路福平[1]1996年在《无抗菌活性放线菌的激活和抗生素筛选新方法的研究》文中提出抗生素的毒副作用和致病菌的耐药性都要求抗生素应不断更新换代，传统的筛选方法往往造成筛选重复率增加，工作效率下降。目前新抗生素的筛选一般从筛选模塑、抗生素来源、生物合成技术以及发酵产物的分离提取等方面人手。 本论文首先以抗生素传统筛选模型中的大肠杆菌、产气杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母和白色念珠菌为出发菌株，经物理化学诱变，筛选出对四大类抗细菌抗生素、放线菌酮和多烯大环内酯类抗真菌抗生素敏感性不同的八支突变株，由此组成的新筛选模型和微生物发酵液的多种溶剂综合纸层析色谱可以为抗生素筛选的早期鉴别提供依据。 实验选择腐殖酸含量高、微酸性的稻田土作为分离源，分离出60支诺卡氏菌形放线菌，其中No．20能产生一种新结构的抗菌化合物，另两支菌No．12和No．38经鉴定为天然无抗菌活性的菌株。 以No．12和No．38为出发菌，通过澳化乙锭(EB)、硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变实验以及产利复霉素的地中海诺卡氏菌AS.4895蛋氨酸缺陷突变株单亲株灭活的原生质体和No．12、No．38原生质体融合实验。使两支天然无活性的菌株得到了激活，其代谢产物表现出抗菌活性。其中DES+EB的诱变得到一激活变株No．12-12，EB+UV处理得到三支变活株No．38-86、No．12-103、No．12-6，单亲株灭活原生质体融合实验选育出三个活性融合子F12-1、F38-1、F38-2。这些活性株中，所有No．38的变株都产生安莎霉素类抗生素，而No．12的变株中所产的抗生素至少有两种，但在传代实验中，只有No．12-103遗传性状稳定。并能分泌出两种活性物。 实验确定了No．12-103抗菌物发酵工艺，同时对其分离纯化也作了初步探讨。预处理后的发酵液减压浓缩，再经硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱层析以及硅胶GF_(254)制备性薄板层析得到两个单一纯组份，均为淡黄色无晶形固体，易溶于水，溶于甲醇，微溶于乙醇，不溶于氯仿、丙酮、苯、正丁醇和乙酸乙酯等
肖静[2]2007年在《红树林放线菌的分离及其生物活性物质的初步研究》文中认为红树林是热带或亚热带海岸潮间带所特有的木本植物群落，具有非常重要的经济和生态学价值。红树林蕴涵着丰富独特的海洋微生物资源，特别是以次级代谢产物多样性而著称的放线菌。本文以福建漳江口红树林自然保护区的土壤沉积物为样品，选择性分离培养其中的放线菌。以枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色假丝酵母和水稻纹枯病原菌为指示菌检测分离株发酵液的抗菌活性，结果显示42.3％的放线菌发酵液具有抗菌作用。以肝癌细胞BEL7402、肺癌细胞A549和白血病细胞HL60三种肿瘤细胞为指示细胞检测分离株发酵液的细胞毒活性，结果显示37.4％的放线菌发酵液对肿瘤细胞具有毒活性。对所分离菌株的16S rDNA的序列多样性分析发现其中163株分离菌株分属链霉菌(89％)、小单孢菌(6.1％)、糖单孢菌(0.6％)、马杜拉放线菌(3.7％)和拟诺卡氏菌(0.6％)属。其中三株链霉菌MGR035、MGR082、MGR105与已知链霉菌Streptomycescaparticus、Streptomyces glauciniger、Streptomyces cacaoi subsp．cacaoi的相似性低于97％，可能为三个新种。用根据负责聚酮类化合物主链合成(Ⅰ／Ⅱ型PKS)和非核糖体肽合成(NRPS)的基因保守区域设计的3对兼并引物，分别对分离菌株的基因组进行PCR检测，以扩增片段的有无来衡量菌株产活性物质的潜力并分析扩增片断的多样性。已检测的77株菌包括放线菌的5个属，其中链霉菌是产生聚酮类化合物和非核糖体多肽的最丰富的菌源：66株链霉菌的Ⅰ型PKS基因的阳性率为36.4％，Ⅱ型PKS的阳性率为59.1％，NRPS的阳性率为51.5％；其他种属(包括小单孢菌属和稀有放线菌属)的菌株也检测到PKS和NRPS的基因。对菌株的抗菌活性和细胞毒活性测定结果与次级代谢产物合成相关基因扩增结果进行比较发现两者无一一对应联系。不显示抗菌或细胞毒活性的菌株中有的依然存在次级代谢产物合成相关基因。而16S rDNA序列相似性高的菌株可能具有不同的抗菌活性和不同的PKS／NRPS合成基因。同时部分稀有放线菌的PKS基因序列与链霉菌的进化关系较远，可能具有合成结构新颖的化合物的潜力。这些结果显示本文分离的放线菌菌株不仅具有种属的多样性，在次级代谢合成相关基因上具有更复杂的多样性。以两株没有检测到抗菌活性，但PCR检测具有聚酮合酶和非核糖体多肽合成能力的链霉菌MGR157、MGR010为出发菌株，引入抗生素抗性，分别筛选获得MGR157的链霉素、庆大霉素抗性突变株和MGR010的利福霉素抗性突变株。用生物测定检测抗性突变株的抗菌活性发现，部分突变株获得抗菌活性且突变株的菌落形态、孢子颜色等表型与出发菌株有显著的差异。实验结果表明应用通过引入核糖体蛋白突变的核糖体工程技术，能够激发海洋放线菌产活性物质的潜能，从而提高红树林放线菌菌种资源的利用效率。
耿香[3]2014年在《利用基因组挖掘发现两株海洋链霉菌的生物活性及活性物质初步研究》文中指出海洋环境的特殊性使海洋放线茵产生许多独特的活性化合物,引起了国内外学者的广泛关注。微生物基因组挖掘是一种寻找次级代谢产物的新方法,通过分析微生物的基因组信息,预测其合成天然化合物的潜能,进而根据所获得的信息对化合物进行分离纯化和结构鉴定,从而迅速发现可能的新化合物。基因组挖掘技术已成为微生物天然产物的研究热点,但海洋放线菌的基因组挖掘目前报道的还比较少。本论文对本课题组保存的两株海洋放线菌(硫磺链霉菌L180和星海链霉菌S187)进行了初步的基因组挖掘研究,基因组序列分析表明,L180基因组中存在一个羊毛硫抗生素的生物合成基因簇,该基因簇与来自稀有放线菌的具有抗藤黄微球菌活性的抗生素生物合成基因簇具有较高的相似性。而S187中分析到一个非核糖体多肽类化合物的生物合成基因簇,该基因簇与合成具有抗补体活性抗生素的生物合成基因簇具有较高相似性。根据这些信息推断,硫磺链霉菌L180和星海链霉菌S187可分别产生抗菌活性物质和抗补体活性物质,进一步实验证明了对于两株菌发酵液活性的推断。对硫磺链霉菌L180发酵液的抗菌活性进行了研究,发现其对藤黄微球菌有较强的抗菌活性,对耐药鲍曼不动杆菌具有较弱的抗菌活性,但对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯氏菌没有抗菌活性。同时利用藤黄微球菌对抗菌活性物质的理化稳定性进行了研究,结果表明,抗菌活性物质在30℃～60℃,pH4-6范围内稳定性良好,蛋白酶处理不影响其抗菌活性。对抗菌活性物质进行了初步纯化,初步定位了HPLC分析中的可能保留时间段。星海链霉菌可能的抗补体活性物质生物合成基因簇中存在一个编码StrR家族的途径特异性调节蛋白基因sinR,为了定位可能的抗补体化合物,构建了sinR基因的过表达突变株,研究了该基因对菌株抗补体活性的影响,结果表明,菌株发酵8d时,过表达sinR菌株抗补体活性明显高于对照菌株。对抗补体活性物质进行了初步纯化,利用正向硅胶对发酵液乙酸乙酯萃取相进行初步分离,得到了有活性的四个组分,其中组分Fr-A-7的活性最高(63%)；此外,利用正向硅胶对菌丝体中的活性物质进行分离,菌体先用乙酸乙酯萃取,再用正丁醇萃取乙酸乙酯萃取后的水相,得到了有活性的四个组分,其中组分Fr-B-8的活性最高(58%)。初步定位了目标化合物HPLC分析中的保留时间,约为8.9min。液质联用(HPLC-MS)检测组分Fr-A-7,初步得到了四个符合预测分子量范围的信号。本论文的结果为进一步研究硫磺链霉菌L180和星海链霉菌S187的活性新天然产物奠定了基础,并为进一步开发海洋放线菌的基因资源提供了有价值的信息。
吕淑君, 陈能[4]1996年在《从具沉默抗性基因的链霉菌中筛选新的抗菌物质》文中认为本文设计了一种新抗生素筛选方法。用抗生素抗性基因探针的菌落杂交方法，从大量野生型链霉菌中筛选可能含有抗生素抗性沉默基因的若干天然无抗菌活性的链霉菌作为诱变对象，再通过紫外线诱变，原生质体再生、融合等手段来处理这些链霉菌，使其产生了抗菌活性。其中孢囊链霉菌ＳＰ－９２９９的代谢产物对多株耐甲氧西林的葡萄球菌敏感。本文报道了筛选方法、筛选结果和ＳＰ－９２９９代谢物的抗耐药菌活性。
乌云达来[5]2009年在《广谱抗菌活性Lactobacillus acidophilus NX2-6的分离筛选及其抗菌物质的研究》文中认为随着人民生活水平的提高和食品安全意识的增强,人们对食品的安全卫生和自身健康状况日益关注,天然食品和绿色食品更容易被消费者认可和接受,因此研究开发广谱、高效、稳定、安全的天然抗菌物质已成为当今国际食品防腐剂发展的主要方向。其中微生物来源的天然防腐剂,由于生产成本低廉、来源广泛等原因,目前已成为研究热点。酸马奶是集营养和保健于一体的蒙古族的传统乳制品,从中筛选产抗菌物质的乳酸菌,既安全、新颖又有挖掘潜力。为此,本文以内蒙古锡林浩特地区牧民的传统发酵酸马奶为菌种来源,对其进行乳酸菌的分离鉴定,并在其中筛选出具有广谱抗菌活性的菌株,并利用HPLC、ESI-MS/CID及MALDI-TOF/TOF-MS等分析技术对抗菌物质进行结构鉴定,同时对抗菌物质的理化性质,抗菌物质对大肠杆菌的作用机理进行了研究。为开发新型微生物源天然防腐剂提供理论基础。具体研究结果如下：1.从内蒙古锡林浩特地区的6份酸马奶样品中分离到82株乳酸菌,以Lactobacillus acidophilus ATCC 4356、Lactobacilus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 1002、Lactococcus lactis subsp. lactis IFO 12007以及Enterococcus faecalis IFO3427等4株标准菌株作为对照菌株,对其进行生物学特性研究,其鉴定结果为：38株乳杆菌分别为14株嗜酸乳杆菌、11株干酪乳杆菌、7株植物乳杆菌、2株弯曲乳杆菌及4株詹氏乳杆菌；44株乳球菌分别为10株粪肠球菌、22株乳酸乳球菌乳酸亚种、3株肠膜明串珠菌葡聚糖亚种及9株嗜热链球菌。2.内蒙古锡林浩特地区酸马奶乳酸菌中的乳杆菌主要以嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌为主,分别占总分离株的17.1%和13.4%；乳球菌主要以乳酸乳球菌乳酸亚种、粪肠球菌及嗜热链球菌为主,分别占总分离株的26.8%、12.2%及11.0%。乳杆菌和乳球菌比例相差不大,这可能与取样区域、时机和分离条件(如温度、酸度)可直接影响着乳酸菌的分离率和分离乳酸菌的种类。3.82株乳酸茵中31株茵显示了抗菌活性,占总菌数的37.8%；其中27株菌对大肠杆菌和蜡状芽孢杆菌都有抗菌活性,占总菌数的32.9%。在这27株茵中乳杆菌和乳球菌各有15和12株,分别占乳杆菌和乳球菌总数的39.5%和27.3%。根据其抗菌活性复筛结果得知,嗜酸乳杆菌NX2-6对大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌和米曲霉均显示了较强的抗菌活性,因此将菌株NX2-6确定为研究抗菌物质的供试菌株。对其进行形态特征观察并通过16S rDNA基因序列测定,获得16S rDNA序列长度为1480 bp,此序列已在GenBank数据库中登录,登录号是EU878007。4.嗜酸乳杆菌NX2-6产生的抗菌物质具有热稳定性,在pH值2.0-5.0范围内具有抗菌活性,细菌素的活性随pH值得上升而逐步降低,pH 6.0时失去抗菌活性。对胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K敏感,但对α-胰凝乳蛋白酶不敏感。虽然用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后抑菌圈直径显著缩小,但仍具有很强的抑菌作用,并且抗菌物质对紫外线照射具有较好的稳定性,因此表明该抗菌物质为蛋白类物质或者非单一的抗菌物质。抗菌物质对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均显示了抗菌活性,是一种广谱抗菌活性物质。5.对嗜酸乳杆菌NX2-6产生的抗菌物质进行分子结构鉴定研究。结果表明,其分子量集中于50 Kda以下。抗菌物质的最大紫外光谱吸收峰在219.00 nm处。将抗菌物质经高效液相色谱(HPLC)分离纯化获得具有抗菌活性的组分1和组分2的纯物质。对这两个组分进行ESI-MS/CID和MALDI-TOF/TOF-MS分析得知,组分1中的抗菌活性物质是分子量为118.05的琥珀酸。对组分2进行MALDI-TOF／TOF-MS分析结果表明,组分2是分子量为825.149的肽类物质,由7个氨基酸组成,排列顺序为Asn-Thr-Arg-Tyr-Lys-Ser-Gly,是一个新型抗菌肽,命名为acidocin NX2-6.6.为了提高嗜酸乳杆菌NX2-6产生抗菌物质的得率,采用Plackett-Burman试验设计对培养基的10种成分和培养温度、培养时间、起始pH及接种量等14个相关因素进行筛选,发现在PB设计的二水平范围内,葡萄糖、乙酸钠和培养时间与抗菌物质得率显著正相关(p<0.05),柠檬酸三钠水合物对抗菌物质得率产生显著的负效应(p<0.05),其它相关因素没有显著效应(p>0.05)。7.通过响应曲面法对嗜酸乳杆菌NX2-6产生抗菌物质具有显著影响的4个因素：葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸三钠水合物以及培养时间的最佳组合水平建立了二次多项数学模型。对该模型方程求解得出,在各因素分别为：葡萄糖浓度60.0 g／L、乙酸钠浓度8.0 g／L、柠檬酸三钠水合物浓度5.0g／L及培养时间36 h时,可获得最大的抑菌圈直径,预测值为21.37 mm。此预测值被5组验证实验所证实,相关系数R2为0.9918。8.嗜酸乳杆菌NX2-6产生抗菌物质的最佳发酵条件确定为：蛋白胨20.0g／L、牛肉浸膏20.0g／L、酵母浸出粉10.0 g／L、葡萄糖60.0g／L、吐温-80 3.0 g／L、K2HPO4·3H2O 4.0 g／L、乙酸钠8.0 g／L、MgSO4·7H2O 400.0 mg／L,、MnSO4·H2O 76.0mg／L、柠檬酸三钠水合物6.0 g／L、起始pH 6.0、培养温度40℃、接种量2%(V／V)及培养时间36 h。在优化的发酵条件下,嗜酸乳杆菌NX2-6发酵液抗菌活性增加约80.0%。9.嗜酸乳杆菌NX2-6所产的抗菌物质对大肠杆菌的最小抑菌浓度为895.8μg／mL。该抗菌物质对繁殖期和非繁殖期大肠杆菌细胞具有较高的抑菌活性,其主要作用于大肠杆菌细胞膜,然后进一步溶解菌体而起到杀菌作用。
林文良[6]1994年在《新抗生素筛选的基本原理》文中提出从青霉素问世到现在，抗生素的研究开发经历了漫长的发展过程，取得了极大的成就。综观抗生素的发展历史，主要是天然抗生素筛选方法的创新过程，从瓦克斯曼建立筛选方法起，经50多年众多学者的系统研究，文献报道方法很多，其成功的方法多建立在药物作用、受体反应，和二者
参考文献：
[1]. 无抗菌活性放线菌的激活和抗生素筛选新方法的研究[D]. 路福平. 华南理工大学. 1996
[2]. 红树林放线菌的分离及其生物活性物质的初步研究[D]. 肖静. 华中农业大学. 2007
[3]. 利用基因组挖掘发现两株海洋链霉菌的生物活性及活性物质初步研究[D]. 耿香. 大连理工大学. 2014
[4]. 从具沉默抗性基因的链霉菌中筛选新的抗菌物质[J]. 吕淑君, 陈能. 中国抗生素杂志. 1996
[5]. 广谱抗菌活性Lactobacillus acidophilus NX2-6的分离筛选及其抗菌物质的研究[D]. 乌云达来. 南京农业大学. 2009
[6]. 新抗生素筛选的基本原理[J]. 林文良. 海峡药学. 1994