（长沙医学院临床学院 湖南长沙 410219）
【摘要】目的使用ELISA法检测不同浓度脂多糖对哮喘大鼠气道平滑肌细胞合成分泌功能的影响。方法：取6只大鼠，每只哮喘大鼠ASMCs分成3组，A、B、C组，每组1×106cells/ml，A组：空白对照组，与PBS共孵育24小时；B组：低浓度LPS组：加入LPS（终浓度为0.1ng/ml）共孵育24小时；C组：高浓度LPS组；加入LPS（终浓度为100ng/ml）共孵育24小时；D组：TLR4抗体处理组:每日激发哮喘一次,每次于激发哮喘前30分钟腹腔注射抗TLR4抗体1ml，共4周。使用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测各组培养上清液中ASMCs分泌的IFN-γ、IL-4、IL-6、TGF-β的含量，以了解ASMCs的分泌功能。结论：低浓度LPS组（B)IL-4、IL-6蛋白含量高于空白对照组（A)(P<0.01),IFN-Y、TGF-β蛋白含量与空白对照组（A)比较差异无统计学意义（P>0.05);高浓度LPS组（C)IL-4、IL-6蛋白含量低于空白对照组（A)(P<0.01)，IFN-Y、TGF-β蛋白含量高于空白对照组（A)(P<0.01)；低浓度LPS组（B)IL-4、IL-6蛋白含量高于高浓度LPS组（C)(P<0.01),IFN-Y、TGF-β蛋白含量低于高浓度LPS组(C)(P<0.01)；低浓度LPS+TLR4抗体组（D)IL-4、IL-6蛋白含量低于低浓度LPS组（B)(P<0.01)，IFN-Y、TGF-β蛋白含量与低浓度LPS组（B)比较差异无统计学意义(P>0.05),分别与空白对照组（A)TGF-β、IL-4、IL-6、IFN-Y含量比较差异无统计学意义（P>0.05);高浓度LPS+TLR4抗体组（E)IL-4、IL-6蛋白含量高于高浓度LPS组(C)(P<0.01),IFN-Y、TGF-β蛋白含量低于高浓度LPS组（B)(P<0.01),分别与空白对照组（A)IL-4、IFN-Y、IL-6、TGF-β含量比较差异无统计学意义（P>0.05)。
【关键词】ELISA法；脂多糖；平滑肌细胞；合成分泌功能
引言
支气管哮喘（哮喘）是由多种气道炎症细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等）和结构细胞（如平滑肌细胞、气道上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞）还有细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。研究发现[1]，这些细胞并不仅是被动的靶细胞，而且还可以作为效应细胞主动参与气道炎症反应。其中对气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)的研究尤为深入。研究表明在哮喘中，气道平滑肌在表型、结构和功能上具有可塑性，发现ASMCs不仅对神经源信号与炎症介质产生收缩反应，还具有合成分泌的功能，在某些炎性因子的诱导下可分泌和表达多种细胞因子、趋化因子、细胞黏附分子等免疫调节介质，参与气道炎症、气道高反应性和气道重构的发生发展[2]。ASMCs作为免疫调节细胞参与炎症反应的机制十分复杂，其涉及一些炎症介质的释放及Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs)的激活[3]。
为探讨不同浓度LPS对哮喘大鼠ASMCs合成分泌功能的影响及机制，我们将采用传统OVA哮喘造模方法建立哮喘大鼠模型，酶解消化法培养哮喘大鼠原代ASMCs，经细胞形态学鉴定及免疫细胞化学SP法检测证实所培养细胞为大鼠ASMCs。将培养的ASMCs进行分组，使用不同浓度的LPS进行刺激，使用TLR4阻断剂阻断TLR4,通过ELISA检测不同组别IFN-Y、IL-4分泌情况，以此了解低浓度与高浓度LPS分别刺激后ASMCs的合成分泌功能以及这种分泌功能与TLR4信号通路的关系同时也为寻找抑制哮喘气道炎症反应提供了重要的理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
实验动物SPF级SD大鼠（雄性，体重200±30g)由长沙医学院动物实验中心提供。
1.1.2实验试剂
卵清白蛋白（OVA)、氢氧化铝凝胶、灭活百日咳杆菌为上海生物研究所提供；水合氯醛、青霉素、链霉素、庆大霉素均由长沙医学院附属医院提供；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、I型胶原酶、DMEM-F12培养基、胎牛血清(FBS)均为美国GIBCO公司产品；超纯脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品；小鼠抗大鼠平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(cx-SM-actin)为北京启明工程有限公司；SP免疫组化试剂盒（二抗)、DAB显色试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司；PBS、D-Hank's液均为上海生物工程有限公司产品；PCR引物、内参照3肌动蛋白（3-actin)引物均由湖南生物工程有限公司合成。
1.1.3实验仪器
402AI型超声波雾化器为江苏鱼跃医疗设备有限公司产品；动物解剖器械为上海医疗器械公司产品；Axioert40型倒置显微镜为德国ZEISS公司产品；SW-CJ-2FD型超净工作台为苏州安泰Heracell150二氧化碳培养箱为美国Thermo公司美国Beckman公司产品；紫外分光光度仪为美国仪为美国MJ Research公司产品；BG-subMINI电泳仪产品；GBOXHR凝胶成像系统为美国SytiGene酶标仪为BIORAD公司产品；-20°C低温沐箱为长虹电器有限公司产品；-80°C超低温冰箱为美国"ThennoForma公司有机玻璃箱。
1.2研究方法
1.2.1分组情况
将12只SD大鼠按随机原则分成2组，每组6只。①哮喘8周组于致敏后第15天开始给予2%OVA磷酸盐缓冲液（OVAPBS）50ml雾化吸入激发哮喘，每天一次，每次30分钟，持续8周。②空白对照8周组：空白对照组以磷酸盐缓冲液（PBS）代替致敏原注射和雾化吸入8周。哮喘大鼠最后一次激发后24小时内，腹腔注射10%水合氯醛溶液（8ml/kg）麻醉大鼠，无菌摘取全肺，解剖显微镜下分离出哮喘大鼠第3-4级支气管，剥离支气管平滑肌周围的肺动脉、肺静脉、神经纤维、结缔组织等，去除内腔的上皮组织，将支气管平滑肌剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块后，将组织转入含有下列成分（胶原酶2mg/ml，木瓜酶3mg/ml，牛血清白蛋白2mg/ml）的D-Hank’s液中，在37℃5%二氧化碳培养箱中消化40-50分钟，用100目不锈钢网过滤，800rpm离心后，去上清，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液悬浮所分离的单细胞，种于25ml培养瓶中，置于370℃5%二氧化碳培养箱中培养。待原代细胞生长融合后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，用含10%胎牛血清的DMEM培养液传代培养。实验选用4-10代哮喘大鼠ASMCs，胰酶消化大鼠ASMCs,用台盼蓝染色计数,细胞存活率大于95%。用含10%FBS的DMEM-F12培养基培养24h后，换无血清DMEM-F12继续培养24h,使细狍同步于GO期。胰酶消化细胞，按1X106/ml密度接种于6孔板，换用含10%FBS的DMEM-F12培养基,随机分为5组进行药物干预：（1)空白对照组（A):不作任何干预；（2)低浓度LPS组（B):加入低浓度LPS(终浓度为0.1ng/ml)刺激；（3)高浓度LPS组（C):加V高浓度LPS(终浓度为100ng/ml)刺激；(4)低浓度LPS+TLR4抗体组（D):TLR4抗体（终浓度为50ng/ml)预处理30min后，加入低浓度IPS(终浓度为0.1.ng/ml);(5)高浓度LPS+TLR4抗体组(E)：TLR4抗体（终浓度为50ng/ml)预处理30min后，加入高浓度LPS(终浓度为100ng/ml)。培养24h后收集细胞上清液，离心后待用做ELISA。
1.2.2ELISA检测细胞上清液中IL-4、IFN-Y、IL-6、TGF-β的蛋白含量
细胞上清液收集：按上述方法收集各组细胞上清液。①10X标本稀释液用双蒸水做1:10倍稀释。②标准品配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。③建立标准曲线：设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二管至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后吸出500ul，移至第二管。如此反复对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。④洗涤液：用双蒸水做1:20倍稀释。(3)步骤：①加样：每孔各加入待测样品1OOul，将反应板充分混匀后，用封胶板纸封住反应孔，置37°C恒温箱中，120min。②取出反应板，用稀释好的洗涤液将反应板充分洗涤6次，向滤纸上印干。③反应孔中加入第一抗体工作液1OOul，将反应板充分混匀后置37°C恒温箱中，60min。④洗板：方法如②。⑤反应孔中加酶标抗体工作液100uL将反应板置37°C恒温箱中，30min。⑥洗板：方法如②。⑦反应孔中加入底物液工作液100ul,置37°C恒温箱中，反应15min。⑧反应孔中加入100ul终止液混匀后立即测量。⑨用酶标仪测吸光值，IL-4、IFN-Y、IL-6、TGF-β均测量OD450nm值。⑥洗板：方法如②。⑦反应孔中加入底物液工作液1OOul,置37°C恒温箱中，反应15min。⑧反应孔中加入100ul终止液混匀后立即测量。⑨用酶标仪测吸光值，IL-4、IFN-Y、IL-6、TGF-β均测量OD450nm值。
1.3统计学方法
每个测量OD值均减去空白孔OD值后再计算；绘制标准曲线：以标准品为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线，通过标本的OD值计算样品浓度。实验结果采用均数土标准差表示，运用SPSS22.0分析软件进行统计学分析，各组间的比较采用方差分析，两两比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果ELISA检测细胞上清液中IL-4、IFN-Y、IL-6、TGF-β的蛋白含量
比较各组细胞培养上清液IL-4、IFN-Y、IL-6、TGF-β蛋白含量可见：低浓度LPS组IL-4蛋白含量高于空白对照组（P<0.01),IFN-Y蛋白含量与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05);高浓度LPS组IL-4、IL-6蛋白含量低于空白对照组（P<0.01)，IFN-Y、TGF-β蛋白含量高于空白对照组（P<0.01);低浓度LPS组IL-4、IL-6蛋白含量高于高浓度LPS组（P<0.01),，IFN-Y、TGF-β蛋白含量低于高浓度LPS组（P<0.01);低浓度LPS+TLR4抗体组IL-4、IL-6蛋白含量低于低浓度LPS组（P<0.01)，IFN-Y、TGF-β蛋白含量与低浓度LPS组比较差异无统计学意义（P>0.05)，分别与空白对照组IL-4、IFN-Y、IL-6、TGF-β含量比较差异无统计学意义（P>0.05);高浓度LPS+TLR4抗体组IL-4、IL-6蛋白含量高于高浓度LPS组(P<0.01),IFN-Y、TGF-β蛋白含量低于高浓度LPS组（PC0.01)，分别与空白对照组IL-4、IFN-Y、IL-6、TGF-β含量比较差异无统计学意义（P>0.05)。结果见表1
3讨论
气道炎症的免疫学机制认为Th1/Th2失衡是哮喘慢性气道炎症形成的基础。Th2型优势应答直接导致Th2型细胞因子的过度分泌，加重气道炎症[4]。Th1型主要分泌IFN-y、IL-2和TNF-0等细胞因子，活化巨噬细胞及引起细胞毒作用，从而介导细胞免疫，调节机体免疫抗感染功能；Th2型主要分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等细胞因子，促进变态反应性炎症的发生。IFN-y、IL-4分别是Th1、Th2型较有代表性的细胞因子[5-6]。IFN-r促进Th1分化，与IL-4相互拮抗，抑制Th2的活性。IL-4能激活B细胞产生IgE使机体致敏，并且可促使Th0向Th2分化，诱导Th2型细胞因子的产生，抑制Th1、细胞因子的形成。Th2细胞还可通过释放IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子直接引起某些炎症细胞的聚集和活化，促使气道的迟发型变态反应的发生。在参与炎症反应的炎症因子中，TNF-α是一种参与炎症启动且诱导CRP，IL-6等其他炎症因子的合成而维持炎症全过程的关键因素;IL-6则是一种参与炎症期细胞因子表达而引起局部炎症，同时激活巨噬细胞的分化和浸润而加快哮喘发生的多功能的循环介质因子[7]。
全球哮喘发病率逐年增加，发达国家尤为突出，农村和发展中国家的哮喘发病率远低于城市和发达国家哮喘的发病率。这种现象部分归咎于“卫生假说”，即在生命初期，周围环境越洁净，细菌内毒素主要成分LPS的暴露就越少，则日后患哮喘的几率会越大，也就是说生命早期接触环境内毒素可能会保护性地预防哮喘的发生。“卫生假说”生物学基础源于Th1/Th2失衡学说，生命初期由于缺乏病原微生物暴露，可能会导致后天免疫系统Th1和Th2细胞失去了T淋巴细胞的调节作用；相比之下生命初期适当接触病原微生物，可调节免疫系统的发展，激活T淋巴细胞，日后再接触感染因素时可能使Th1/Th2的失衡向Th1方向偏移[8]。但是，“卫生假说”对于微生物的负荷和持续时间，暴露的剂量及途径却没有明确说明，有待进一步实验研究。
参考文献：
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论文作者:刘梅,陈永衡,伍岳,刘利,贺伦
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第04期
论文发表时间:2019/4/10
标签：哮喘论文; 细胞论文; 炎症论文; 含量论文; 蛋白论文; 气道论文; 平滑肌论文; 《医师在线（学术版）》2019年第04期论文;