邹跃[1]2004年在《端粒酶的放射损伤修复机制及对肿瘤细胞凋亡调控的实验研究》文中研究表明端粒酶在85％～90％人肿瘤细胞高表达。肿瘤放疗是肿瘤治疗主要手段之一。细胞凋亡与潜在致死性损伤修复是决定放疗疗效的生物学基础。端粒是放射损伤的敏感位点。目前对端粒损伤修复是否是潜在致死性损伤修复中重要的机制还未见有学者明确提出，对端粒酶如何参与端粒损伤的修复及凋亡的调控机制了解还很少。目前端粒修复可能影响凋亡的观点还缺乏充分的实验依据支持。本研究目的是阐明端粒酶参与端粒潜在致死性损伤修复和调控射线诱导凋亡的机制和规律，最终将端粒酶应用于临床以改善肿瘤放疗疗效。本课题采用TRAP、southern blotting、RT-PCR、流式细胞术及原位端粒酶-凋亡双染等方法对端粒酶的放射损伤修复机制和调控凋亡作用进行了系统深入的研究，并在此基础上将新的反义技术RNAi引入抑制端粒酶、增强射线诱导凋亡的研究中，结果表明端粒酶是一个修复放射损伤、抑制凋亡的重要因素。其中原位端粒酶-凋亡双染技术方法及其所获得的结果国内外尚未见报道，此技术方法通过本实验证明是成功的；对RNAi在放射损伤领域所进行的研究为探索性，也未见国内外报道。根据实验结果，提出了端粒酶通过在端粒部位合成端粒序列(端粒延长)修复端粒而调控凋亡是潜在致死性损伤修复的重要机制，进一步完善了潜在致死性损伤修复和凋亡调控机制，为端粒酶检测应用于临床预测肿瘤细胞放射敏感性，及为抑制端粒酶提高放射抗拒肿瘤的放疗效果提供了理论依据。实验获得的重要结果如下： 1．通过以RT-PCR为基础的TRAP方法和原位杂交法检测了A549和L02端粒酶活性和hTERT表达。结果显示，经1Gy-5Gy γ射线照射，端粒酶活性水平提高了1.3-2.5倍，照射后48h～72h达高峰，呈时间和剂量依赖性，证实射线可诱导端粒酶表达增强。实验还证实存在hTERT转录水平提高的机制。 2．采用原位端粒酶-凋亡双染色法，直接证实了凋亡细胞中端粒酶表达依然保持高水平，并发现在射线诱导细胞凋亡过程中端粒酶表达增强，说明射线杀伤效应不是通过抑制端粒酶的机制。A549端粒酶表达水平高而凋亡率低，L02则与之相反，两者间显示出的酶活性水平与凋亡率的剪刀差关系，表明端粒军事医学科学院卫生毒理学博士学位论文2004年5月 酶可修复损伤DNA，是一个射线诱导凋亡抑制因素。3.Southern杂交检测TRF发现，照射后细胞端粒延长Ikb，并与端粒酶表达增 强有相近似的剂量效应和时间效应，证明端粒序列的合成是端粒放射损伤修 复的主要途径，阐明了端粒酶可通过调控端粒长度、封闭凋亡启动感应位点 而调控射线诱导凋亡敏感性的机制。结果提示，监测肿瘤细胞端粒酶表达水 平可预测放疗敏感性。基于上述实验结果，拟建了一条利用端粒酶改善肿瘤 放疗疗效的原理线路:射线一端粒损伤~端粒酶激活~修复端粒及基因组. 端粒序列(参与潜在致死损伤修复)~封闭凋亡启动、调控射线诱导凋亡敏 感性一预测肿瘤细胞放射敏感性，抑制端粒酶提高抗放肿瘤对射线的敏感性 一改善临床放疗疗效。4.在较充分掌握了端粒酶调控射线诱导凋亡机制和规律的基础上，进一步研究 端粒酶抑制剂对端粒酶表达和射线诱导肿瘤细胞凋亡的影响。TRAP一ELIsA 显示AZT(0.05、Ilnlnol/L)可显着抑制A549和L02端粒酶活性，并可诱导凋亡。 但FcM显示照射后48h AZT/照射联合组凋亡率与照射组或AZT组无差异，联 合组仅显示出AZT细胞毒性，然而细胞生长曲线则显示联合组细胞存活率显 着低于照射组，提出了AZT急性细胞毒性作用和增强射线诱导凋亡的联合作 用机制模式。5.探索性将RNAi技术用于抑制端粒酶、增强射线诱导凋亡的研究中。构建了 干扰hTERT mRNA的pPUR/hTERT表达载体，用脂质体介导转染A549，筛选 了稳定表达株。转染后40d，端粒酶活性抑制，RT一PCR显示hTERT表达降低， 射线诱导端粒延长的作用部分受抑制，FCM显示1Gy’5Gy照射后24h pPUR/hTERT表达组凋亡率显着高于对照组。结果表明，抑制端粒酶的放射损 伤修复作用可提高射线诱导凋亡，进一步证明了端粒酶修复端粒损伤是潜在 致死性损伤修复的重要机制，同时提示siRNA可作为端粒酶抑制剂，预示了 其可改善抗放肿瘤对射线的反应，具有提高肿瘤放疗效果的临床发展前景。
戴静[2]2004年在《逆转录酶抑制剂对人脑胶质瘤U251细胞放射增敏作用的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：观察逆转录酶抑制剂AZT(3’-azido-3’-deoxythmidine，迭氮胸苷)，联合~(60)Coγ-射线对人脑胶质瘤细胞U251端粒酶活性、端粒长度、放射性DNA损伤修复(SSB、DSB)及细胞存活的影响，研究AZT的放射增敏作用，探讨其放射增敏的机制。 方法：实验分为四组：(1)空白组：未行AZT与γ-射线处理；(2)放射组：细胞接受2Gyγ-射线单次照射；(3)加药组：细胞培养液中加入终浓度为0.8mm／L的AZT作用24h；(4)药放组：细胞经过0.8mm／L的AZT作用24h后再行2Gyγ-射线单次照射。于照射后不同时间收集细胞，用端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR-ELISA)检测端粒酶活性的动态变化；用Southern Blot方法检测端粒长度；用碱性、中性单细胞凝胶电泳方法检测辐射后DNA单链、双链断裂(尾矩)；采用克隆形成分析方法观察AZT对细胞存活分数的影响，绘制生存曲线，计算放射增敏比SER_(SF2.)，SER_(SF2.)定义为放射组和药放组之间SF_2的比值。 结果：AZT不仅能够抑制U251细胞的端粒酶活性(1.019±0.116比1.567±0.037，P＜0.01)，而且还可以抑制辐射诱导的端粒酶活性上升(1.121±0.161比1.908±0.23l，P＜0.05)。AZT作用24h并未造成U251细胞端粒长度的缩短(6.964±0.093比6.962±0.912，P＞0.05)，但可影响辐射导致的短端粒的修复，药放组与放射组在照射后15min、30min、1h处的端粒长度有显着性差异(P＜0.05)。空白组与加药组细胞无慧尾，表明AZT本身不会导致DNA SSB与DSB。而放射组和药放组均出现明显的彗星图象，药放组的初始SSB和DSB与放射组相比无显着性差异(P＞0.05)，但前者的修复速度较慢，照射后2h放射组的SSB和DSB基本修复完全，而药放组仍有残留(SSB残留约50％，DSB残留约40％，P＜0.05)。经SPSS软件拟合生存曲线后，可得出U251细胞的D_0、Dq、SF_2分别为1.803、2.5、0.752，AZT的放射增敏比SER_(D0)、SER_(Dq)、SER_(SF2)分别为1.294、1.25和1.365。相关分析显示：放射组、药放组的端粒长度、SSB、DSB与其端粒酶活性均有高度相关(r＞0.7)。 结论：AZT具有放射增敏的作用，推测其机制可能与端粒酶活性下降，影响端粒的修复以及DNA SSB、DSB的修复有关。
冯惠茹[3]2002年在《～（32）Pβ射线持续低剂量率照射肿瘤细胞的放射生物学机制及端粒酶的治疗监控和放射增敏价值基础研究》文中研究表明放射免疫治疗作为小剂量、持续低剂量率治疗，在合理的杀伤肿瘤组织同时对正常组损伤较小。其近期及远期的放射生物学机制需要进一步揭示。端粒酶作为肿瘤特异性标志物，预示着在放疗增敏及治疗监控中的巨大潜力。本文与高剂量率γ射线对比，研究了β射线低剂量率持续照射肿瘤细胞的近期及远期生物学效应及机制；初步探索了端粒酶在治疗监控和辐射增敏的应用价值。 32Pβ射线低剂量率持续照射的辐射效应特点 照射源选用32P制作的放射性贴片面源和60Co辐射源。细胞选择HeLa细胞系。用台盼蓝排除法、流式细胞周期及凋亡检测和X-gal衰老细胞染色法比较了两种辐射方式下肿瘤细胞在死亡和增殖两方面的特点。结果显示，剂量率为0.375cGy／min32Pβ射线与剂量率为206cGy／min的60Coγ射线在照射后72h对HeLa细胞的抑制效果类似，但是作用过程存在差异。前者抑制细胞增殖为渐进性，允许多数的细胞在倍增一个或几个细胞周期后死亡，以增殖性死亡和凋亡为主，细胞周期G2期阻滞表现为持续的中度(50％)阻滞。而后者对细胞的抑制作用直接、迅速，细胞周期阻滞可以达到80％，照射后阻滞解除迅速，提示细胞死亡和后续的细胞修复的开始，细胞增殖性死亡(衰老)和凋亡比例低于持续低剂量照射方式。60COγ射线照射细胞总死亡率高于32Pβ射线，而最终的肿瘤抑制效果接近，提示，在32Pβ射线的细胞杀伤效应中，高比重的肿瘤细胞增殖性死亡最终缩小了与60COγ射线抑制肿瘤效果的差异。持续照射对细胞损伤、修复机制的破坏和对辐射相对敏感的G2期持续阻滞可能是增强其杀伤效应的因素之一。 32Pβ射线低剂量率持续照射的远期效应 用[3H]掺入法、衰老细胞染色、染色体异常分析和端粒酶活性检测等方法，对肿瘤细胞照射后较远时间点的细胞形态、 军医进修学院 博士学位论文 细胞增殖等辐射后遗效应及其可能的机制作了初步探索。照射后30天观察发现， 照射后形态异常（大的、多倍体、多核）的细胞比例高于未照射组，且与剂量有 关。衰老细胞染色显示这一部分细胞为衰老细胞。［扣掺人法检测细胞增殖发现 照射后细胞DNA合成指数低于未照射组，与剂量呈反向相关。染色体异常的比例 增高，端粒酶活性低于未照射细胞。辐射后染色体异常可能是细胞衰老，细胞增 殖下降的原因。端粒酶下降可能是细胞增殖抑制的结果。同时，辐射可能是导致 端粒酶活性下降的直接原因，端粒酶改变诱导染色体不稳定，使细胞衰老，增 殖抑制。 应坦隘塑颤骆须回垣睦囫数L 辐射源采用‘zP6射线和吐叮射线。细胞选用 了9种细胞和细胞系，包括实体瘤细胞系SGC刁901、HeLa、NSCLC、MCF刁及 H772、悬浮生长淋巴瘤细胞系 U937、内皮细胞系匹V－304、LSEC（转 hTERT使 端粒酶表达人肝窦内皮细胞系）和原代培养的内皮细胞MB－rEC（鼠脑微血管内 皮）。结果发现，9种细胞照射前的端粒酶活性与台盼蓝法检测的辐射对细胞的杀 伤效应没有相关性。将8种细胞（无U937）的克隆增殖率与端粒酶活性进行分析， 二者呈显着相关。这一阳性结果可能与非肿瘤细胞细胞的低端粒酶活性、高辐射 抗性有关。照射后实体肿瘤细胞的克隆形成率与端粒酶活性比较没有显着相关 性。为了研究高端粒酶活性是否与细胞的凋亡抗性有关，用Annexin－V－FITC和 PI双标记法检测细胞凋亡，结果显示HeLa、NSCLC、H7721和U937细胞在48h 的凋亡率与其照射前的端粒酶活性呈反向相关。这一阳性结果可能与淋巴瘤细胞 系对射线诱导凋亡的高敏感性有关。这一数据与实体瘤细胞增殖实验的结果相矛 盾，可能与细胞系选择偏差有关。总之，实体瘤细胞照射前端粒酶活性与其辐射 抑制肿瘤干细胞的增殖效应无关；辐射诱导肿瘤细胞的凋亡与其端粒酶活性相 关。端粒酶可能是间接影响因素。 筵堑匿茧龊n四朗驱组啦坚 照射后端粒酶活性调节存在争议，能否反映照射 5 军医进修学院 博土学位论文 后细胞的杀伤效应没有定论。困此，研究中选择P53野生型细胞系HeLa和P53 突变细胞系C。1。－201，检测照射后的端粒酶活性，并与TdT末端标记法检测的细 胞凋亡作对比，结果显示两种细胞M 照射后端粒酶活性均有一过性升高，4Gy 和SGy照射后端粒酶活性下降，第7天时所有照射剂量组细胞的端粒酶活性均低 于未照射组，并呈剂量依赖性。照射后端粒酶活性的下降与照射后的细胞凋亡呈 负相关。回归分析显示，照射后端粒酶活性可以预测辐射对细胞的杀伤效应。TdT 末端标记流式细胞检测法显示细胞凋亡主要
张勇[4]2011年在《抑癌基因PTEN对肝癌细胞的放射增敏作用研究》文中提出研究目的和意义：原发性肝细胞肝癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,全球发病每年约62万例,男女之比为4：1。在我国肝癌发病人数占世界每年新发病患者的55%,居我国癌症发病率的第二位,每年有13万人死于肝癌。在恶性肿瘤中,肝癌是一种生存期较短、死亡率较高、治疗很困难的恶性疾病,提高对肝癌的治疗水平具有十分重要的意义。虽然外科手术是原发性肝癌首选治疗方法,但手术率仅有5%-20%左右,同时手术复发率很高。多数肝癌患者就诊已属中晚期,此类患者能手术切除者仅占30%左右,不能手术切除的原发性肝癌的治疗方法很多,包括肝动脉插管栓塞化疗、病灶局部注射无水酒精、冷冻治疗、瘤体内射频高温治疗和体外超声波聚焦治疗等局部消融治疗都取得了一定的疗效。放射治疗与外科有类似之处,属于局部区域性治疗手段。随着放射治疗技术的进步,适形放疗已逐渐成为非手术治疗肝癌的主要治疗方法之一。然而,放疗的临床治疗效果并不满意。肿瘤组织的放射抵抗是肿瘤放射治疗失败的原因之一,由于肝癌细胞的相对辐射抗拒性,使得肝癌的根治剂量明显高于肝脏的耐受剂量,尤其中晚期肝癌患者多数有肝病基础,又限制了放疗剂量的提高,导致肝癌放疗效果不佳。因此,寻找有效的、专一针对肿瘤组织的放射增敏办法对提高肿瘤组织的放疗敏感性,降低肿瘤组织的放疗抵抗,减低周围正常组织的放疗毒副作用具有重要意义,可为提高肝癌的放射治疗效果提供新的思路和途径。随着分子生物学的研究发展,越来越多的人认识到恶性肿瘤的发生是一种涉及多基因事件的过程。肿瘤的基因治疗逐渐成为肿瘤治疗研究的热点之一,但临床应用效果并不令人满意。同时,分子生物学的发展也为肿瘤放射治疗提供了分子水平的理论依据,指出其杀伤作用的产生有赖于一系列基因功能的正常发挥。为了弥补各自的缺陷和不足,放射治疗与肿瘤基因治疗在自身发展的同时,正在有效地结合起来,以基因治疗靶向性处理肿瘤细胞,提高其对放射线的敏感性,然后联合放疗,有的学者将这种新的治疗模式称为肿瘤的基因-放射治疗(genetic radiotherapy).肿瘤的基因-放射治疗是指将同时具有肿瘤治疗和辐射诱导特性的基因转入体内,在对肿瘤实施局部放疗时诱导肿瘤治疗基因的表达,造成射线和基因对肿瘤的双重杀伤作用。这样一方面可以相对降低等效照射剂量,缓解正常组织损伤；另一方面也可在即使是基因进入体内后均匀分布的情况下,通过射线的局部照射来实现定位表达。因此,将肿瘤的放射治疗与基因治疗相结合,可以解决两者单独应用时各自存在的敏感性和特异性问题。目前,初步的实验研究表明,基因-放射治疗具有提高肿瘤治疗基因的局部表达量、降低有效照射剂量、减轻受照部位正常组织的放射损伤等诸多优点。治疗基因的选择是实现此方案的关键,因此开展新的治疗基因的研究是当前恶性肿瘤基因-放射治疗的研究重点之一。PTEN是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,被认为是继pRb、p53后的又一重要的肿瘤抑制基因,与多种肿瘤发生、发展密切相关,因此备受关注。PTEN是一种多功能性的蛋白,具有两种磷酸酶的活性：一种是脂质磷酸酶活性,使磷脂酰肌醇-3,4,5-叁磷酸去磷酸化,调节第二信使PIP3的水平,阻断了PI3K/AKT途径,参与调节细胞生长、增殖和凋亡,抑制肿瘤生长,诱导肿瘤细胞分化；另一种是蛋白酪氨酸磷酸酶活性,通过靶向于FAK和Shc的蛋白质酪氨酸磷酸酶功能抑制了Ras/Raf/MEK/ERK通路的级联反应和FAK级联反应,影响细胞和细胞间质的相互作用,参与调节细胞粘连、迁移、肿瘤细胞的转移、细胞骨架的组建及MAP kinase的活化和肿瘤血管的形成。在原发性肝细胞癌的研究中,已证实PTEN基因的表达缺失与HCC的发生发展密切相关,且PTEN基因可有效抑制肿瘤细胞的生长。在肝癌细胞系中恢复PTEN的表达,细胞生长受到明显抑制。尽管目前将PTEN基因引入原发性肝癌的放射治疗在国内外尚未见报道,但在对其他多种肿瘤的研究中已发现,PTEN可以增加多种肿瘤细胞的辐射敏感性：在前列腺癌细胞、胶质瘤细胞、结肠癌细胞以及非小细胞肺癌细胞中均发现增加PTEN的表达可以增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用。因此,PTEN强抑癌功能及对肿瘤细胞的放射增敏功能可被引入肝癌的基因治疗,通过转基因技术恢复肝癌细胞中缺失表达的野生型PTEN基因,发挥正常PTEN基因的抑癌功能,同时增强对肝癌细胞的放射杀伤作用。基于肿瘤基因-放射治疗的设想,本研究将具有辐射诱导作用的Egr-1基因启动子辐射诱导增强区域与抑癌基因PTEN相连接,构建辐射诱导表达载体,探讨含PTEN的辐射诱导表达载体稳定转染肝癌细胞系SMMC-7721后,对肝癌细胞的辐射增敏作用及其机制。本研究采用辐射诱导基因调控序列偶联不具备辐射诱导特性的抑癌基因,通过放射线照射调控抑癌基因的表达,这一治疗手段不仅非常有特色,并且可以解决单纯基因治疗存在的特异性不强的问题,从技术手段来讲,对肿瘤放疗研究方面是一次较新的尝试。同时本研究选择抑癌基因PTEN为基因治疗靶点,PTEN基因是目前研究较明确的、具有多途径抑癌作用的强效抑癌基因,目前将PTEN基因引入原发性肝癌的放射治疗在国内外尚未见报道,从治疗基因的选择方面,选择联合PTEN来增强肝癌细胞的放疗敏感性既是对肝癌放疗增敏研究的全新尝试,也是非常可行的研究。另外,研究从肿瘤的放射增敏的分子机制入手,探讨联合PTEN进行放射治疗肝癌细胞的可能机制,丰富了肿瘤基因-放射治疗的理论依据。目前,由于原发性肝癌的治疗效果有限,放射治疗作为非手术治疗患者的首选方法存在相对辐射抵抗性强的问题而限制了其应用,严重影响了肝癌患者的生存质量。本研究的实施将为原发性肝癌的放射治疗提供新的理论和实践视角,在解决肿瘤放射性抵抗问题上起到一定的推动作用,为今后原发性肝癌的基因-放射治疗应用于临床实践提供理论和实践支持。方法：分别构建含野生型PTEN和丧失了脂质磷酸酶活性的突变型PTEN的重组辐射诱导质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E,通过荧光素酶报告实验鉴定X线照射对Egr-1启动子活性的影响,寻求最适的照射条件。将构建好的重组质粒分别稳定转染入人肝癌细胞系SMMC-7721细胞,通过Western—blot法检测X线照射对PTEN蛋白表达的影响；MTT实验检测基因稳定转染SMMC-7721细胞后对细胞生长的影响；通过平板克隆实验计数克隆形成数并计算存活分数(SF),利用GraphPad Prism 5软件分别根据线性二次(L-Q)模型和多靶单击模型,得到放射生物学参数并评价转染PTEN基因后对肝癌细胞SMMC-7721细胞的辐射增敏作用；流式细胞仪检测转染PTEN基因后细胞接受X线照射前后细胞周期的变化；TUNEL检测法通过流式细胞仪检测转染PTEN基因并接受X线照射后细胞的凋亡情况；通过免疫荧光法检测细胞在接受8 Gy的X线照射后,于0、7min、1h、2h、4h、6h、12h、24h时细胞的γ-H2AX焦点形成数,进而观察肝癌细胞系SMMC-7721细胞在接受X线照射后的DNA损伤、修复情况。通过Western—blot法检测转染野生型PTEN、突变型PTEN细胞接受照射后总Akt和磷酸化Akt的表达变化,进一步采用PI3K抑制剂LY294002作用于肝癌细胞系SMMC-7721细胞,MTT检测观察应用PI3K抑制剂对受照细胞生长的影响,平板克隆实验计算存活分数,利用GraphPad Prism 5软件分别根据线性二次(L-Q)模型和多靶单击模型,得到放射生物学参数并评价PI3K抑制剂LY294002对SMMC-7721细胞的辐射增敏作用；流式细胞仪检测应用LY294002后细胞接受X线照射前后细胞周期的变化；应用流式细胞仪采用TUNEL法检测应用LY294002并接受X线照射后细胞的凋亡情况；通过免疫荧光法检测LY294002处理细胞在接受8 Gy的X线照射后,不同时间点细胞的γ-H2AX焦点形成数,观察细胞在接受X线照射后的DNA损伤、修复情况,并与转染野生型PTEN细胞组进行比较。结果：1、分别构建出含野生型PTEN和丧失了脂质磷酸酶活性的突变型PTEN的重组辐射诱导质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E;2、通过荧光素酶报告实验验证了辐射对所构建的Egr-1启动子区具有一定的诱导表达作用,同时,也寻找到了对SMMC-7721细胞进行照射的最适条件,即细胞转染24小时后,对细胞进行8 Gy的X线照射并于照射后24小时收集细胞进行后续的实验研究；3、Western—blot检测表明转染了pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E的SMMC-7721细胞组在未接受照射(0 Gy)时PTEN蛋白的表达量极低,仅见微弱表达,但在接受8 Gy的X线照射后,PTEN蛋白的表达量明显提高,高于转染了pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E的细胞；4、MTT检测结果表明转染野生型PTEN组细胞在接受了8 Gy的X线照射后,细胞的生长明显较接受了同样剂量的X线照射后的转染空载体pEgr-C1组与转染重组突变质粒pEgr-PTEN-G129E组细胞增殖速度慢；5、转染了野生型PTEN组细胞SF2值(即接受2Gy照射后的细胞存活分数)、D0、Dq值均低于转染突变性PTEN组和未转染PTEN而仅转染了空质粒组细胞,而α值、α/β值均高于转染突变性PTEN组和未转染PTEN而仅转染了空质粒组细胞,表明转染了野生型PTEN组的细胞对X线照射的敏感性提高；6、接受8 Gy的X线照射后,转染了野生型PTEN组细胞G2/M期细胞比例明显提高,出现了明显的G2/M期阻滞；7、细胞接受照射24小时后,就已经有凋亡的出现,且转染野生型PTEN组细胞在接受8 Gy的X线照射后细胞凋亡率较转染空载体pEgr-C1组细胞和转染重组突变质粒pEgr-PTEN-G129E组的细胞凋亡率明显提高,照射后48小时各组细胞在接受X线照射后凋亡率进一步提高,但转染野生型PTEN组细胞在接受X线照射后48小时细胞凋亡率提升最为明显,远较另两组细胞的凋亡率明显提高；8、各组细胞在受到辐射作用后7min均出现DNA双链断裂的发生,随着照射后时间的延长,DNA双链断裂形成的γ-H2AX焦点数逐渐减少,损伤的DNA双链逐渐修复,但在转染了野生型PTEN组、重组突变质粒pEgr-PTEN-G129E组和空载体pEgr-C1组细胞间DNA双链修复却不尽相同：转染野生型PTEN组细胞较另两组细胞受X线照射后,在相同时间点具有更多的未修复的DNA断裂双链,DNA修复能力降低,出现延迟现象；9、Western-blot检测细胞中Total-Akt和磷酸化的Akt (Ser-473)蛋白的表达结果发现,转染野生型PTEN细胞磷酸化的Akt蛋白表达明显减少,细胞中Akt蛋白的磷酸化水平受到抑制,负性调节了PI3K/PTP3/AKT转导通路；10、采用PI3K抑制剂LY294002作用于肝癌细胞系SMMC-7721细胞,发现,与转染野生型PTEN组相似,LY294002处理组细胞磷酸化的Akt蛋白表达明显减少,MTT检测和平板克隆实验结果表明应用了PI3K抑制剂LY294002处理后的细胞在接受X线照射后细胞的生长受到一定的抑制作用、可一定程度地提高SMMC-7721细胞的放射敏感性。其对SMMC-7721细胞的辐射增敏作用也同转染野生型PTEN组细胞相似：PI3K抑制剂LY294002处理后的细胞在接受X线照射后也产生了明显的G2/M期阻滞,细胞的凋亡率明显提高,LY294002处理的细胞在受到辐射作用后也出现了DNA修复延迟现象。进一步表明PTEN可能通过PI3K-Akt信号转导通路增强对肝癌细胞系SMMC-7721细胞的辐射敏感作用。结论：1、PTEN对肝癌细胞具有放疗增敏作用；2、PTEN可以使细胞发生G2/M期阻滞、提高受照细胞的凋亡率、延迟细胞的DNA双链断裂修复；3、PTEN可能通过PI3K-Akt信号转导通路增强对肝癌细胞的辐射敏感作用；4、以PTEN为治疗靶点,联合辐射诱导技术对原发性肝癌进行的实验尝试,可为原发性肝癌的放射治疗提供新的理论和实践视角,为肿瘤基因-放射治疗应用临床提供理论支持。
沈二栋[5]2013年在《甘氨双唑钠对非小细胞肺癌患者叁维适形放疗近远期疗效及安全性影响的Meta分析》文中认为目的本研究采用循证医学Meta分析方法,旨在探讨甘氨双唑钠(metronidazol amino acidiun natricum,CMNa)应用与非小细胞肺癌患者叁维适形治疗(three dimensional conformal radiotherapy,3D-CRT)放疗的疗效及安全性,以期为临床有效的使用放疗增敏剂提供科学依据。方法采用主题词结合自由词原则,电子检索国内中英文数据库收集相关文献,根据纳入标准筛选文献并提取数据,采用ReviewManager5.0软件进行Meta分析。组间差异采用优势比(odds ratio,OR)及其5%可信区间(95%confidence interval,95%CI)描述。结果本Meta分析共计纳入11项随机对照试验,包括759例NSCLC患者,其中3D-CRT联合CMNa组(CMNa组)400例,3D-CRT联合安慰剂组(安慰剂组)359例。文献汇总结果显示,3D-CRT联合CMNa组的临床有效率明显优于3D-CRT联合安慰剂组(OR=3.24,95%CI[2.32,4.53],P<0.001)；3D-CRT联合CMNa组患者的1年生存率(OR=1.48,95%CI[1.02,2.14],P=0.04)和2年生存率(OR=1.82,95%CI[1.12,2.97],P=0.02)亦优于3D-CRT联合安慰剂组；3D-CRT联合安慰剂组的放射性食管损伤发生率(OR=0.67,95%CI[0.46,0.98],P=0.04)、放射性肺损伤发生率(OR=0.51,95%CI[0.31,0.83],P=0.008)和骨髓抑制发生率(OR=0.51,95%CI[0.32,0.81],P=0.004)均高于3D-CRT联合CMNa组。结论3D-CRT联合CMNa治疗NSCLC患者的临床有效率、1年和2年生存率均优于3D-CRT联合安慰剂,而且CMNa能减轻非小细胞肺癌放射性损伤。CMNa疗效和安全性确切,适合临床推广使用。
汤继英[6]2008年在《As_2O_3对人宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用》文中提出目的:观察叁氧化二砷(As_2O_3)对人宫颈癌Hela细胞放射增敏的效应,探讨其对宫颈癌放射增敏作用的机制,为As_2O_3作为宫颈癌的放射增敏剂应用于临床提供实验依据。方法:MTT法测定人宫颈癌Hela细胞对As_2O_3药物的敏感性,计算细胞抑制率=(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%,实验重复叁遍,取平均值,结果以药物浓度为横坐标、以细胞抑制率为纵坐标,通过Excel软件绘制细胞生长抑制曲线,通过ID_(50)计算软件计算出药物作用48h后的半数致死剂量(ID_(50))。集落形成法观察20%ID_(50)的As_2O_3对Hela细胞的放射增敏作用,计数含50个细胞以上的集落数,求出细胞存活分数(细胞存活率),细胞存活率的计算方法为:处理组集落形成率/对照组集落形成率,实验重复叁遍,取平均值,结果以放射剂量为横坐标、以细胞存活率为纵坐标,采用“多靶单击模型”通过SPSS13.0软件拟合细胞存活曲线,计算放射增敏比(SER)。流式细胞仪测定细胞周期,分为空白对照组(空白组)、20%ID_(50)的As_2O_3组(单药组)、单纯放射组(单放组)、放射+20%ID_(50)的As_2O_3组(药放组),每个组设3个平行样本,于25 cm~2的培养瓶中接种1×10~5个细胞。收集各组处理后的细胞进行固定、染色,流式细胞仪检测细胞周期的分布,用Multicycle软件进行分析。免疫细胞化学法及western blotting法(按试剂盒说明书操作)检测空白组、单药组、单放组、药放组在药物作用后的p2l~(waf1/cip1)及Bcl-2两种蛋白表达变化情况。结果:1.As_2O_3对人宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用随药物浓度的增加而增强,48h时的半数致死剂量(ID_(50))值为10.86μmol/L。2.As_2O_3对人宫颈癌Hela细胞有放射增敏作用,药放组的细胞存活率低于单放组,其平均致死剂量(D_0)及准域剂量(D_0)均小于单放组(D_0:2.49 Gy vs 3.45 Gy,Dq:1.03 Gy vs 1.89 Gy),放射增敏比(SER)为1.39。3.空白组、单药组、单放组、药放组在药物作用48h后G_2/M期的细胞比例分别为12.45±1.88、18.91±1.65、18.42±2.29、31.07±6.66,统计分析表明单放及单药均能提高G_2/M期的细胞比例(P＜0.05,P=0.012,P=0.007),放射及As_2O_3药物联合则G_2/M期的细胞比例提高更显着(P＜0.01,P=0.000)。4.免疫细胞化学法及Western blot检测各组p2l~(waf1/eip1)及Bcl-2两种蛋白表达情况基本一致,结果表明可知放射及药物均能提高p2l~(waf1/cip1)的表达(P＜0.05),放射及As_2O_3药物联合则p2l~(waf1/cip1)表达更高(P＜0.01);放射及药物均能降低Bcl-2的表达(P＜0.05),放射及As_2O_3药物联合则Bcl-2表达更低(P＜0.01)。结论:1.As_2O_3对人宫颈癌Hela细胞具有放射增敏作用。2.As_2O_3对人宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用可能与其抑制Hela细胞的亚致死性损伤的修复、调整细胞周期的分布、上调p2l~(waf1/cip1蛋白及下调Bcl-2蛋白的表达有关。
张卓[7]2010年在《β-榄香烯乳放射增敏作用及其相关靶点基因筛选的研究》文中进行了进一步梳理肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一,放射治疗是中晚期肺癌治疗的重要手段。肿瘤细胞的放射敏感性是影响放疗疗效的重要原因。寻求高效低毒的放射增敏剂提高肿瘤细胞的放射敏感性,一直是人们努力追求的目标。研究发现一些放射增敏化合物虽然具有较好的放射增敏性,因其严重的毒副作用限制了在临床上的应用。近年来人们更多地关注中药的放射增敏研究。榄香烯是从姜科植物温郁金中提取的非细胞毒性抗肿瘤药物,毒副作用小,具有放射增敏效应。既往关于p-榄香烯对肿瘤细胞的放射增敏作用机制的研究,主要集中在细胞周期改变及凋亡方面,而对其是否影响DNA双链损伤修复相关基因表达及放射增敏相关靶点基因的筛选未见报道。本实验选用低细胞毒性的p-榄香烯乳联合照射,观察p-榄香烯乳对肺腺癌A549细胞放射增敏作用及其对细胞凋亡相关基因bcl-2、p53和DNA双链损伤修复相关基因Ku70、DNA-PKcs表达的影响。同时采用寡核苷酸基因表达谱芯片,检测p-榄香烯乳联合照射时A549细胞基因表达谱的变化,系统分析与细胞放射敏感性密切相关的功能基因,以进一步探讨p-榄香烯乳放射增敏的分子机制,为中药β-榄香烯作为放射增敏剂的临床应用提供理论依据。目的：1、实验选用低浓度的p-榄香烯乳作用于肺腺癌A549细胞,通过克隆形成实验研究其对A549细胞的体外放射增敏作用；通过流式细胞仪观察细胞周期及凋亡的变化,RT-PCR及Western blot法检测凋亡相关基因bcl-2、p53的表达。2、研究p-榄香烯乳联合照射对A549细胞DNA双链损伤修复基因DNA-PKcs、Ku70表达的影响,分析其与凋亡相关基因p53、bcl-2的表达的相关性,进一步探讨p-榄香烯乳放射增敏的分子机制。3、采用寡核苷酸微阵列芯片检测技术,全面检测p-榄香烯乳联合照射时A549细胞基因表达的变化,系统分析与细胞放射敏感性密切相关的功能基因及信号通路,以进一步探讨p-榄香烯乳放射增敏作用的分子靶点及相关分子机制,为中药放射增敏剂的临床应用提供理论依据。方法：第一部分：细胞克隆形成率、细胞周期及凋亡的检测1、取对数生长期的A549细胞进行MTT实验,检测β-榄香烯乳对A549细胞24 h的IC50值。2、选取10% IC50浓度的β-榄香烯乳(0.1×IC50)、20%IC50浓度的β-榄香烯乳(0.2×IC50)分别作用A549细胞24h后,克隆形成实验观察不同剂量照射后细胞存活分数,拟合细胞存活曲线,求得D0、Dq及SF2值,由D0、Dq值计算放射增敏比SERD0、SERDq。3、实验分为：①对照组(C)②单纯照射组(R)：4 Gy射线照射③0.1×IC50组：即给予10%IC50浓度的β-榄香烯乳④0.2×IC50组：即给予20%IC50浓度的β-榄香烯乳⑤0.1×IC50+R组：即10%IC50浓度的β-榄香烯乳作用细胞24 h后给予4 Gy照射⑥0.2×IC50+R组：即20%IC50浓度的β-榄香烯乳作用细胞24 h后给予4 Gy射线照射。细胞经上述处理后24 h,荧光显微镜下观察细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,RT-PCR及Western blot检测p53、bcl-2基因的表达量。第二部分：DNA双链损伤修复基因与凋亡基因的相关性检测实验分组同第一部分,A549细胞经相应处理,24 h后RT-PCR及Western blot检测Ku70、DNA-PKcs基因mRNA及蛋白的相对表达量,并分析0.1×IC50+R组Ku70、DNA-PKcs基因与p53、bcl-2基因表达的相关性。第叁部分：寡核苷酸基因芯片对放射增敏靶点基因的检测1、提取0.1×IC50+R组及单纯照射R组细胞总RNA,纯化mRNA, Chip-on-lab电泳及琼脂糖凝胶电泳检测纯度和完整性,逆转录mRNA合成cDNA探针,Cy5/Cy3标记,在含有30968个基因的人全基因组寡核苷酸芯片上杂交,扫描芯片荧光信号图像,图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析。2、选取芯片检测结果中明显上调及下调基因各一个进行RT-PCR验证,以确定芯片检测结果的可靠性。结果：第一部分1、细胞生长抑制作用不同浓度的β-榄香烯乳作用于A549细胞,对细胞增殖均有抑制作用,随着β-榄香烯乳浓度的逐渐增加,细胞抑制率逐渐增大。β-榄香烯乳作用A549细胞24h的IC50值为120μg/ml。2、放射增敏作用在相同β-榄香烯乳浓度下,随着照射剂量的增加,A549细胞存活分数逐渐减少。相同的照射剂量下,随着β-榄香烯乳浓度的增加,细胞存活分数逐渐降低。从细胞生存曲线,求得C组、0.1×IC50组、0.2×IC50组D0值分别为2.45±0.24Gy、1.64±0.15 Gy、1.55±0.13 Gy;Dq值分别为2.68±0.25 Gy、1.87±0.22 Gy、1.53±0.11 Gy,SF2值分别为84.6+20.9%、56.3±14.9%、43.2±10.7%。从细胞生存曲线可以看出,随β-榄香烯乳浓度的增加,细胞生存曲线向左侧移动,肩区变小,直线部分斜率增大,D0、Dq及SF2值逐渐减小。求得0.1×IC50组β-榄香烯乳的放射增敏比SERDo及SERDq的值为1.54±0.20、1.43±0.15；0.2×IC50组β-榄香烯乳的放射增敏比SERDo及SERDq的值为1.63±0.32、1.75±0.19,随着β-榄香烯乳浓度的增加,SER值逐渐增大。3、细胞周期：与对照组相比,R组、0.1×IC50组、0.2×IC50组A549细胞的G2/M期比率变化不明显(P>0.05)；与R组相比,0.1×IC50+R组及0.2×IC50+R组细胞的G2/M期比率明显增加(P<0.01)；且随着药物浓度的增加,细胞G2/M期比率逐渐增加。4细胞凋亡：与对照组相比,R组细胞凋亡率有所增加,但差别无统计学意义(P>0.05)；0.1×IC50组、0.2×IC50组A549细胞的凋亡率无明显变化(P>0.05)；与R组相比,0.1×IC50+R及0.2xIC50+R组细胞凋亡率明显增加(P<0.01),呈现特征性的亚二倍体峰(凋亡峰),且随着药物浓度的增加,凋亡率逐渐增多。荧光显微镜下可以看到0.1×IC50+R及0.2×IC50+R组细胞凋亡数目较R组明显增多。5、bcl-2表达：与对照组相比,R组、0.1×IC50组、0.2×IC50组A549细胞bcl-2mRNA相对表达量较对照组无明显变化(P>0.05)。0.1×IC50+R组、0.2×IC50+R组mRNA表达量较单纯照射组明显减少,差别有统计学意义(P<0.05)。Westernblot检测结果分析bcl-2蛋白表达呈现相同趋势。6、p53表达：与对照组相比,R组、0.1×IC50组、0.2×IC50组A549细胞p53 mRNA相对表达量较对照组无明显变化(P>0.05)。0.1×IC50+R组、0.2×IC50+R组p53mRNA表达量较单纯照射组明显增加,差别有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果分析p53蛋白表达呈现相同趋势。第二部分1、Ku70表达：与对照组相比,R组细胞Ku70 mRNA相对表达量较对照组略有升高(P>0.05)。0.1×IC50组、0.2×IC50组Ku70 mRNA相对表达量与对照组相比无明显变化(P>0.05)。0.1×IC50+R组、0.2×IC50+R组mRNA表达量较单纯照射组明显减少,差别有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果分析Ku70蛋白表达呈现相同趋势。2、DNA-PKcs表达：R组A549细胞DNA-PKcs mRNA相对表达量较对照组略有升高,但差别无统计学意义(P>0.05)。0.1×IC50组、0.2×IC50组mRNA相对表达量与对照组相比无明显变化(P>0.05)。但0.1×IC50+R组、0.2×IC50+R组mRNA表达量较单纯照射组明显减少,差别有统计学意义(P<0.05)。DNA-PKcs蛋白表达变化呈现相同趋势。3、DNA双链损伤修复基因与凋亡基因的关系：对0.1×IC5o+R组各基因mRNA表达量进行Spearman相关分析,结果如下：Ku70与p53、DNA-PKcs与p53表达呈显着负相关(rKu70-p53=-0.758,P=0.024；rDNA-PKcs-p53=-0.665,P=0.037)；Ku70与bcl-2、DNA-PKcs与bcl-2表达呈显着正相关(rKu70-bcl.2=0.847,P=0.013；r DNA-PKcs-bcl-2=0.861,P=0.010)。对各基因蛋白表达相关性分析,结果如下：Ku70与p53、DNA-PKcs与p53表达显着负相关(rKu70-p53=-0.692,P=0.033；rDNA-PKcs-p53=-0.569,P=0.040),Ku70与bcl-2、DNA-PKcs与bcl-2表达显着正相关(rKu70-bcl-2=0.847,P=0.008；rDNA-PKcs-bcl-2=0.755,P=0.012)。第叁部分1、Chip-on-lab电泳及琼脂糖凝胶电泳检测两组细胞RNA纯度和完整性良好。2、Cy5/Cy3荧光信号值构建的散点图显示两张芯片重复性系数R为0.95,接近于1,提示芯片重复性较好。3、共筛选出122条差异表达基因,其中89条基因显着表达上调,33条基因显着表达下调。这些差异表达基因主要参与DNA损伤与修复、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞增殖、信号转导与转录、细胞粘附、免疫反应等生物学过程。4、RT-PCR结果显示,在基因芯片中上调表达的Egr-1基因,0.1×IC50+R组mRNA表达量明显高于R组；基因芯片中下调表达的CyclinD1基因,0.1×IC5o+R组mRNA表达量明显低于R组。结论：第一部分：放射增敏疗效与细胞周期和凋亡的关系1、低浓度的β-榄香烯乳对A549细胞有放射增敏作用,10μg/ml和：20μg/mlβ-榄香烯乳的放射增敏比SERDo值为1.547和1.643；SERDq值分别为1.435和1.753。随着β-榄香烯乳浓度增加,放射增敏比逐渐增高,放射增敏作用逐渐增强。2、p-榄香烯乳联合照射可显着影响A549细胞周期分布,促使细胞G2/M期阻滞,诱导细胞凋亡。随着p-榄香烯乳浓度的增加,G2/M期细胞比率及凋亡率逐渐增加。诱导细胞G2/M期阻滞及凋亡是p-榄香烯乳放射增敏的作用机制之一。3、p-榄香烯乳联合照射可下调A549细胞bcl-2基因及上调p53基因表达,促进细胞凋亡。随着p-榄香烯乳浓度增加,促凋亡作用逐渐增强。第二部分：DNA双链损伤修复与凋亡基因的关系1、p-榄香烯乳联合照射可抑制DNA双链损伤修复基因Ku70、DNA-PKcs表达,使A549细胞放射敏感性增加。2、β-榄香烯乳联合照射组A549细胞DNA-PKcs、Ku70表达与p53表达呈显着负相关,与bcl-2表达显着正相关。3、β-榄香烯乳影响DNA双链损伤修复途径的同时,也影响细胞凋亡途径,两因素相互影响,共同作用,增强A549细胞放射敏感性。第叁部分：放射增敏作用靶点基因的筛选1、共有122条显着差异表达基因与p-榄香烯乳增加A549细胞放射敏感性与有关,这些差异表达基因主要参与DNA损伤与修复、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞增殖、信号转导与转录、细胞粘附、免疫反应等生物学过程。2、β-榄香烯乳对A549细胞放射增敏机制为复杂的、多基因协同作用的结果。
张妍[8]2009年在《RNA干扰Ku70基因对宫颈癌Hela细胞放射敏感性影响的实验研究》文中进行了进一步梳理宫颈癌的发病率、死亡率占妇科恶性肿瘤第一位。放射治疗是主要治疗手段之一。宫颈癌对放射治疗的敏感性直接影响其疗效与预后。放射线主要是通过导致DNA双链断裂(DNA double-strand break, DSB)起到杀死肿瘤细胞的作用。但细胞具有较高程度的DSB修复能力,修复方式有两种:以DNA依赖蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK,包括Ku80/ Ku70异二聚体和DNA-PK催化亚单位DNA-PKCs)为主的非同源性末端连接(DNA nonhomologous end-joining, NHEJ)和以ATM (ataxia-telangiectasia mutated)为主的同源重组(homologous recombination)修复。Ku蛋白能与DNA末端及DNA损伤导致的双链DNA断裂(DSBs)末端结合。Ku蛋白是重组修复系统中最重要的组成部分,在DSBs的同源性末端连接和非同源性末端连接修复途径中发挥重要作用,尤以NHEJ为着。Ku蛋白广泛存在于哺乳动物细胞内,最初在多肌炎硬皮病重迭综合征病人体内作为自身抗原被发现,它是由70kDa和80kDa两条多肽链组成,分别被称之为Ku70和Ku80。Ku70亚单位由609个氨基酸组成,分子量约69581Da,Ku80包括732个氨基酸,分子量约81914Da。两个亚单位都有类似亮氨酸拉链结构序列的亮氨酸或亮氨酸-色氨酸周期性重复,这种拉链结构被认为是DNA连接蛋白家族的标志,参与DNA转录调节。Ku异二聚体是参与DNA DSB修复中非同源末端连接途径(NHEJ)的关键酶DNA-PK的催化亚基,在DNA DSB修复和v(D)J重组中起关键作用,编码Ku异二聚体的Ku基因是人鼠同源基因。二聚体之一的Ku70与细胞的电离辐射敏感性、化学药物敏感性、某些肿瘤的发生与进展、细胞凋亡以及衰老均有关系。动物实验研究发现:Ku70蛋白在DSB修复、免疫球蛋白v(D)J重组、DNA复制、转录、热休克反应和端粒体末端精确结构调节等过程中均发挥重要作用。近年来对Ku70蛋白的基因结构和多种功能研究取得新进展,尤其是Ku70蛋白的活性与肿瘤的发生发展相关引起人们的极大关注。本研究采用RNA干扰(RNAi)技术抑制Hela细胞中Ku70蛋白的表达,观察Ku70蛋白表达下调对Hela细胞放射敏感性的影响。实验结果表明,宫颈癌Hela细胞对1.0~4.0Gyγ射线照射不够敏感,有相当高的辐射抗性。量效实验证实,1.0~6.0Gyγ射线照射后,HeLa细胞中Ku70 mRNA及Ku70蛋白表达均明显增高。时效实验证实,4.0Gyγ射线照射后8 h~72 h,HeLa细胞中Ku70 mRNA及Ku70蛋白表达均明显增高。本实验成功的构建了Ku70基因RNA干扰载体pSilencer-4.1-Ku70,稳定转染HeLa细胞后,有效抑制Ku70蛋白的表达。稳定转染pSilencer-4.1-Ku70干扰质粒并抑制Ku70蛋白表达后,HeLa细胞对γ射线照射的放射敏感性显著增高(P<0.001)。本文所得结果将为宫颈癌的基因治疗及放射治疗提供新的实验依据。具有重要的理论意义及潜在的应用价值。Ku70基因有望作为宫颈癌基因治疗的新靶点。
游浩[9]2011年在《ROS和DNA-PKcs/Akt信号通路在氢醌诱导K562细胞损伤和细胞凋亡中的作用》文中研究指明目前普遍认为,苯的代谢产物,而不是苯自身,介导了苯对造血细胞的多种生物学作用,产生骨髓毒性。苯的醌类代谢产物—氢醌暴露可诱导细胞损伤和细胞凋亡。近来研究表明,DNA-PKcs是一个重要的损伤修复基因,在DNA双链断裂的非同源末端连接(NHEJ)、V(D)J重组和维持端粒结构等方面起关键作用,参与转录及细胞凋亡等过程；同时,还参与肿瘤细胞的放疗和化疗耐受性。Akt在调节细胞生长、增值、凋亡、代谢和细胞迁移等方面发挥重要作用。但是,关于DNA-PKcs/Akt信号通路是否在氢醌诱导的K562细胞损伤和细胞凋亡中发挥作用,目前还没有报道。本研究将探讨DNA-PKcs/Akt及其下游信号通路在氢醌诱导的K562细胞损伤和细胞凋亡中的作用及其机制。第一部分ROS和DNA-PKcs/Akt信号通路在氢醌诱导K562细胞损伤和细胞凋亡中的作用目的：探讨ROS和DNA-PKcs/Akt信号通路的活化在氢醌诱导的人慢性白血病细胞(human chronic leukemia cells)K562损伤和细胞凋亡中的作用。方法：运用CCK-8法检测细胞增殖情况；利用AnnexinV-FITC/Propidium Iodine凋亡检测试剂盒,采用流式细胞仪检测氢醌(hydroquinone,HQ)诱导K562细胞凋亡情况；运用分子探针CM-H2DCFDA和DHE,利用流式细胞仪测定氢醌诱导K562细胞内ROS的产生情况；用免疫荧光法检测DNA-PKcs的蛋白表达；Real-time PCR检测DNA-PKcs和Aktl的mRNA表达；采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)方法测定DNA-PKcs、Akt和P-Akt (phospho-Akt Ser473)蛋白表达情况。结果：CCK-8法实验结果表明,氢醌对K562细胞的生长有很强的抑制作用,呈剂量-反应和时间-反应关系。流式细胞仪检测表明,在氢醌诱导的细胞损伤和凋亡中,0-50μM时,随着剂量的加大,ROS的产生和细胞凋亡率也增加,都存在剂量-反应关系；两者之间存在正相关关系；100μM时,ROS的产生下降,细胞凋亡率最高。将50gM氢醌处理K562细胞不同的时间(0、3、6、12和24h),0-12h时,随着作用时间的延长,DCF的荧光强度逐渐增加,存在时间-反应关系；处理24h时,ROS的产生明显减少。实时定量PCR和Western Blotting检测显示,0-100μM时,DNA-PKcs和Akt1的基因表达均随氢醌剂量的加大而增加,DNA-PKcs和P-Akt的蛋白表达也随氢醌剂量的加大而增加,都存在剂量-反应关系,然而,Akt的蛋白表达没有变化。结论：本研究结果显示,氢醌诱导ROS的产生和DNA-PKcs/Akt信号通路,与K562细胞损伤和凋亡有相关性。第二部分NU7026通过抑制DNA-PKcs/Akt信号通路增强氢醌诱导的K562细胞凋亡目的：探讨NU7026通过抑制DNA-PKcs/Akt信号通路,对氢醌诱导K562细胞凋亡的作用。方法：运用细胞直接计数法检测细胞增殖情况；利用AnnexinV-FITC/Propidium Iodine凋亡检测试剂盒,采用流式细胞仪检测氢醌(hydroquinone, HQ)诱导K562细胞凋亡情况；运用分子探针CM-H2DCFDA和DHE,利用流式细胞仪测定氢醌诱导K562细胞内ROS的产生情况；用免疫荧光法检测DNA-PKcs的蛋白表达；Real-timePCR检测DNA-PKcs和Akt的mRNA表达；采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)万法测定相关蛋白,包括信号通路中相关激酶DNA-PKcs、Akt、P-Akt(phospho-Akt Ser473)、Bax、Bcl-2和caspase3蛋白表达情况。结果：我们采用DNA-PKcs (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)特异的抑制剂NU7026与不同浓度(0、10、25、50和100μM)氢醌(Hydroquinone,HQ)共同处理K562细胞,研究氢醌导致细胞凋亡的作用,以及调控的信号通路。细胞直接计数实验证明,预先用NU7026孵育K562细胞1h,采用不同浓度氢醌(0、10、25、50和100μM)处理K562细胞24h后,NU7026对DNA-PKcs的抑制可显着增强氢醌对K562细胞的毒性作用,抑制细胞的活性,并存在剂量-反应关系。NU7026与不同浓度氢醌(0、25、50和100μM)共同处理K562细胞24h后,诱导细胞凋亡率增加。NU7026与氢醌联合作用,不影响活性氧的产生和氢醌的氧化应激,但导致DNA-PKcs基因水平和蛋白水平的表达下降。此外,氢醌增加Akt的磷酸化,使Akt活化；最后,它与NU7026联合作用阻止了Akt的活化,增加促凋亡蛋白Bax和caspase-3蛋白的表达,但降低抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达。该结果揭示了DNA-PKcs在氢醌血液毒性中的核心作用,它负责参与DNA双链断裂修复、细胞周期的进行和细胞凋亡的调节,以应对氢醌引起的K562细胞DNA损伤和细胞凋亡。结论：NU7026增强了氢醌诱导人慢性白血病细胞K562的细胞凋亡,通过抑制DNA-PKcs/Akt信号通路,导致其下游蛋白Bcl-2下调,以及Bax和caspase3上调。
参考文献：
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