张莹丽 刘静 尹虹 郭瑾通讯作者（甘肃省兰州市第一人民医院 730050）
【摘要】 目的：探讨生长素(Ghrelin)基因多态性在甘肃省甘南藏族自治州藏族人群中的分布及其与2型糖尿病的关系。方法：应用PCR-RFLP技术检测104例2型糖尿病和107名健康对照者Ghrelin的基因型,分别以氧化酶法、放免法、比色法测定他们的空腹血糖、空腹血胰岛素、糖化血红蛋白水平。结果：Ghrelin基因型GG、GA频率在2型糖尿病组和对照组分别为0.885、0.115和0.963、0.037;等位基因G、A频率在2型糖尿病组和对照组分别为0.942、0.058和0.981、0.019。其基因型频率和等位基因频率在2型糖尿病组和对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。基因型频率的相对风险分析发现, GA基因型患2型糖尿病的风险是GG基因型3.359倍(OR=3.359，95%CI：1.047-10.778)。结论：Ghrelin Arg51Glu基因多态性与藏族人群2型糖尿病的发病有相关性,A等位基因可能是2型糖尿病的易感基因。
【关键词】 糖尿病,2型; Ghrelin;；藏族；多态现象(遗传学)【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-7165(2015)14-018-02Association of Arg51Glu polymorphism of the ghrelin gene with susceptibility to type 2diabetes mellitus in Gansu Zang population Zhang Ying Li1, Liu Jing2, Yin Hong1 Guo Jin11 The First People′s Hospital of Lan Zhou(2 Department of endocrinology, Gan Su ProvinceCorresponding author : Zhang Ying Li, Email: zhangyingli80@126.com)[Abstract] bjective To investigate the ghrelin gene polymorphism in Chinese Zang population and its association with type 2 diabetes mellitus (DM).Methods Genotype of ghrelin was determined in 104 patients with type 2 DM and 107 healthy controls by PCR- RFLP. Plasma glucose、insulin andHbA1c levels were measured by biochemical technique . Results ghrelin genotype frequencies of GG、GA were 0.885、0.115 in type 2 DM groupand 0.963、0.037 in control group respectively , and allele frequencies of G、A were 0.942、0.058 in type 2 DM group and 0.981、0.019 in control grouprespectively . There were significant difference in frequencies of allele and genotype in ghrelin Arg51Glu polymorphism between type 2 DM group andcontrol group (both P<0.05).The relative risk of GA genotype suffered from type 2 DM was3.359 times of the GG genotype (OR=3.359，95%CI：1.047-10.778). Conclusion ghrelin Arg51Glu polymorphism is associated with type 2 DM and Aallele appears to be a risk factor for type 2 DM in Zang population .[Keywords] Diabetes mellitus , type 2 ; ghrelin ; Polymorphism (Genetics)
2型糖尿病(DM)是一种多遗传基因、多因素综合作用而导致的一种常见疾病,不同民族和地域在遗传和表型上均有异质性。
Ghrelin是生长激素促分泌物质受体(growth hormone secretagoguereceptor,GHS-R)的内源性配体,与其受体结合后不仅能有效促进生长激素(GH)分泌[1],还能调节进食、能量平衡、糖、脂代谢以及血流动力学等[2,3]。因此在Ghrelin 2型糖尿病的发病机制中可能发挥重要作用。近年来国外研究发现, Ghrelin Arg51Glu基因多态性导致了Ghrelin碳末端氨基酸的改变[4]，此多态性与2型DM患者的 Ghrelin血清水平有关[5]。Ghrelin Arg51Glu基因多态性可能是2型糖尿病的一个危险因素。本研究选择中国甘肃甘南藏族自治州藏族人为研究对象,应用PCR-RFLP方法对Ghrelin Arg51Glu基因进行多态性检测,探讨该位点多态性与2型DM的关系。
对象和方法一、 研究对象1 2型DM组共104例(男54,女50),年龄(54.66±7.80)岁(40～65岁),均来自甘肃省人民医院及兰州市第一人民医院2005年至2013年内科的住院藏族病人。2型DM诊断按1999年WHO的诊断标准,并排除重度吸烟(>10支/日)、嗜酒者,排除原发性性腺、甲状腺、甲状旁腺疾患及肾功能损害、酮症等急性并发症。
2 对照组107名(男55,女52),年龄(55.22±6.87) 岁(40～69岁),均为健康体检者,排除高血压、冠心病等心血管疾病以及肝、肾疾患,全部研究对象均来自甘肃甘南藏族自治州藏族人群,且无血缘关系。年龄、性别、BMI均与2型DM组相匹配。(1)对每位患者询问病史,测量身高及体重,计算体重指数(BMI)＝体重(Kg) /身高2(m2)。(2)抽空腹静脉血分别用氧化酶法和放免法测定血糖(FPG)、血胰岛素(FINS)、用比色法测糖化血红蛋白(HbA1c)。
二、实验方法1 引物设计与合成参照有关文献设计一对引物[4,7],(由宝生物工程有限公司合成),序列为上游引物为:5′GACTCTGGGTCTGACCTCAC 3′,下游引物为:5′ TCCTTCCGTCCCTATTCTG 3′,特异性扩增Ghrelin基因包含第2外显子346位点的一段426bp的DNA序列。
2 人类基因组DNA提取采用柱式DNA提取试剂盒 (购自上海生工生物工程有限公司)，按照说明书的步骤进行提取取，提取后的基因组DNA,-20℃保存备用。
3 PCR扩增反应体系为25μL,其中含10×PCR缓冲液2.5μl,2.5mmol/LdNTPs2.5μl,引物P1、P2各3pmol,模板DNA2.0μl,TaqDNA聚合酶1U,不足体积用灭菌双蒸水补足至25μL。置PCR2400热循环仪(美国应用生物公司生产)94℃预变性3min;再按下列程序循环35次,即94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min;末次循环后,72℃延伸10min。
4 扩增产物的限制性酶切取PCR扩增产物10μl,用限制性内切酶SacⅠ10U(购自大连宝生物工程有限公司)酶切,37℃孵育3h,反应终止后,消化片段在2%琼脂糖凝胶上电泳,溴化乙锭(EB)染色,染色后通过法国VL凝胶成像系统判断结果。
5 血糖、血胰岛素、糖化血红蛋白水平测定氧化酶法测定血糖、放免法测定血胰岛素、比色法测定糖化血红蛋白。HOMA胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG×FINS /22.5。
三、统计学处理应用拟合优度X2检验G h r e l i n基因型频率是否符合Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡定律。病例组和对照组之间的基因型频率以及等位基因频率的差异采用X2检验,临床资料用 ±s表示,组间数据的比较用t检验。FINS及HOMA-IR呈非正态分布,经自然对数转换成正态分布,取其自然对数进行统计,在数值表达式中还原成原值。均在SPSS10.0软件包上完成。
结果1. 基因型分析: PCR扩增目的基因片段长度为426bp，由于该目的基因片段存在2个SacⅠ限制性内切酶识别位点，Ghrelin基因第二外显子346位点由A替代G,酶切位点消失，第二内含子655位点处可被SacⅠ限制性内切酶识别,经SacⅠ限制性内切酶消化后,可产生三种基因型：AA型(334bp,92bp两条带，本研究未检测到),AG型(125bp,209bp,334bp,92bp 4条带),GG型(125bp,209bp,92 bp 3条带)，见图1。
3 2型DM组和对照组空腹血糖、空腹血胰岛素、糖化血红蛋白水平比较空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、HOMA-IR、糖化血红蛋白水平在两组之间比较差异均有统计学意义(均P<0.05); Ghrelin两种基因型(GG、GA型)之间年龄、(FINS)、BMI水平比较差异均无统计学意义， 血糖、HbA1c、HOMA-IR水平比较差异均有统计学意义(均P<0.05) (表2)。
讨论G h r e l i n 是生长激素促分泌物质受体( g r o w t h h o r m o n esecretagogue receptor,GHS-R)的内源性配体，1999年由Kojima [6]等从大鼠胃粘膜细胞分离、纯化而得。人Ghrelin基因位于第3号染色体短臂上,为一段长5199bp的DNA序列,含4个外显子和3个内含子[7]。2001年Ukkola等[4]首次对Ghrelin基因进行分析,发现第2外显子346位碱基存在G/A等位基因多态性,使前Ghrelin原第51位氨基酸由Arg变成Glu,氨基酸Arg51是内切蛋白酶作用的靶位点，可以使前Ghrelin原碳末端66个氨基酸溶蛋白性裂解产生成熟Ghrelin，Ghrelin Arg51Glu基因多态性干扰了内切蛋白酶对Ghrelin碳末端氨基酸的识别，从而不能产生成熟的Ghrelin, 进而影响到体内Ghrelin的血清浓度和生物学效应。实验证明，此多态性与2型DM的 Ghrelin血清水平有关[5]。
本试验结果显示Ghrelin基因型和等位基因频率在2型DM组和对照组比较均有显著性差异(均P<0.05)。从基因型频率的相对风险分析发现,GA基因型患2型DM的风险是GG基因型3.359倍，提示A等位基因可能是2型DM的易感基因。Ukkola [8]等首先证实Ghrelin 346位点G/A基因多态性与芬兰人好发2型DM有关,在2型DM患者中A等位基因频率明显高于对照组,因此,提出A等位基因可能是2型DM易感性的危险因子,本研究的结果与此一致,说明Ghrelin基因多态性与2型DM易感性有相关性。
本研究结果表明,2型DM组和对照组FPG、FINS、HbA1c以及HOMA-IR比较均有显著性差异 (均P<0.05); 2型DM组Ghrelin基因型 (GG和GA型)之间比较显示：BMI、FINS、水平在两型之间比较有一定差异，但差异无统计学意义。FPG、HbA1c、HOMA-IR在两型之间比较均有显著性差异 (均P<0.05)。已有动物实验表明：Ghrelin能够刺激在8.3 mmol/l 葡萄糖液中培养的离体大鼠胰岛细胞分泌胰岛素[9]，静脉注射Ghrelin能够增加大鼠循环胰岛素的水平[10]。Seppo [11]等的研究发现空腹血清Ghrelin浓度降低与2型糖尿病患者血清胰岛素水平以及胰岛素抵抗均有关，多变量分析显示血清Ghrelin 浓度降低是2型糖尿病发生的一个独立危险因素。Ukkola [12]认为Ghrelin 浓度降低使其促生长作用的低下与胰岛素抵抗有关。胰岛素抵抗时机体需要更多的胰岛素，此时Ghrelin对胰岛素释放的刺激作用就会加强。
表明血Ghrelin 浓度与胰岛素抵抗有关。我们的研究发现2型糖尿病组GA型FPG、HOMA-IR较GG型明显增高(均P<0.05)。说明A等位基因是2型糖尿病的易感基因。因此推测：GhrelinArg51Glu基因多态性使血清Ghrelin 浓度降低，胰岛素敏感性低下，最终导致2型糖尿病的发生。
综上所述,本研究认为Ghrelin的Arg51Glu基因多态性可能是藏族人群2型DM发病的遗传因素之一。对于Ghrelin基因多态性与2型DM的研究,还有待今后进行大样本、多地域、多民族广泛深入的协同研究,将有可能为2型DM的风险预测、防治和治疗提供一条新的线索和途径。
参考文献[1] Arvat E, Di Vito L, Broglio F et al. Preliminary evidence thatGhrelin, the natural GH secretagogue (GHS)-receptor ligand,s t r on gly s tim ulat e s G H s e c r etion in h uman s . J En do c rin olInvest,2000,23:493-495[2] Wren AM, Small CJ, Ward HL, et al. The novel hypothalamic peptideghrelin stimulates food intake and growth hormone secretion.Endocrinology, 2000, 141:4325-4328[3] Br o glio F, A r v at E , B en s o A et al. G hr elin , a nat ural G Hsecretagogue produced by the stomach, induces hyperglycemiaand reduces insulin secretion in humans. J Clin EndocrinolMetab,2001,86:5083-5086[4] Uk kola O, Rav us sin E, Jac obs on P et al. Mut ations in t hepreproghrelin/ghrelin gene associated with obesity in humans. JClin Endocrinol Metab , 2001,86:3996-3999[5] U k kol a O , R av u s sin E , J a c o b s o n P et al. Rol e o f g h r elinpolymorphisms in obesitybased on three different studies. ObesRes,2002, 10:782-791[6] Kojima M.Hosoda H.Date Y,et al. Ghrelin is a growth hormonereleasing acylated peptide from stomach..Nature, 1999, 402:656-660.[7] W a jnra jc h MP, Ten IS , G er t n er JM an d Leib el R L G en omicOrganization of the human GHRELIN gene. J Endocr Genet ,2000, 1:231-233[8] 8 Poykko S, Ukkola O,Kauma H et al. Ghrelin Arg51Glu mutation isa risk factor for Type 2 diabetes and hypertension in a randomsample of middle-aged subjects.Diabetologia ,2003, 46:455-458[9] 9 Date Y, Nakazato M, Hashiguchi S et al. Ghrelin is present inpancreatic α-cells of humans and rats and stimulates insulinsecretion. Diabetes ,2002, 51:124-129[10] 10 Le e H M , W a n g G , En gl a n d e r E W e t al . G h r elin , a n e wgastrointestinal endocrine peptide that stimulates insulinsecretion: enteric distribution, ontogeny, influence of endocrine,and dietary manipulations.Endocrinology ,2002, 143:185-190[11] 11 Seppo M，Poykko,Eija Kellokoski,et al. Low plasma ghrelin isassociated with insulin resistance,hypertension,and the prevalenceof type 2 diabetes.Diabetes ,2003, 52:2546-2553[12] 12 Ukkola O Ghrelin and insulin metabolism. Eur J Clin Invest,2003,33:183-185
论文作者:张莹丽 刘静 尹虹 郭瑾通讯作者
论文发表刊物:《医师在线》2015年7月第14期供稿
论文发表时间:2015/9/30
标签：多态性论文; 胰岛素论文; 基因论文; 藏族论文; 糖尿病论文; 基因型论文; 频率论文; 《医师在线》2015年7月第14期供稿论文;