于洪升, 费从合, 沈方臻, 梁军[1]2003年在《低剂量辐射对肿瘤细胞凋亡、细胞周期以及凋亡相关蛋白bcl-2的影响》文中认为目的 探讨低剂量辐射对小鼠移植肿瘤细胞的凋亡、细胞周期以及相关蛋白bcl 2表达的影响。方法 昆明种雄性小鼠左后肢腹股沟皮下接种S1 80肉瘤细胞 ,接种后 7dγ射线全身照射 75mGy,照射后 2 4 ,48h分别处死 ,直接测量肿瘤大小变化 ,并取肿瘤组织分别进行流式细胞仪分析凋亡、细胞周期 ,以免疫组化染色半定量分析凋亡相关蛋白bcl 2表达的变化。结果 与直接荷瘤组相比 ,低剂量照射组肿瘤生长缓慢 (P <0 0 5) ,2 4h后肿瘤细胞阻滞于G1 期 ,bcl 2蛋白表达下降 ,48h后肿瘤细胞凋亡增加 (P <0 0 0 1 )。结论 低剂量辐射可使机体肿瘤细胞阻滞于G1 期 ,并通过凋亡相关蛋白表达变化导致肿瘤细胞凋亡增加 ,明显提高机体抗肿瘤的作用 ,具有肿瘤治疗和辅助放化疗的实际临床意义
费从合[2]2002年在《低剂量辐射对肿瘤细胞凋亡、细胞周期以及凋亡相关蛋白bcl-2的影响》文中研究指明目的 实验研究和人体观察资料证明：低剂量辐射作用于哺乳动物和人体可诱导适应性反应，增强免疫功能，提高抗癌能力。低剂量辐射对离体肿瘤细胞影响较小。低剂量辐射的抑瘤作用不是直接对肿瘤，而是通过机体的整体调节实现的。研究低剂量辐射增强机体免疫功能情况下，对荷瘤小鼠肿瘤细胞在细胞、分子乃至基因水平的影响，对其临床应用具有指导作用。bcl-2原癌基因是与细胞凋亡关系密切的基因之一，它的表达产物bcl-2蛋白与细胞凋亡关系密切，对细胞提供生存信号。本实验目的在于探讨低剂量辐射对小鼠种植肿瘤细胞的凋亡、细胞周期以及凋亡相关蛋白bcl-2的影响，为低剂量辐射的临床应用提供理论依据。 方法 昆明种雄性小鼠左后肢腹股沟皮下接种S180肉瘤细胞，接种后第7天75mGyγ射线全身照射，照射后24、48小时分别处死直接测量肿瘤体积变化，取部分肿瘤组织流式细胞仪分析细胞凋亡、细胞周期，部分肿瘤组织免疫组化染色半定量分析凋亡相关蛋白bcl-2表达的变化，部分肿瘤组织由透射电镜观察细胞凋亡情况。 结果 与直接荷瘤组相比，低剂量照射组肿瘤生长缓慢，在照射后48小时与直接荷瘤组相比有差异(P＜0.05)；照射24小时后肿瘤细胞阻滞于G1期(P＜0.001)，S期明显减少(P＜0.01)，G2／M期细胞未见变化，而细胞凋亡与对照组无明显变化；照射48小时后肿瘤细胞G1期阻滞消失，S期明显增加(P＜0.01)，G2／M期细胞较对照组明显减少(P＜0.01)，细胞凋亡显着增加(P＜0.001)。透射电镜下观察到细胞凋亡各个过程以及巨噬细胞吞噬凋亡小体的图像。 结论 低剂量辐射减缓机体种植肿瘤的生长，使机体肿瘤细胞阻滞于G1期，并通过凋亡相关蛋白bcl-2表达的变化导致肿瘤细胞凋亡增加，明显提高机体抗肿瘤的作用。低剂量照射为放、化疗分别提供敏感的细胞周期G2／M 中文摘要 和S细胞，提高了放化疗的治疗效果；也相应地诱导了机体的适应性反应．在 一定程度上抑制了射线、化学药物对正常组织造成的损伤，有利于减少射线以 及药物的毒副作用，以上均支持低剂量辐射和放化疗的联合应用。不仅直接 证明低剂量辐射的抗肿瘤作用，而且为临床低剂量辐射配合放疗、化疗工作的 开展提供理论依据。
董令仪[3]2008年在《超分割放射治疗宫颈癌与其细胞凋亡相关基因表达关系的研究》文中指出宫颈癌是全球范围内严重威胁妇女身体健康的疾病,也是我国最常见的妇科恶性肿瘤。全球每年大约有47万新发病例,死亡病例近23万。新增病例中80%为鳞状细胞癌,中晚期患者(Ⅱb晚～Ⅳb期)比例较多。放射治疗是中晚期宫颈癌首选的有效治疗方法。但是经根治性放疗后仍有部分病例原发肿瘤残存,导致后期的局部复发和远处转移。随着宫颈癌的期别升高,5年存活率递减,常规放疗后Ⅲb期以上的宫颈癌5年存活率仅为15.0～43.3%。因此如何提高宫颈癌病灶控制率成为提高中晚期宫颈癌放射治疗疗效的核心问题。随着以顺铂为基础的同步化疗在治疗晚期宫颈癌的疗效得到肯定,本课题进行了超分割放疗加同期化疗治疗Ⅲb期宫颈癌患者的疗效观察,并对超分割放疗初对宫颈癌组织细胞凋亡相关基因(bcl-2和bax)以及增殖指标(PCNA)表达的影响进行初步探讨。超分割放疗加同期化疗治疗Ⅲb期宫颈癌的疗效观察目的:评价超分割放疗结合以顺铂为基础化疗方案的制定及治疗中晚期宫颈癌患者的可行性,以及该方案的临床意义。方法:45例Ⅲb期宫颈鳞状细胞癌患者随机分入超分割组和常规分割组接受同步放化疗。超分割组(24人)放疗每次1.2Gy,每天两次,间隔大于6小时,每周5天;当外照射达到36Gy时放射野中央挡铅,全盆外照射总剂量55.2Gy。常规分割组每次1.8Gy,每天1次,每周5天;外照射达到30.6Gy后放射野中央挡铅,全盆外照射总剂量45Gy。两组患者后装腔内照射剂量以及方法基本相同,A点剂量42Gy。两组均于放疗4～5周同时开始化疗行PVB(顺铂100mg+长春新碱1mgd1-3+博来霉素15mgd1-3)方案。结果:两组患者除皮肤反应超分割组重于常规分割组外(P＜0.05)余毒副反应无统计学差异(P＞0.05)。放射反应率超分割组和常规分割组分别为:100%和76.19%(P＜0.05),两组2年累计生存率为92.%和55%,无统计学差异。进行单因素和多因素分析表明肿瘤对外照射的反应是影响预后的惟一因素(P＜0.01)。结论:超分割放疗并不加重患者的放射副反应,两组患者毒副反应基本相似。超分割组2年累积生存率高于常规分割组,但没有统计学意义。肿瘤对外照射的反应是影响患者预后的一个因素。分割放疗对宫颈癌组织中细胞增殖凋亡相关蛋白表达的影响目的:探讨分割放疗对反映细胞增殖活性的增殖细胞核抗原(PCNA)以及参与调节细胞凋亡的相关基因bcl-2和bax蛋白表达的影响。材料及方法:99例宫颈鳞癌组织标本均来自于入组超分割放化疗临床研究的患者。取自放疗前、放疗两周以及放疗四周。其中超分割组23人,常规分割组10人。采用免疫组织化学技术检测宫颈癌组织中PCNA、bcl-2以及bax蛋白的表达情况,并分析两组在放疗前后及放疗中的动态变化和差异。结果:放疗两周后超分割组和常规分割组促凋亡蛋白bax蛋白的表达均较放疗前明显增强(P＜0.05),而抗凋亡蛋白bcl-2的表达变化没有统计学差异。PCNA的表达亦没有统计学差异。结论:分割放疗上调bax蛋白的表达,但是未检测出对bcl-2蛋白表达的影响。在放疗两周时,在两组中均未发现细胞的加速再增殖现象。放疗对宫颈癌治疗的作用整体是抑制细胞增殖和促进其凋亡的。分割放疗对宫颈癌组织中细胞增殖凋亡相关基因表达的影响目的:探讨分割放疗对反映细胞增殖活性的增殖细胞核抗原(PCNA)以及参与调节细胞凋亡的相关基因bcl-2和bax mRNA表达的影响。材料及方法:99例宫颈鳞癌组织标本均来自于入组超分割放化疗临床研究的患者。取自放疗前、放疗两周以及放疗四周。其中超分割组23人,常规分割组10人。采用RT-PCR检测宫颈癌组织中PCNA、bcl-2以及bax基因的表达情况,并分析两组在放疗前后及放疗中的动态变化和差异。结果:放疗两周后超分割组和常规分割组促凋亡蛋白bax基因的表达较放疗前明显增强(P＜0.05),常规分割组则无统计学差异。抗凋亡蛋白bcl-2基因的表达变化没有统计学差异。PCNA的表达亦没有统计学差异。结论:超分割放疗上调bax基因的表达,但是未检测出对bcl-2基因表达的影响。在放疗两周及放疗四周时,在两组中均未检测到肿瘤细胞的加速再增殖现象。
祝宝让[4]2007年在《反义STAT3设计及其对肺腺癌A549细胞辐射敏感性影响的研究》文中研究说明随着对肿瘤放射敏感性的研究和认识不断深入,从最初的组织水平和细胞水平到目前的分子生物学水平和基因水平,人们认识到肿瘤甚至部分良性疾病的辐射抗性除了与DNA损伤修复方面的机制密切相关外,与多种信号转导通路,与凋亡,与基因都有着千丝万缕的联系,并试图从不同水平改变和调节肿瘤细胞和正常细胞的放射敏感性。近年来,利用现代分子生物学技术阻断肿瘤细胞关键的信号通路,促进肿瘤细胞死亡和凋亡,进而提高放化疗效果,引起国内外学者的重视,成为肿瘤治疗研究的热点之一。肿瘤的发生、发展与生长分化相关的信号传导通路的异常激活密切相关。生长因子和细胞因子作为细胞增殖的重要胞外刺激因子,与相应受体结合后,通过许多条信号通路的信号转导作用将细胞外信号传递到细胞内引起细胞的增殖和分化。JAKs/STATs是相对比较重要的信号转导途径之一,而STAT3则是STATs家族的令人瞩目的重要成员,在肿瘤的形成和发展过程中起着重要的作用。STAT3是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道相耦联的具有关键作用的双功能蛋白。激活后形成二聚体转入细胞核内,识别并结合到靶基因DNA特异的反应元件,诱导细胞生长、分化、凋亡相关基因(Bcl-xL、Mcl-l、c-Myc、Cyclin D1、VEGF、p53)等基因表达。具有内在酪氨酸激酶活性的生长因子受体,如表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)等可直接磷酸化STAT3蛋白。Src激酶和Ab1及其它如v-ras、Lck等癌蛋白酪氨酸激酶也能直接磷酸化STAT3蛋白。STAT3二聚体完成特定的信号传递后,被一种未知的酪氨酸磷酸酶去磷酸化,并重新回到细胞质中。但是最近也有研究表明STAT3蛋白可以在胞浆与胞核间不停穿梭,且不依赖于STAT3的磷酸化,类似的现象在STAT1和STAT5中也可以见到,有待于进一步的研究证实。反义技术应用于新型抗肿瘤药物研究和开发为我国在肿瘤药物研究领域占有一席之地提供了良好的机遇。目前国际上抗肿瘤反义核酸药物研究已经取得了很大进展,已有一种反义药物应用于临床,多种反义药物正进行二期叁期临床实验反义药物正显示着良好的应用前景。但是国际上的反义核酸药物均申请了发明专利,具有绝对的技术和应用上的专有性和垄断权,一旦开发成功,我国只能高价引进。使我们处于极其不利和被动地位。因此开展具有自主知识产权的抗肿瘤药物相关研究具有战略意义。目前已有结合放射和反义核酸的研究,如:反义Ku70(DNA损伤修复相关基因)、RAF、peroxiredoxin II(过氧化物还原酶)、PKA1(蛋白激酶A1)、P21 WAFCIP1、Bcl-xL研究,其报道的结果无一例外地增强了相应细胞的放射敏感性。但是上述研究由于选择的靶位不同,其抗肿瘤的效果还不理想,离实际应用还有较大距离。因此,寻找更好的关键基因靶位,设计、筛选出更高效的反义核酸序列,是国际上抗肿瘤反义核酸技术研究的重点。本课题选择近年来国际上高度关注、极有可能成为反义核酸抗肿瘤关键作用的STAT3作为基因靶位,利用RNAstructure 4.2软件和网络资源,模拟STAT3 mRNA二级结构,进一步利用软件的步移法(oligowalk)模块设计出一系列反义序列,联合辐射因素,观察其对肿瘤辐射敏感性的影响,并以文献报道的已知序列作为阳性对照,筛选出高效的反义STAT3序列。在此基础上,探讨反义STAT3削弱肿瘤细胞辐射敏感性的相关机制,研究将分子生物学手段与传统放射治疗手段联合应用治疗辐射抗性肿瘤的可行性。研究内容第一,STAT3反义序列的设计:利用RNAstructure 4.2软件和网络资源,模拟STAT3 mRNA二级结构,进一步利用软件的步移法(oligowalk)模块,针对低自由能靶点,设计出一系列反义序列,并合成、修饰增强其稳定性。第二,高效STAT3反义序列的筛选:以文献报道的已知反义STAT3序列作为阳性对照,对上述反义序列进行筛选,筛选出更高生物学活性的STAT3反义序列。第叁,探讨高效反义STAT3转染后细胞辐射抗性的变化及其作用规律:将筛选出的高效STAT3反义序列转染肿瘤细胞后,体外观察细胞辐射敏感性的变化,寻求其作用规律。第四,研究反义STAT3削弱肿瘤细胞辐射敏感性的相关机制:通过观察细胞的增殖状态、凋亡状况、细胞周期的变化、STAT3表达和活力变化、下游相关基因的表达变化,初步阐明反义STAT3对细胞辐射敏感性的影响的相关机理。实验方法用RNAstructure 4.2软件和网络资源,模拟STAT3 mRNA二级结构,进一步利用软件的步移法(oligowalk)模块,针对低自由能靶点,设计出一系列反义序列,并合成、修饰增强其稳定性,以文献报道的已知反义STAT3序列作为阳性对照,脂质体包裹各反义序列,在96孔板以200nmol/L浓度为转染浓度,转染细胞48h后,用CCK-8实验方法观察各序列对肿瘤细胞的增殖抑制效果,筛选出更加高效的反义序列。进一步利用CASY细胞计数分析仪研究高效反义序列对肿瘤细胞的增殖抑制效果,利用Hoechst33258染色对各种因素作用后的细胞作形态学上的初步观察,判别凋亡细胞数量变化的趋势;用AnnexinⅤ/PI复染,流式细胞仪检测不同因素处理后细胞凋亡百分率的变化,用PI单染分析反义转染后细胞周期的变化,研究反义STAT3对恶性肿瘤辐射敏感性的改变情况,观察两者的协同效应。通过蛋白杂交研究转染STAT3蛋白表达与活化水平以及相关下游基因的变化,观察反义序列对蛋白表达和活化的阻断作用,对反义序列改变肿瘤细胞辐射敏感性的机制作初步的探讨。实验结果1、反义STAT3序列的设计与合成利用先进的反义序列设计软件,设计得到10条新的反义STAT3序列,分别命名为AS1~AS10,他们的总自由能介于-9.6~-25.8之间,皆明显低于文献报道的已知序列ASC。2、新反义STAT3序列对A549细胞的作用2.1对肿瘤细胞增殖抑制效果:以文献报道的已知序列ASC作为阳性对照,CCK-8检测AS1~AS10各序列对A549细胞的增殖抑制效果。发现AS5~AS7叁个组对A549细胞的增殖抑制效果与ASC组的作用相当,无显着差异(P>0.05),其余7组对A549细胞的增殖抑制效果明显优于ASC组(P<0.01),其中AS10组效果最好,增殖抑制率达75.64%,比ASC组的增殖抑制率提高了近4倍。而AS4与AS8的增殖抑制率也分别达到65.88%、65.97%。2.2对肿瘤细胞凋亡促进作用:DNA染色剂Hoechst33258染色结果表明反义STAT3转染后48小时,部分细胞开始出现较明显的细胞凋亡的形态学表现。可见光下凋亡细胞表现为胞膜皱缩,体积变小,部分从其附着处脱落下来或与周围细胞分离。荧光显微镜下正常细胞核较大,染色质分布均匀;凋亡细胞核固缩变小,细胞核呈致密浓染,部分染色质边缘化,或呈碎块状致密染色;而无义对照组与无干涉对照组相比差别并不明显,并且未见典型的凋亡形态的细胞出现。Annexin V/PI双染结果显示反义核酸与A549细胞作用48h后早期凋亡细胞增多。正常对照组的早期细胞凋亡率为5.18%,NS组的早期细胞凋亡率接近正常对照组,为4.35%,两者相比差异无统计学意义(P>0.05);而AS10组的A549细胞作用48h后早期凋亡细胞增多,为11.51%,与对照组、NS组相比均有十分显着的统计学差异(P<0.01),表明AS10反义核酸能够促进A549细胞的早期凋亡。3、不同浓度AS10对A549细胞的增殖抑制效果选择不同浓度最优序列AS10,与已知序列ASC和无义序列NS作A549细胞的增殖抑制效果比较,通过CCK-8检测计算各组的存活分数,统计结果分析表明:(1)AS10对A549细胞的增殖抑制效果显着由于AS10。在50~300nmol/L范围内,相同浓度的AS10序列的抑制率非常显着高于相同浓度的ASC序列(P<0.01)。(2)AS10对A549细胞的增殖抑制效果随浓度增高而增强。在0到150nmol/L范围内,反义核酸浓度越高,其增殖抑制效应越强(P<0.01)。4、反义STAT3转染联合辐射作用对A549细胞辐射敏感性的影响4.1对肿瘤细胞增殖抑制效果:在较低剂量区(0~8Gy)与不转染或无义转染对照相比,反义STAT3增殖抑制作用明显增强(P<0.01),较高剂量区( >8Gy)两者差别减小。按公式:细胞活力(%)=(药物组OD值-本底/对照组OD值-本底)×100%,对数据进行转换,计算细胞活力,表明除了简单的迭加作用因素外,反义转染对肿瘤细胞的有比较明显的增敏作用,低剂量区增敏作用比较明显,高剂量区不明显。4.2对肿瘤细胞凋亡促进作用:反义STAT3联合辐射作用后,在正常无处理组和NS组,可见大小均匀、分布较密的正常细胞核形态,两组之间未见明显差异;在AS10组可见细胞核分布较稀,都部分典型的凋亡小体;在单纯16Gy照射组和NS+16Gy照射组,未见典型的凋亡细胞,但细胞核分布较未照射组稀,两组之间未见明显差异,可见A549细胞为辐射抗性细胞,单纯16Gy照射不能诱导细胞的凋亡;在AS10+16Gy照射组,可见细胞核分布稀疏,有较多的典型凋亡细胞出现,可见反义核酸能够增强A549细胞的辐射敏感性。细胞转染24 h后加以不同剂量γ线照射,照后48h内Annexin V/PI染色,上流式检测,统计处理各组细胞的早期凋亡率,在相同照射剂量条件下,AS10转染+照射组细胞早期凋亡率较单纯照射组和NS转染+照射组均有不同程度的增加,有明显的统计学差别(P<0.01),并且随着照射剂量的增加,早期凋亡率也有显着上升(P<0.01)。而NS转染+照射组与单纯照射组各相应剂量点处相比未见明显差异(P>0.05)。5、反义STAT3对A549细胞抑制作用的机理探讨5.1反义STAT3转染后STAT3总蛋白表达及其磷酸化水平的变化:反义STAT3转染后48h,抽提细胞总蛋白,进行Western blot杂交检测各处理组STAT3总蛋白表达及其磷酸化水平的变化。结果表明,反义组STAT3蛋白表达水平及磷酸化水平均明显低于无义组和正常对照组。5.2反义STAT3对A549细胞下游基因蛋白表达的变化:结果表明,反义STAT3转染后,A549细胞内STAT3下游基因CyclinD1、Bcl-xL蛋白表达水平均明显低于无义组和正常对照组。5.3反义STAT3对A549细胞周期的影响:通过PI染色、流式细胞仪分析细胞周期各时相的百分比,我们发现,AS10转染后S期的细胞为23.70%,而正常对照组S期的细胞为44.47%,NS组S期的细胞为39.08%;并且发现AS10转染后G1期的细胞明显增多,为63.96%,而正常对照组和NS组G1期的细胞则分别为48.49%、47.37%。表明反义核酸能够减少S期的A549细胞,使A549细胞发生G1期阻滞。讨论STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道的汇聚的焦点,调节下游多个靶基因如Bcl-xL、Bcl-2、Mcl-1、c-Myc、VEGF、P21WAFCIP1、CyclinD1等的表达,在多种肿瘤细胞和组织中都有激活,是近年来备受国内外备受关注的一个重要基因靶点。反义技术研究最重要的是要找准关键基因靶点和获得高效反义寡核苷酸序列。目前认为,反义寡核苷酸的活性主要取决于选择靶基因上理想的可接近位点,因此对RNA二级结构的认识程度是反义药物设计的关键。随着计算机技术的飞速进步,热力学和比较序列分析研究所取得的进展,用计算机软件预测RNA二级结构的准确性已大大提高,这为选择理想反义靶点提供有力的支持,RNAstructure4.2是Mathews DH教授等2004年最新推出的版本,它对RNA二级结构预测的准确率较老版本有了进一步的提高,其中步移法(oligowalk)模块是专为反义药物设计所用的子目录。本研究就是利用该软件设计出10条总自由能(Overall△G37)相对较低的序列,用CCK-8实验方法检测其对A549细胞的增殖抑制效果,与文献报道的已知序列进行对比。我们的实验结果表明其中7条序列明显优于已知阳性对照(P<0.01),获得了具有自主知识产权的高效反义STAT3序列。说明利用RNAstructure4.2软件模拟mRNA的二级结构,以及利用步移法(oligowalk)模块设计出总自由能较低的序列,有助于获得更有效的反义药物。在实验中我们发现,用新设计和筛选出的AS10序列转染后,对A549细胞产生了强烈的增殖抑制效应,在一定浓度范围内,其效应呈浓度依赖性,并且能有效的诱导A549细胞的凋亡。AS10对肿瘤细胞的增殖抑制效应,很可能与其抑制STAT3蛋白的表达和活化,阻断STAT3信号通路后下游CyclinD1等表达降低有关,CyclinD1是细胞周期G1/S期检查点最重要的正向调控因子,CyclinD1蛋白的作用是使Rb蛋白磷酸化而导致它与转录因子E2F的解离,而发挥E2F转录因子的作用,使细胞进入S期,决定着细胞是否能进入分裂周期。分析显示,AS10转染后,A549细胞S期的比例明显减少,使A549细胞发生了G1期阻滞。可能是反义STAT3下调了细胞周期、细胞增殖相关的基因如Cyclin D1、c-Myc、等的表达,使细胞不能通过G1期的检查点,发生周期阻滞,进而对细胞产生了增殖抑制效应。AS10诱导A549细胞产生凋亡的机理,与AS10序列转染后A549细胞STAT3蛋白的表达量下降,磷酸化水平降低,其下游蛋白Bcl- xL等表达降低有关。Bcl- xL蛋白是一种抗凋亡基因,属于Bcl-2家族中的一员,它可以和自身及家族的其他成员形成同二聚体或异二聚体,阻止细胞色素c从线粒体中的释放,从而抑制凋亡级联反应的激活,参与抑制细胞的程序性死亡。文献报道它在多种肿瘤细胞内高表达,能阻止化疗和放疗诱导的凋亡,使肿瘤细胞具有化疗和放疗的抗性。本实验中AS10序列能够有效的抑制A549细胞中STAT3蛋白的表达和活化,阻断STAT3信号通路,下调Bcl- xL的表达,也可能对其他下游抗凋亡基因如Bcl-2、Mcl-l等的表达也有一种作用,进而诱导了细胞的凋亡。但是我们发现仅仅依靠反义STAT3本身不能彻底杀伤肿瘤细胞,而且浓度过大也会对细胞产生非特异性的毒性效应,表明反义STAT3本身对肿瘤细胞的杀伤作用有一定局限性,不能通过无限制的提高反义核酸的浓度来提高其杀伤肿瘤的作用,需要进行反义技术与其他放化疗相结合的探索性研究。本研究中我们探讨高效反义STAT3与60Coγ射线照射的联合作用,发现AS10组肿瘤细胞的辐射敏感性在相同剂量点处,较NS组和单纯照射组都显着提高(P<0.01),在低剂量区更加明显。而NS组与单纯照射组肿瘤细胞的辐射敏感性无显着差异。表明反义STAT3够提高辐射对肿瘤细胞的杀伤能力,提高了肿瘤的辐射敏感性,特别在低剂量区提高的更为显着,具有明显的临床研究意义。通过凋亡形态学观察及早期凋亡的检测,我们发现A549细胞具有很强的辐射抗性,单纯照射16 Gy时,仅对其有一定程度的增殖抑制效应,未见有典型的凋亡形态的细胞出现,单纯照射12Gy时,早期凋亡率也仅有9.33%,而AS10转染联合辐射后,Hoechst33258染色荧光显微镜下可见细胞核分布较为稀疏,有较多典型凋亡形态的细胞,流式检测早期凋亡发现,AS10联合辐射组的凋亡率较单纯照射组和NS联合辐射组有显着提高,在12Gy联合AS10转染时,早期凋亡率达到57.93%。因此,高效反义STAT3寡核苷酸能够抑制A549的增殖和促进其凋亡,增加肿瘤细胞的辐射敏感性,有利于在较低的辐射剂量下杀死更多的肿瘤细胞。其机制一方面是反义STAT3寡核苷酸阻断细胞中STAT3信号通路后,其下游的多种基因表达受到调控,发生了相应的变化,下调了其下游的抗凋亡基因Bcl-xL等,促进了凋亡的发生,加上电离辐射对细胞凋亡的诱导作用,两者联合应用产生了协同迭加的效应,增加了辐射抗性肿瘤的辐射敏感性。另一方面是反义STAT3下调了细胞周期控制基因,如CyclinD1等,加之辐射导致的DNA损伤,使细胞不能通过G1期的检查点,发生周期阻滞,进而对肿瘤细胞进一步产生了增殖抑制效应。由于已有报道说阻断STAT3对正常的细胞生长的几乎没有影响,因此,靶向STAT3蛋白在辐射增敏领域的研究可能具有比较乐观的临床前景,进一步相关机理及体内的实验研究正在开展之中。
康顺爱[5]2009年在《姜黄素抗紫外线辐射损伤保护作用及其机制》文中指出紫外线(ultraviolet, UV)主要作用于皮肤,其中中波紫外线(ultraviolet B, UVB)主要通过生成活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基损伤表皮的角质形成细胞,导致细胞氧化应激反应,诱导细胞凋亡是UVB辐射氧化损伤细胞的最终结局。天然植物姜黄素(curcumin, Cur)的化学结构是由两个邻甲基化的酚和1个β-二酮组成,是多羟基酚类化合物,能够增加机体的抗氧化酶含量,如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等,这些抗氧化酶可通过增强机体的抗氧化能力清除ROS自由基,从而降低紫外线辐射引起的氧化损伤作用;Cur还具有防止膜脂质过氧化作用,维护线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψ)的稳定性,阻止其释放细胞色素c(cytochrome c, Cyt c),通过调节凋亡相关蛋白如Bcl-2、Bax和caspase-3的表达,进而达到对机体的保护作用。本研究通过UVB辐照诱导人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)氧化损伤模型的建立,探讨Cur抗紫外线辐射损伤保护作用及其机制。实验结果表明,UVB辐照损伤HaCaT细胞的存活具有时间和剂量依赖性,即随着辐照剂量的加大和培养时间的延长,HaCaT细胞的存活率显着降低;细胞的凋亡率随着辐照剂量的加大而显着提高;UVB辐照后可显着增加细胞中的ROS、一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量,提高乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量和胞浆游离钙离子浓度(concentration of free intracecellular calcium, [Ca2+]i),同时降低SOD和GSH-Px含量和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψ)。揭示了UVB辐照通过提高细胞氧化应激反应和脂质过氧化水平而破坏线粒体膜结构,从而增加了线粒体膜的通透性。同时,UVB辐照增加了促凋亡蛋白Bax、Cyt c和caspase-3的表达量,降低了抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量,揭示了线粒体内凋亡相关蛋白的表达及其mRNA水平变化与凋亡发生之间的规律,通过启动线粒体凋亡途径和caspase-3凋亡途径,使细胞凋亡增加。UVB辐照HaCaT细胞后立即加入Cur,细胞的ROS、NO、NOS及MDA含量和LDH漏出量显着降低,并可显着提高HaCaT细胞的存活率和SOD及GSH-Px含量,表明Cur可抑制ROS自由基的生成和提高抗氧化酶活性,从而减轻细胞的氧化损伤;Cur可通过消除细胞周期阻滞,保持细胞周期进程的正常进行,促进细胞的生长;Cur能够提高Δψ和降低[Ca2+]i,维持HaCaT细胞线粒体膜电位的稳定及通透性,减少Cyt c蛋白漏出,降低促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达,增强抗凋亡蛋白Bcl-2表达,从而降低HaCaT细胞凋亡百分率。因此,Cur通过以上各因素的相互调节,达到对HaCaT细胞的保护作用。本研究为Cur的基础研究和临床应用及药物的开发利用提供了理论和实验依据,同时也进一步为辐射损伤的防护提供了重要的实验依据。
张红梅[6]2017年在《低剂量辐射通过mTOR信号通路增强多柔比星抑瘤效应并对抗其心脏毒性的研究》文中进行了进一步梳理研究背景及目的:多柔比星(doxorubicin,DOX)作为临床常用的蒽环类抗肿瘤药物,在治疗肿瘤的同时,对正常组织也有损伤,尤以其心脏毒性更为显着。如何在不减弱DOX抗肿瘤作用的同时,降低DOX引起的心脏毒性,是临床面临的棘手问题。有研究证明低剂量辐射(low dose radiation,LDR)可诱导机体正常组织的兴奋效应和适应性反应,同时对肿瘤组织亦有一定的抑瘤效应。也有学者证实m TOR(mammalian target of rapamycin,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)信号通路不仅参与肿瘤细胞的增殖和凋亡,而且在心肌细胞的生长、代谢过程中发挥重要作用。另有研究发现LDR可通过调节m TOR上游信号通路促进机体正常组织的生长发育,而LDR是否通过调节m TOR信号通路对肿瘤组织及心肌组织产生影响目前国内外尚未见报道。本课题组前期研究发现,LDR可通过对抗DOX诱导的氧化应激与线粒体损伤降低DOX的心脏毒性,另外发现LDR与DOX对肿瘤组织的生长具有一定的协同抑瘤效应。本研究选用女性发病率最高的肿瘤——乳腺癌作为研究对象,构建乳腺癌BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,通过观察荷瘤鼠体重及瘤重变化,研究移植瘤组织细胞增殖、血管生成及细胞凋亡情况,检测分析移植瘤组织及心肌组织m TOR信号通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平,探讨LDR对DOX抑瘤效应及心肌损伤的影响及其可能的机制。实验材料及试验方法:选取24只8周龄的BALB/c健康雌性小鼠,每只小鼠右腋下注射无血清的4T1乳腺癌细胞悬液0.1 ml(2×107/毫升),构建乳腺癌BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,当移植瘤长径为3-5毫米时进行实验。荷瘤鼠随机分为4个实验组:Control组、LDR组(75m Gy)、DOX组(DOX腹腔注射)、LDR+DOX组(LDR72小时后腹腔注射DOX)。称量荷瘤鼠体重及瘤重,观察LDR与DOX对荷瘤鼠的体重及瘤重的影响;免疫组化法检测各实验组Ki-67与CD34的表达水平,研究肿瘤组织的细胞增殖及血管生成情况;HE染色、TUNEL法检测各实验组肿瘤组织细胞凋亡情况;Western Blot法分析各实验组肿瘤组织及心肌组织凋亡相关蛋白及m TOR信号通路蛋白的表达水平。实验结果:荷瘤鼠体重结果:DOX组与LDR+DOX组体重均下降,DOX组下降显着。瘤重结果:DOX组与LDR+DOX组均下降,LDR+DOX组下降显着。HE染色结果:DOX组肿瘤组织巢状坏死;LDR+DOX组肿瘤组织片状坏死。TUNEL检测结果:DOX组与LDR+DOX组肿瘤组织绿色荧光面积均增多,以LDR+DOX组绿色荧光面积增多明显。免疫组化结果:DOX组与LDR+DOX组肿瘤组织Ki67、CD34阳性染色比例均减少,以LDR+DOX组减少明显。Western Blot结果:肿瘤组织:DOX组与LDR+DOX组Bcl-2表达均下调,以LDR+DOX组下调显着;DOX组与LDR+DOX组Bax和Caspase3表达均上调,其中Caspase3以LDR+DOX组上调显着;与DOX组比,LDR+DOX组m TOR、EIF4E和4EBP1表达均下调。心肌组织:DOX组Bcl-2表达下调,LDR+DOX组表达上调;DOX组Bax和Caspase3表达上调,LDR+DOX组表达下调;DOX组m TOR、EIF4E和4EBP1表达下调,LDR+DOX组m TOR和EIF4E表达上调,4EBP1表达下调。结论:LDR可增强DOX的抑瘤效应,减轻DOX所致的心脏毒性。其机制可能为:LDR可通过调节移植瘤组织m TOR信号通路,阻碍移植瘤组织细胞增殖与血管生成,促进肿瘤细胞凋亡,增强DOX抑瘤效应;LDR可通过调节心肌组织m TOR信号通路,影响凋亡相关基因蛋白的表达水平,减少心肌细胞凋亡,对抗DOX所致心脏毒性。LDR有望成为临床治疗肿瘤的辅助手段。
黄丹民[7]2016年在《鳄嘴花特征活性组分对HepA移植瘤小鼠的抗肿瘤机制与安全性评价的研究》文中认为恶性肿瘤是世界上发病率较高的一种疾病,极大地危害人类的健康。现有的抗肿瘤药物存在着药效差、特异性差和毒副作用大等问题。因此,多途径筛选低毒、高效、特异的药食两用抗肿瘤植物资源仍是当前研究的热点。鳄嘴花(Clinacanthus nutans Burm.f.Lindau)为爵床科鳄嘴花属植物,又名忧遁草、沙巴蛇草,青箭,广泛分布在中南半岛、马来半岛以及中国大陆的广西、广东、云南、海南等地区,药食两用,是民间的一种野菜,主要用于预防和治疗恶性肿瘤等。本文以马来西亚产野生鳄嘴花为主要研究对象,通过分离提纯、结构鉴定、体内外抗肿瘤活性评价和免疫激活调节机制等,较深入系统地研究了其中主要抗肿瘤成分、抑瘤功效机理和食用安全性等问题,为开发天然安全有效的鳄嘴花抗肿瘤食品或食品保健品奠定基础。本论文主要研究内容及结论如下:(1)首先以鳄嘴花为原料,采用溶剂法、硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析及重结晶等方法进行成分分离及纯化技术,并利用HPLC-MS、光谱法(1HNMR、13CNMR、HBQC、COSY)、GC-MS、IR和HPLC等分析技术,从正丁醇部位中经柱层析与30%乙醇洗脱纯化后的部分中鉴定出有抗癌活性功能的6个黄酮碳苷类化合物(荭草苷、异牡荆苷、异荭草苷、牡荆苷、夏佛塔苷和芹菜素)。(2)随后采用高通量基因芯片表达谱学技术,观察CN30治疗Hep A移植瘤鼠肿瘤后在基因水平上差异基因的表达状况。以对CN30药理功能与抗癌机制进行大面积初筛。结果表明:共有773个基因被差异表达,聚类分析也发现与肿瘤及免疫调节有关的差异基因有近500个。其中345个差异基因表达下调(P<0.05);430个差异基因表达上调(P<0.05)。分析结果发现:与肿瘤,免疫失调等疾病有关的基因(靶基因)差异表达的有504个;受影响的信号转导通路主要有有丝分裂、Pi3k-Akt、WnT、p53、P450、核因子κB(NFκB)、Janus激酶、转录活化因子(JAK/STAT)和维甲酸等。(3)紧接应用了MTT、免疫印迹分析、免疫荧光组织化学、胞内染色流式分析、酶联免疫吸附法、生化指标测定等技术进行试验验证。确定了鳄嘴花提取物CN30的体内抗肿瘤机制,研究数据表明:鳄嘴花CN30中主要的抗肿瘤小分子活性物质-黄酮碳苷,具有较强的体内抑制移植瘤鼠HepA的增殖作用,可激活CD8+T细胞,CTL细胞,Th1,Th2和Th17细胞亚群,上调MHC classⅡ,Foxp3,Casp 3,Bax,Bad,CD4+,IL-2和IFN-γ蛋白因子的表达;下调Bcl 2,Bcl-xl,PI3K和AKT蛋白因子的表达。Western blot还证实了鳄嘴花黄酮碳苷能上调Casp 3/Bad和下调了Bcl 2/IL4的表达。因此可以认为通过NF-κB信号、细胞迁移、诱导肿瘤细胞凋亡与抗肿瘤细胞增殖是CN30在体内主要的免疫抗肿瘤机制。(4)最后系统评价了鳄嘴花醇提取物的食用安全性。通过喂食试验鼠不同剂量的鳄嘴花醇提浸膏,观察其急性毒性、亚慢性毒性和遗传毒性。结果显示,急性毒性试验中各剂量组小鼠虽无死亡,但血清生化指标表现为TBIL、ALT的升高。亚慢性毒理试验各剂量组与对照组的血清总蛋白、白蛋白、球蛋白比值和血清转氨酶(ALT和AST)增加显着,大鼠肝脏重量也显现增加。而鳄嘴花醇提物未表现有遗传毒性。综上可知,鳄嘴花的传统药/食剂量基本安全,但仍应尽量避免长期大量食用鳄嘴花,以免导致肝肾毒性及血清生化指标的异常。
陆文总[8]2009年在《异叶败酱草多糖抗宫颈癌作用及机理研究》文中研究表明宫颈癌是严重威胁女性健康的的恶性疾病,位居女性恶性肿瘤第二。目前使用化学合成药物治疗肿瘤的同时对机体产生毒害作用。因此,寻找安全有效的天然药物成为生物医药领域的一个研究热点。天然抗癌植物性多糖以其毒副作用小、生物活性强和不产生耐药性等优点引起了人们的高度重视。异叶败酱草作为我国传统的中草药,具有清热燥湿、止血、止带的功效,对治疗子宫糜烂、早期宫颈癌等效果显着。本研究旨在评估异叶败酱草多糖级分1 (PHB-P1)抗宫颈癌的作用效果,探讨其作用机制,为开发抗宫颈癌新药提供科学理论依据。试验一,异叶败酱草多糖的分离纯化和活性鉴定。本研究通过水提醇沉法提取了异叶败酱草粗多糖,并经过离子交换柱分离纯化得到分子量均一的异叶败酱草多糖级分1 (PHB-P1),该多糖级分含有酮糖、葡萄糖糖醛酸等,提取率为1.57%。采用MTT法初步检测PHB-P1对人宫颈癌HeLa细胞和正常人外周血单核淋巴细胞的毒性作用,研究发现PHB-P1对HeLa细胞具有显着的毒性作用,其IC_(50)为52.26μg/mL,而对正常的人外周血单核淋巴细胞没有明显的毒性作用。试验二,异叶败酱草多糖(PHB-P1)抗HeLa细胞增殖机制的研究。本研究作为体外试验以HeLa细胞为研究对象,PHB-P1(50μg/mL)处理HeLa细胞24 h和48 h,通过各种荧光染色法、原位末端标记技术(TUNEL)、DNA片段化分析、细胞周期分析、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等技术,检测HeLa细胞的形态和生化特征的变化,以及细胞中caspase-3、明胶酶、端粒酶活性和相关基因表达的变化。研究结果表明PHB-P1(50μg/mL)能诱导HeLa细胞凋亡;能干扰HeLa细胞的细胞周期分布,使细胞在G0/G1期显着增加,伴随G2/M期细胞明显减少;能显着增强了HeLa细胞caspase-3的活性、显着抑制HeLa细胞分泌明胶酶、抑制HeLa细胞端粒酶的活性。而且,PHB-P1(50μg/mL)能够显着上调HeLa细胞中p53、Bax、p14ARF的mRNA表达量,显着下调Bcl-2的mRNA表达量。试验叁,异叶败酱草多糖(PHB-P1)对荷瘤小鼠抗氧化力及免疫调节作用的影响。本研究以U14荷瘤小鼠为研究对象,生理盐水处理为阴性对照、环磷酰胺(CTX)为阳性对照药物,连续处理15 d,采用比色法等方法,从PHB-P1影响小鼠机体抗氧化能力和免疫调节方面分析了PHB-P1抗肿瘤的可能机制。研究发现PHB-P1高、低剂量(80、40 mg/kg b.w.)和CTX均能明显减缓肿瘤体积增大而抑制肿瘤生长,能有效地延长U14荷瘤小鼠的生命延长率,生命延长率分别为73.28%、40.46%和54.20%,对肝肾脏没有明显的毒害作用。PHB-P1高、低剂量能显着提高荷瘤小鼠血清中T-AOC活性(P<0.01, P<0.01)和显着降低MDA活性(P<0.05, P<0.05),还能明显增强SOD活性(P<0.01, P<0.05)。而且,PHB-P1高剂量对肝组织SOD活性有显着的增强效果;PHB-P1高、低剂量均能明显提高荷瘤小鼠肝组织中T-AOC的水平,MDA水平显着减少。同时,PHB-P1高、低剂量处理均能提高荷瘤小鼠肾组织中T-AOC的水平,分别提高了79.65%和59.75%,但对肾组织中的MDA影响效果不明显,只有PHB-P1高剂量提高肾组织中SOD的水平(P<0.05)。PHB-P1高、低剂量(80、40 mg/kg b.w.)灌胃给药后,使荷瘤小鼠的胸腺指数从阴性组的0.79提高到1.37和1.22,脾脏指数而阴性组的11.71提高到13.58和11.88。CTX处理显着抑制小鼠胸腺指数。PHB-P1高、低剂量处理均可以显着提高荷瘤小鼠IFN-γ活性(P<0.01, P<0.05),分别提高了41.22%和30.22%;高剂量PHB-P1能显着抑制TNF-α的活性(P<0.05),低剂量PHB-P1的效果不明显;PHB-P1处理也能部分提高IL-2活性,但是效果不明显。试验四,异叶败酱草多糖(PHB-P1)抑制肿瘤生长作用机制的研究。本研究以U14荷瘤小鼠为研究对象,生理盐水处理为阴性对照、CTX为阳性对照药物,连续处理15 d,采用比色法、免疫组织化学技术、流式细胞术等方法,从PHB-P1影响小鼠肿瘤细胞周期和细胞凋亡方面综合分析了PHB-P1抗肿瘤的可能机制。研究结果表明异叶败酱草多糖PHB-P1高、低剂量(80、40mg/kg b.w.)和CTX处理可以有效地抑制U14实体瘤小鼠肿瘤的生长,肿瘤重量抑制率分别达42.68%、31.30%和54.06%,能诱导U14荷瘤小鼠肿瘤细胞发生凋亡,肿瘤细胞凋亡的百分率分别为20.96%、27.85%和31.03%。PHB-P1高、低剂量处理后小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)水平分别下降了23.94%和18.92% (P<0.01、P<0.01),而PHB-P1高、低剂量处理均未能明显影响碱性磷酸酶(AKP)的水平。研究发现PHB-P1能干扰U14实体瘤小鼠肿瘤的细胞周期分布,使细胞在G0/G1期显着增加,伴随S期细胞明显减少;低剂量PHB-P1可以提高p19~(ARF)蛋白的表达量,但是效果不明显,而高剂量PHB-P1能显着增强p19~(ARF)蛋白的表达水平。而且PHB-P1能显着上调Bax蛋白的表达量,显着下调突变型p53和Bcl-2蛋白的表达量。本研究通过分离纯化得到异叶败酱草多糖PHB-P1,并通过体外培养的HeLa细胞和U14荷瘤小鼠模型试验,研究分析了PHB-P1抗宫颈癌的作用机制和调控途径,为PHB-P1作为天然抗癌药物的进一步研究和临床应用提供理论基础。
赵霏[9]2016年在《灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡与自噬的研究》文中研究说明背景:肝细胞性肝癌是发病率和死亡率高且预后极差的恶性肿瘤之一。目前临床的治疗方法包括外科手术切除、TACE术、放化疗、免疫治疗、基因治疗等,但大多难以控制疾病的进展。化学药物治疗是目前使用最多的方法,但所应用的化疗药物对病人的毒副作用较大且疗效不高。因此研发既有抗癌活性同时毒副作用低的新型抗肿瘤药物一直是研究的重点。近些年从天然产物中提取有效抗肿瘤活性成分已成为一种新的研究趋势。灰树花多糖(Grifola frondosa polysaccharide,GFP)是从药食同源菌种灰树花子实体及菌丝体中提取出的一种具有广泛药理作用的活性物质。已有研究报道过GFP对肿瘤细胞的增殖具有较显着的抑制作用,且抗肿瘤效应的分子机制为诱导细胞凋亡。同时维生素C(Vitamin C,VC)也曾被报道过在体外实验中具有诱导骨肉瘤细胞凋亡和诱导骨髓基质细胞自噬的作用。目的:本研究拟通过对灰树花多糖抗肿瘤的文献进行计量学分析,同时对多糖抑瘤效应中凋亡的作用进行Meta分析的研究方法,来了解灰树花多糖抗肿瘤方面研究的现状并探讨多糖抗肿瘤主要的分子机制,并在此基础上进行下一步的实验研究。探讨联合应用灰树花多糖和维生素C对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响,验证二者在抗肿瘤效应上是否具有协同增效作用,此外阐明凋亡与自噬在联合用药治疗肝癌细胞过程中发挥的作用,并进一步探讨联合用药诱导肝癌细胞凋亡和自噬发生的具体分子机制,为有效指导临床实践用药,开拓临床治疗肝癌新思路提供实验基础。方法:本研究首先对灰树花提取物生物活性的相关研究文献进行计量学分析,并应用可视化技术对灰树花多糖抗肿瘤研究的现状进行全面的了解。其次通过系统评价与Meta分析的方法对灰树花多糖抑瘤作用的分子机制进行分析,探讨灰树花多糖抗肿瘤效应中诱导细胞凋亡的作用。随后进行实验研究,对于从灰树花子实体中提取出来的多糖以及常规药物维生素C,采用MTT法分别检测单用药和联合用药后对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响;应用等效线图解法研究联合用药时二者之间的相互关系并寻求最佳联合用药浓度;流式细胞术检测联合用药对细胞周期的影响;annexinv-fitc/pi双染色法检测对细胞凋亡的诱导作用;用倒置生物显微镜观察药物干预后smmc-7721细胞形态学的改变,并进一步用透射电镜观察细胞的超微结构变化;同时用hoechst33258凋亡荧光染色剂和mdc自噬荧光染色剂对细胞进行处理后,通过荧光显微镜观察细胞凋亡和自噬的发生情况;应用westernblotting(wb)法检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2、parp及自噬相关蛋白beclin-1、lc3、akt和phospho-akt蛋白的表达情况;通过比较全细胞蛋白和胞质蛋白中细胞色素c的表达量来判断此过程中是否有细胞色素c的释放;另外分别检测药物处理后细胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9活性变化情况。从分子生物学水平检测细胞凋亡与自噬水平的改变,并探讨此过程中细胞遵循何种信号转导通路发生凋亡和自噬。结果:文献分析结果显示,在对灰树花提取物生物活性的诸多研究中,灰树花多糖的抗肿瘤效应一直是研究的重点与热点,而系统评价和meta分析结果表明诱导肿瘤细胞发生凋亡是其发挥抑瘤效应的主要机制。实验结果显示,灰树花多糖和维生素c均可抑制肝癌smmc-7721细胞增殖,且呈时间-剂量依赖性。等效线图解法分析结果表明小剂量的gfp(<0.6mg/ml)与vc联合应用时,二者具有协同增效抗肿瘤作用,根据mtt结果最终选定联合用药浓度为0.2mg/mlgfp联合0.3mmvc,此时联合用药对smmc-7721细胞抑制率为68.81%±1.12,高于单用gfp(16.03%±1.80)和vc(29.85%±1.02)。流式细胞术检测结果显示联合用药后细胞发生g2/m期阻滞,且细胞凋亡率从对照组的3.22%±0.23上升至联合用药组的64.45%±1.41,而联合用药组的细胞凋亡率分别是gfp组的6.88倍和vc组的2.24倍。药物处理肝癌细胞24小时后,光学显微镜与透射电镜下均可观察到细胞形态发生改变,出现染色质边集、胞质疏松等早期凋亡现象,同时在胞质中可观察到有双层膜结构的自噬泡出现。hoechst33258染色后,gfp、vc及联合用药处理的细胞中均可观察到典型的细胞核偏向一侧的凋亡细胞核变化情况。mdc染色后vc与联合用药干预后可在细胞胞质中见到荧光加强的自噬颗粒,且凋亡与自噬现象均是联合用药组更加明显。wb结果显示联合药物干预后,与对照组相比,促凋亡蛋白bax表达上调、抗凋亡蛋白bcl-2表达下降、caspase-3底物parp表达增强。同时对照组、gfp、vc与联合用药组四个组全细胞蛋白中的细胞色素c表达无差别,而除对照组外其余叁个组细胞的胞质蛋白中细胞色素c表达增强,说明药物干预后细胞色素c释放到胞质中。此外,联合用药后细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性均增强。提示联合用药后肝癌细胞smmc-7721凋亡水平上升,且主要遵循内源性线粒体途径发生凋亡。wb结果同时显示,联合用药后细胞自噬相关蛋白beclin-1表达增强、自噬分子标志物LC3-II表达上调,LC3-II/LC3-I比例上升,说明细胞自噬活性增强,但在接下来的WB实验中,细胞总Akt和phospho-Akt蛋白表达均增强,说明经典负性调控的自噬信号转导途径PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号转导通路可能不参与此过程。结论:文献计量学分析结果表明,灰树花多糖的抗肿瘤作用一直是其生物活性研究的重点。Meta分析结果也显示,多糖抑瘤效应主要的分子机制为诱导肿瘤细胞凋亡。进一步的实验结果提示,小剂量的GFP联合VC对肝癌细胞SMMC-7721具有显着的抗肿瘤活性,且二者具有协同增效作用。药物干预后细胞的凋亡和自噬均被激活,药物一方面通过内源性线粒体途径诱导细胞凋亡,另一方面诱导细胞发生自噬,从而发挥抑制肿瘤的效应。
于洪升, 宋爱琴, 费从合, 王卓敏, 邱文生[10]2005年在《低剂量辐射对肿瘤细胞凋亡、细胞周期以及凋亡相关蛋白Bcl-2的影响(英文)》文中进行了进一步梳理目的探讨低剂量辐射对小鼠移植肿瘤细胞的凋亡、细胞周期以及Bcl-2的影响。方法昆明种雄性小鼠左后肢腹股沟皮下接种S180肉瘤细胞,接种后7天γ射线全身照射75mGy,照射后24、48小时分别处死直接测量肿瘤大小变化,取肿瘤组织分别进行流式细胞仪分析凋亡、细胞周期以及免疫组化染色半定量分析凋亡相关蛋白Bcl-2表达的变化。结果与直接荷瘤组相比,低剂量照射组肿瘤生长缓慢(P<0.05),24小时后肿瘤细胞阻滞于G1期,Bcl-2蛋白表达下降,48小时后肿瘤细胞凋亡增加(P<0.001)。结论低剂量辐射可使机体肿瘤细胞阻滞于G1期并通过凋亡相关蛋白表达变化导致肿瘤细胞凋亡增加,明显提高机体抗肿瘤的作用,具有肿瘤治疗和辅助放化疗的实际临床意义。
参考文献：
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[6]. 低剂量辐射通过mTOR信号通路增强多柔比星抑瘤效应并对抗其心脏毒性的研究[D]. 张红梅. 吉林大学. 2017
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[9]. 灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡与自噬的研究[D]. 赵霏. 兰州大学. 2016
[10]. 低剂量辐射对肿瘤细胞凋亡、细胞周期以及凋亡相关蛋白Bcl-2的影响(英文)[J]. 于洪升, 宋爱琴, 费从合, 王卓敏, 邱文生. The Chinese-German Journal of Clinical Oncology. 2005
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