克隆了猪源马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因，并对该基因进行了序列分析，证实马链球菌兽疫亚种猪源株与马源株有较大差异。 2 猪源马链球菌兽疫亚种9株中国株类M蛋白基因的克隆与序列分析 利用PCR技术，分别扩增国内9省市从1974～2003年分离的马链球菌兽疫亚种类的M蛋白基因，对其进行克隆、测序及序列分析，进而推导其相应的氨基酸序列。结果发现，9分离株中的7株类M蛋白基因片段长度为1 137bp，含一个阅读框，编猪源链球菌类M基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验码379个氨基酸残基，另外两株eG一74一63和Cp一。一04的长度分别为1 143bp及1125bp。除CP一0104分离株外，8株菌的类M基因的核普酸同源性高达%.9%一99.9%，推导的相应氨基酸序歹，】同源性高达95.30，0一x00o，o。上述测定的ATCC35246、CC、CxyolZ、SH0016、CY分离株类M基因序歹.J已被GenBank收录，登录号分别为AY263781、AY263782、 AY263783、AY263784、AY265990.上述9株猪源株与国外发表的马源马链球菌兽疫亚种W60株类M基因的核普酸同源性达81.6%一87.0%，推导的相应氛基酸序列同源性为78.1%一84.3%;猪源株与人源马链球菌兽疫亚种类M基因的核普酸同源性为81 .7%~91.8%，推导的相应氨基酸序列同源性为76.0%一90.5%. 9株分离株除CP一0104株外，信号肤的序列完全一致，与马源马链球菌兽疚亚种W60株类M蛋白的信号肤相比，其27、28、30、32位的氨基酸残基分别由S、S、V、A突变为G、v、A、5.在类M蛋白的C末端，9株分离株的细胞锚定区的序列亦完全一致，均含有LPSTGE共同的基序.在类M蛋白的高变区，通过比较9株兽疫亚种分离株推导的类M蛋白的氨基酸序歹，l发现，Al，CC35246、CC、CY、SH0016、CT、CG一74一63等6株分离株类M蛋白高变区的氨基酸完全一致，其余3株分离株有较小的差异.其中，CXY012株109位氨基酸残基由L突变为F，143位氨基酸残基由A突变为E，157位由K突变为E。CW03株第113、116位氨基酸残基由I、K突变为F、E，第121、127、137、139、140等处由E、Q、R、D、A突变为K、P、H、T、T.CP一0104与其它猪源链球菌高变区的变异更大，在106、107、111、116、118、121、122、123等 28处的氨基酸发生T突变，且在126-128、140一146位分别缺失了3个和6个氛基酸残基。酶切位点分析显示，9株分离株均在524ni处出现Hindln酶切位点，而人源和马源分离株均没有该酶切位点. 本结果研究表明马链球菌兽疫亚种类M蛋白具有宿主特异性，与马源、人源兽疫亚种分离株类M蛋白的差异主要在106一1“位氛基酸的高变区及27一32位氨基酸残基的信号肤。3马链球菌兽疫亚种10株国内分离株对小鼠免疫效力的评价 取国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种，分别制备灭活杭原，免疫清洁级ICR小鼠。小鼠分20组，每组10只，分别用以上10株菌免疫，然后用同源菌株和ATCC35246株攻击。结果表明，同源菌株攻击，免疫保护率均在90%以上;而以ATCC35246攻击异源菌免疫的小鼠，免疫保护率为80%一100%.本研究结果表明，我国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的杭原性差异不大，单一菌株疫苗可用于不同地区的猪群。中文摘要4猪链球菌2型mrP基因免疫功能片段的克隆、表达及动物试验 根据猪链球菌2型(StrePcococcus suis
唐福余[6]2008年在《马链球菌兽疫亚种类M基因缺失株的构建及生物特性分析》文中提出马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ)对集约化养猪业的发展危害严重,同时对养猪业的相关从业人员的健康具有潜在威胁。类M蛋白是该菌一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗的吞噬细胞对其的吞噬作用。本试验构建了类M蛋白基因(szp)的缺失株,在分子水平上对马链球菌兽疫亚种类M蛋白的粘附机制进行了研究,同时,通过动物模型评价了该突变株的毒力和免疫原性。因此本研究所构建的ATCC35246的类M蛋白基因缺失突变弱毒菌株,为该菌的致病机制及引起的猪链球菌病的防控进行了有益的探索。1链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因缺失株的构建根据已发表的马链球菌兽疫亚种猪源ATCC35246株的类M蛋白基因序列,设计和合成一对基因步移引物,并以ATCC35246株的基因组DNA为模板,通过基因步移技术,扩增出类M蛋白左右两翼基因。为了敲除类M蛋白基因,以ATCC35246为始发菌株,构建基因重组质粒PUC-18,利用同源重组的原理构建了ATCC35246的类M蛋白基因缺失突变菌株(缺失了类M蛋白基因共1090bp)并对该菌株的致病力、小鼠模型的免疫保护作用进行了研究。结果表明,ATCC35246的类M蛋白基因缺失突变菌株对实验小鼠的致病性明显减弱;突变株能对小鼠提供良好的免疫保护,半定量RT-PCR显示,免疫鼠IL-2、IFN-γ基因的转录水平显著升高。所以经免疫的小鼠可以获得良好的被动免疫保护作用。为了进一步确定szp基因的具体作用,进行了马链球菌兽疫亚种szp基因缺失株的基因互补实验。实验证实基因互补株与野生株的生物特性基本一致。因此本研究所构建的ATCC35246的szp基因缺失突变弱毒菌株可作为预防ATCC35246感染的疫苗候选株,为最终研究制出马链球菌兽疫亚种链球菌的基因工程菌苗奠定基础。2类M蛋白及其基因缺失株对HEp-2细胞的粘附作用采用通用的模式细胞HEp-2细胞,研究马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白的粘附作用。结果显示,用重组的ATCC35246株类M蛋白预处理HEp-2细胞,当类M蛋白的量达到3.2μg/200μL,可显示为阳性;用重组表达的类M蛋白单抗处理类M蛋白,可抑制其对HEp-2细胞的粘附,在1.8μg/500μL能完全抑制它对HEp-2细胞的粘附,说明其单抗对应的抗原表位在细胞粘附中具有决定性作用。同时发现,亲本株及szp基因缺失株均对HEp-2细胞有黏附和侵袭力,但szp基因缺失株黏附能力降低50%以上。电镜观察结果显示,黏附部位是细胞膜和细胞微绒毛,并观察链球菌内化现象。以上结果提示,上皮细胞是SEZ的定植细胞;菌株黏附后直接侵入细胞内是其穿过上皮细胞屏障的机制之一。
王烨[7]2011年在《马链球菌兽疫亚种新保护性抗原的鉴定》文中认为马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, SEZ)属于兰氏分群的C群β溶血链球菌,能够感染多种动物及人类。在我国,该菌是猪链球菌病的主要病原,能引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎及突发性死亡,并对相关从业人员的健康构成潜在威胁。尽管目前国内市场上已有多种预防C群链球菌疫苗,但其免疫保护效果往往不能令人满意,因此安全、高效的新型疫苗仍有待研究。本实验室已采用免疫蛋白组学方法筛选马链球菌兽疫亚种ATCC35246株细胞壁相关蛋白,并成功鉴定出10种免疫原性蛋白。多数蛋白在马链球菌兽疫亚种上未曾见报道,其是否为保护性抗原仍需进一步鉴定。本文根据GenBank上已公布的这10种蛋白的基因序列,分析选择免疫原性较好部分的基因序列设计并合成引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246株基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增出目的基因并定向克隆至表达载体pET-32a(+)、pET-28a(+)中,然后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)。通过PCR鉴定和重组质粒双酶切鉴定后,挑取阳性克隆菌进行IPTG诱导表达。经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白均获得良好的表达,大小与预期值一致。Western-blot显示,融合蛋白均可被猪源ATCC35236株康复血清识别,表明其具有天然蛋白的部分抗原性。重组融合蛋白经亲和层析纯化后,与等量ISA206佐剂进行乳化。通过皮下免疫途径分组免疫ICR小鼠,并以ATCC35246全菌灭活苗和PBS作为对照组。用间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体,并通过体外调理吞噬试验测定抗血清的调理活性。结果表明重组蛋白免疫小鼠后能有效产生免疫应答,血清中抗体水平有明显升高,且有良好的补体依赖的调理吞噬功能。二免后以5LD50 ATCC35246强毒株进行腹腔攻击,结果显示试验组存活率优于PBS对照组,其中免疫EF-G融合蛋白组小鼠的保护率达到50%,免疫TF、TK、GAPDH、PPH融合蛋白组均达到37.5%,表明原核表达产物免疫ICR小鼠,可使其对同源菌株攻击产生一定的保护作用,在亚单位疫苗研制中具有应用价值。
王建[8]2001年在《猪链球菌病疫苗的研制》文中提出对上海地区40多个规模性养猪场1997-2000年间猪链球菌病的流行情况进行了调查，从发病猪群中分离的19株链球菌，对其进行病原特性鉴定及血清学定型，结果7株为C群的马链球菌兽疫亚种（S.equi subsp. zooepidemicus），4株为R群的猪链球菌2型（Strep. suis type 2），B群及D群链球菌各一株，一株与A群和C群有交叉反应，7株未能定型。 在马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型的分离株中筛选毒力强、免疫原性好的ATCC35246和JS2-4株作为制备疫苗用的生产菌株。比较不同培养基、培养方法对细菌生长的影响，优化培养条件。 建立了人工感染猪链球菌2型的仔猪动物模型，为疫苗效力检验提供了手段。 制备了氢氧化铝胶二联灭活苗。无菌及安全检验合格后，肌肉接种仔猪2ml/头，免疫15天后，分别用ATCC35246和JS2-4株攻击，结果猪链球菌2型可获100％保护（10/10），马链球菌兽疫亚种可获90％保护（9/10）。二联苗免疫后4周内抗体水平持续上升，从第五周开始逐渐下降，经过二免后，抗体水平迅速回升，两个半月后仍维持较高水平。攻毒保护试验和抗体消长规律的测定表明，猪链球菌病二联苗具有良好的免疫保护作用。 建立了检测猪链球菌二联灭活苗抗体的间接ELISA方法，试验证明该法特异性好，比琼扩试验敏感。检测氢氧化铝胶、蜂胶、矿物油佐剂上述二联疫苗的抗体消长情况，铝胶苗的起始抗体比油佐剂和蜂胶苗高，油佐剂苗JS2-4株的抗体水平与铝胶苗相近，但ATCC35246株的抗体水平比铝胶苗低，蜂胶苗的抗体水平最低。铝胶苗抗体水平在首免第四周达到高峰以后下降较快，但二免后迅速上升，120天后仍维持较高水平（1:1000）。 应用热酸法提取马链球菌兽疫亚种类M蛋白，并采用羟基磷灰石（HAT）层析和冷酒精沉淀法进行纯化，结果得到较纯的类M蛋白，用两种纯化方法得到的类M蛋白免疫健康小鼠，结果保护率均为100％，而全菌苗的保护率为83％。表明类M蛋白亚单位疫苗有很好的发展前景。
范红结, 陆承平, 唐家琪[9]2003年在《马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验》文中进行了进一步梳理将含猪链球菌 2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,表达了相对分子质量为 6 0 0 0 0左右的融合蛋白。利用组氨酸亲和层析柱 ,获得了纯化的融合蛋白 ,质量浓度为 4 2 μg·mL-1。以纯化的融合蛋白、宿主菌BL 2 1经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清、马链球菌兽疫亚种ATCC 35 2 4 6株和猪链球菌 2型HA 980 1株制备的二联灭活苗为免疫原 ,分别免疫 30头仔猪。初次免疫 1月后 ,以同样的剂量再次免疫 ,3周后以 5×LD50 的ATCC 35 2 4 6和HA 980 1强毒株进行攻击。结果 ,纯化融合蛋白免疫组的免疫保护率达 6 0 % ,BL 2 1上清免疫组的免疫保护率为 5 0 % ,全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达 90 %。
苏良科, 陆承平[10]2004年在《马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗小鼠免疫效果评价》文中研究说明马链球菌兽疫亚种旧名马腺疫链球菌, 多年来是引致我国猪链球菌病的主要病原。链球菌类M蛋白是一种二聚体丝状蛋白,C端为保守区域锚在细胞膜上并跨越整个细胞壁,与其它革兰氏阳性菌的表面蛋白有结构上的同源性。类M蛋白和荚膜多糖都有抗吞噬细胞的吞噬作用,有利于细菌
参考文献：
[1]. 马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗的研制[D]. 苏良科. 南京农业大学. 2003
[2]. 马链球菌兽疫亚种全菌结合类M蛋白亚单位灭活疫苗的研制[D]. 袁娟. 南京农业大学. 2011
[3]. 马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗小鼠免疫试验[C]. 王建, 刘佩红, 沈素芳, 沈莉萍, 王永康. 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集. 2005
[4]. 马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗小鼠免疫试验[J]. 王建, 刘佩红, 沈素芳, 沈莉萍, 王永康. 中国兽医学报. 2006
[5]. 猪源链球菌类M蛋白基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验[D]. 范红结. 南京农业大学. 2003
[6]. 马链球菌兽疫亚种类M基因缺失株的构建及生物特性分析[D]. 唐福余. 南京农业大学. 2008
[7]. 马链球菌兽疫亚种新保护性抗原的鉴定[D]. 王烨. 南京农业大学. 2011
[8]. 猪链球菌病疫苗的研制[D]. 王建. 南京农业大学. 2001
[9]. 马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验[J]. 范红结, 陆承平, 唐家琪. 南京农业大学学报. 2003
[10]. 马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗小鼠免疫效果评价[J]. 苏良科, 陆承平. 农业生物技术学报. 2004
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