张莉[1]2004年在《针刺对大鼠脑缺血再灌注后线粒体损伤相关因素影响的研究》文中研究指明脑对缺血极为敏感,脑缺血再灌注损伤后,机体主动或被动地作出广泛的反应,构成了脑缺血再灌注损伤复杂的病理机制。由于脑缺血后存在着缺血时相改变,为在治疗时间窗内研究针对性干预,改善大脑功能提供了理论依据。由于缺血半暗区理论提出,使脑缺血再灌注损伤机制研究重点定位于脑组织出现不可逆之前。脑缺血再灌注损伤后的基本病理改变脑水肿及细胞凋亡,是各种因素相互作用和相互联系的结果。虽然线粒体功能恢复在缺血再灌注细胞复苏中必不可少,但线粒体在脑损伤一系列瀑布反应中起着非常关键作用,围绕着线粒体介导的脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的主要事件,脑缺血再灌注损伤病理上发生了一系列时间和空间的错综级联反应。脑缺血时,线粒体氧化磷酸化不能有效进行,ATP 生成减少而水解增多,细胞由于能量不足发生功能障碍,随着缺血时间延长,线粒体功能和结构受损,ATP 耗竭,细胞功能进一步损害。再灌注时,线粒体产生大量自由基,同时线粒体钙转运紊乱,发生永久性通透性改变,胞浆钙急剧升高,在 Bcl-2 家族、半胱天冬酶、细胞色素 C 等凋亡相关因子的作用下,导致细胞凋亡发生。脑缺血再灌注损伤可以诱导神经细胞再生,有内源性 NSC 激活现象,脑功能可以发生重建。神经元再生有分布和移行规律。神经生长因子和神经特异性蛋白等和神经再生关系密切。在众多的细胞因子中,神经营养因子在神经再生中具有重要作用。靶源性神经营养因子通过自分泌、旁分泌方式,转输作用于相应神经细胞,只有那些获得足够神经营养因子的神经元能够成活,否则就会死亡。脑缺血属于中医学中的中风病范畴。针刺治疗中风在我国已有数千年的临床验证,早在《黄帝内经》、《甲乙经》及《针灸大全》中即有记载。由于时间治疗窗的提出,针刺疗法已经从对缺血性中风后遗症和恢复期的治疗转到了对其急性期的治疗研究;针刺治疗脑缺血再灌注损伤是多途径、多因素综合作用的结果。针刺对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究涉及面较广,从对大鼠神经功能行为缺损的干预、脑组织的病理形态学的改变、脑功能代谢和脑微循环的改善到缺血性神经元凋亡信号转导的影响等方面都有所及。对针刺机理的研究已经不是仅限于器官和系统水平的整体分析,对针刺效应的研究已经在微观水平层面上逐渐开展。虽然针灸的脑保护作用机制还未十分明确,但很可能是通过激发机体的潜能,启动包括内源性抗缺血损伤的能力在内的多种调控机制,共同发挥抗损伤的脑保护作用。这种脑保护作用也可能促进了内源性神经干细胞参与病损的修复。本研究利用线拴法闭塞大鼠大脑中动脉造成局灶性脑缺血再灌注模型和在体外培养海马神经元模拟脑缺血再灌注损伤模型,进行了下列主要研究工作:① 从脑损伤后起关键作用的线粒体改变入手,分别观察线粒体膜电势变化、细胞内钙变化,以及与其密切相关的能说明体内自由基产生和清除状况的脑组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)动态变化。② 从与抗脑损伤有相应关系的神经再生营养角度,观察局灶性脑缺血再灌注损伤后神经生长相关肽(GAP-43)表达和血清转化生长因子(TGF-β)含量变化和二者的相关关系。③ 电<WP=4>中文摘要 - 2 -针曲池、足叁里、百会穴对脑组织中 MDA、GSH 动态变化的影响。电针对海马部位 GAP-43表达和血清 TGF-β含量变化的影响。④ 将电针曲池、足叁里、百会穴的正常大鼠和局灶性脑缺血再灌注模型大鼠的血清,加入到海马神经元模拟脑缺血再灌注损伤模型的培养液中,观察针刺血清对线粒体膜电势及细胞内钙的变化的影响。 本研究共分 4 部分进行: 1. 脑缺血再灌注损伤后行为学和病理形态学变化及针刺的影响:神经功能缺损是 MCAO大鼠重要表现体征。用单盲法在 MCAO 大鼠脑缺血再灌注后的 6h、24h、48h、72h 不用时间点内,对大鼠的相关行为表现进行评分。发现用大鼠神经功能评分方法结合 TTC 染色和 HE染色方法,可以作为大鼠局灶性脑缺血再灌注模型检测的方法之一。电针可以降低神经行为等级评分,说明电针能有效改变大鼠神经功能缺损。 2. 脑缺血再灌注损伤后 MDA 和 GSH 动态变化及针刺的影响:在脑缺血再灌注时自由基产生增加,自由基清除系统的功能低下导致脂质过氧化作用增强。自由基可以过度消耗抗氧化酶 GSH,并生成大量的脂质过氧化物代谢终产物丙二醛(MDA),介导神经元不可逆损伤。在 MCAO 大鼠脑缺血再灌注后的 6h、24h、48h、72h 不用时间点内,发现大鼠再灌注后,脑组织的 MDA 含量明显增加,24h 以后升高明显;GSH 的活性显着下降,在脑缺血再灌注6h 时最低。针刺有助于降低 MDA 水平和提高 GSH 活性,尤其对再灌注较长时相组作用明显。针刺可以降低 MDA 水平和提高 GSH 活性,因而说明抑制自由基生成、整合内源性抗氧化系统,促进自由基清除、抗脂质过氧化。 3. 脑缺血再灌注损伤后 GAP-43 和 TGF-β表达及针刺的影响:GAP-43 是神经元发育和可塑性的分子标志物。TGF-β可以作为脑损伤的标记。在用免疫组织化学染色和 ELISA 方法观察 MCAO 大鼠造模后 72h,损伤脑组织的生长相关蛋白 GAP-43、血清转移生长因子 TGF-?
张家堂[2]2001年在《细胞周期因子在脑缺血后神经细胞凋亡中的作用》文中认为目的： 1．观察细胞周期蛋白(cyclin)D1和细胞周期蛋白依赖蛋白激酶(cdk4) 蛋白在缺血后神经细胞的表达及与神经细胞凋亡的关系，以及丹参和 Flavopiridol对其的影响，观察Flavopiridol的剂量和作用的关系。 2．观察 CyClin D1 mRNA在缺血后神经细胞的表达及丹参的影响。 3．观察 cyclin G1在神经细胞缺血后的表达变化与缺血神经细胞凋亡的关 系，并观察丹参对其的影响。 方法： 1．二级健康雄性体重180-220g的Spfague-Dawley大鼠 315只，随机分为对 照组(假手术组)、缺血组(单纯缺血组)、丹参组(缺血+丹参组)、FH 组(缺血+高剂量 Flavopiridol组)和FL组(缺血+低剂量 Flavopiridol组)， 并设空白对照组。按不同的组别需要在大鼠缺血后30min、1h、3h、6h、 12h、24h、48h、72h和7d等时间点取脑液氮保存。 2．采用线栓法大鼠大脑中动脉持续缺血模型。丹参组用药：缺血前30min 和缺血后 24h、48h腹腔注射丹参，用量为 10g/kg体重；Flavopiridol用 药：缺血前30min和缺血后24h、48h侧脑室缓慢给药，FH组用量为2 ×10~(-4)mmol/kg体重；FL组用量为 1×10~(-4)mmol/kg体重。 3．应用兔疫组化和 TUNEL凋亡染色方法，通过相邻冰冻切片观察 cyclin DI、cvclin G1和 cdk4在缺血神经细胞的表达情况以及神经细胞凋亡情 况。 4．应用 RT-PCR技术，观察神经细胞缺血后 cyclin D1 mRNA表达情况。 结果： 1．cyclin D1和cdk4分别在缺血后6h和 12h开始表达，均在缺血后48h达 中文摘要 第3页共129页 高峰，以缺血半暗带为主要表达区域，核染为主。凋亡细胞在缺血后 12h 开始明显增加，缺血后 72h达高峰。与 cyclin DI和 cdk4表达区域基本 相同。丹参组 CyClin DI和 Gdk4蛋白异常表达明显减少的同时，神经细 胞凋亡也明显减少；FL组和 FH组的 CyClill及 Cdk4蛋白异常表达均 明显减少，FL组各干预点神经细胞凋亡均明显减少，FH组只有缺血24h 明显减少了神经细胞的凋亡。 2．缺血后6h开始出现cvclin DI mRNA水平增加，缺血后72h达高峰；丹 参组在除缺血后 6h外的各干预时间点均明显减低了 cyclin DI mRNA的 表达量。 3．缺血后 lh开始，cyClin GI蛋白表达开始增加，缺血后3h达到高峰，自 缺血后 12h开始缓慢下降，缺血后 72h基本恢复到空白对照组的水平。 丹参于预后，缺血后6h、12h和24h时间点可见Cyclin GI阳性细胞数量 增加，仅12h时间点的增加有统计学意义。 结论： L Cyclin DI和cdk4在缺血后神经细胞的异常表达可能是缺血神经细胞凋亡 的启动或者促进因子；丹参可能通过抑制了 CyClin DI和 Cdk4在缺血后 神经细胞的异常表达而减轻了缺血神经细胞的凋亡；Flavopiridol作为细 胞周期阻断剂，可以通过阻断 cyclin DI和 cdk4的异常表达，从而抑制 缺血神经细胞的凋亡，但Flavopiridol本身也可以引起正常的神经细胞凋 亡。 2．cyClin GI在神经细胞缺血后表达增加，可能与神经细胞凋亡无关，而与 神经细胞缺血自我保护适应性和损伤修复有关。丹参可以通过增加 cyclin GI的表达，而发挥其对神经细胞的保护作用。
张睿[3]2017年在《Cdk5通路在脑缺血再灌注损伤中的作用及神经调节素1β抗凋亡机制研究》文中研究指明目的:在前期研究工作基础上,研究大鼠脑缺血2h再灌注22h后,Cdk5信号通路的表达情况;探讨NRG1β对Cdk5通路的影响、能否通过Cdk5通路抑制神经细胞凋亡,及其具体作用机制和关键环节,为将来应用NRG1β防治缺血性脑血管病提供理论依据。方法:(1)成年健康雄性Wistar大鼠360只,应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立大脑中动脉缺血再灌注(MCAO/R)模型,随机数字表法将大鼠分为假手术(Sham)组55只、模型(MCAO/R)组、治疗(NRG1β)组、抑制剂+治疗(Ros+NRG1β)组和抑制剂(Ros)组,每组动物55只。(2)Sham组线栓不入颅、不建立MCAO模型,2h后经ECA残端向ICA内注射0.1mol/L PBS 5μl;MCAO/R组建立MCAO/R模型后2h拔除线栓,同步经ECA残端向ICA内注射0.1mol/L PBS 5μl;NRG1β组动物缺血2h后拔除线栓,同时经ECA残端向ICA内微量注射8%NRG1β5μl(2μg/kg);Ros+NRG1β组在插线前经ECA残端向ICA注射Roscovine 5μl,缺血2h后拔除线栓实现再灌注,同时给予8%NRG1β5μl;Ros组注射Roscovine同Ros+NRG1β组,但缺血2h后拔除线栓时同步给予0.1mol/l PBS 5μl。(3)治疗后(或再灌注后)22h应用改良神经功能缺损评分(m NSS评分)测试动物神经功能,干湿重法测量大鼠脑组织含水量,氯化叁苯基四氮唑(TTC)染色测量脑梗死体积,HE染色和甲苯胺蓝(Nissl)染色观察神经细胞形态结构,透射电镜(TEM)观察神经元超微结构,原位TUNEL法和流式细胞学技术(FCM)检测细胞凋亡,免疫组化(IHC)和Western Blot检测Calpain1、p35/p25、Cdk5、p-Tau蛋白在神经元内的定位定量表达。结果:(1)NRG1β对大鼠神经行为功能的影响:Sham组无神经行为功能缺损表现,m NSS评分0分;MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组大鼠存在不同程度神经行为功能缺损的表现,m NSS评分较Sham组显着升高(P<0.05),NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组大鼠神经行为功能缺损较MCAO/R组均有改善,m NSS评分较MCAO/R组有不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05);Ros+NRG1β组大鼠m NSS评分最低,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)NRG1β对大鼠脑组织含水量的影响:MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组大鼠脑组织含水量显着高于Sham组(P<0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组含水量较MCAO/R组均有下降(P<0.05);NRG1β组与Ros组比较脑组织含水量无明显差异(P>0.05);Ros+NRG1β组较MCAO/R组、NRG1β组、Ros组脑组织含水量显着降低(P<0.05)。(3)NRG1β对大鼠脑梗死体积的影响:Sham组未见脑梗死病灶;MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组与Sham组相比,脑梗死体积不同程度地增大,差异显着(P<0.05);MCAO/R组梗死体积较NRG1β组、Ros组及Ros+NRG1β组均明显增大,差异有统计学意义(P<0.05);NRG1β组与Ros+NRG1β组脑梗死体积较Ros组显着减小(P<0.05),而Ros+NRG1β组脑梗死体积最小,与其他各组比较均有显着性差异(P<0.05)。(4)NRG1β对神经细胞形态结构的影响:HE染色和Nissl染色均显示:Sham组形态结构正常、未见明显变性坏死的神经元细胞,变性细胞指数(DCI)低;MCAO/R组、NRG1β组、Ros组、Ros+NRG1β组与Sham组相比,DCI明显升高,出现不同程度的神经元细胞损伤情况,如细胞排列紊乱、固缩、胞膜破裂,胞核消失,空泡样变等,差异有统计学意义(P<0.05);NRG1β组、Ros组、Ros+NRG1β组DCI较MCAO/R组有不同程度地下降,其形态结构、神经元细胞损伤介于Sham组与MCAO/R组之间,差异有显着性(P<0.05);Ros+NRG1β组较NRG1β组、Ros组DCI均有下降,变性坏死的神经元细胞更为减少,细胞损伤程度减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)NRG1β对神经元超微结构的影响:Sham组神经元超微结构正常,细胞核大而圆、染色质分布均匀,细胞器丰富,细胞膜、核膜完整,神经元轴突正常、微管正常,偶见凋亡的神经细胞;MCAO/R组与Sham组相比,神经元损伤严重,细胞固缩,细胞器数量明显降低甚至消失、空泡变性,形成凋亡小体、神经细胞凋亡显着;NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组神经元损伤介于Sham组和MCAO/R组之间;NRG1β组与Ros组神经元超微结构接近;Ros+NRG1β组损伤更轻、神经细胞凋亡较NRG1β组及Ros组亦有改善,部分出现空泡,细胞结构较正常完整、边缘清楚,细胞器损伤亦减轻,细胞连接较紧密。(6)NRG1β对细胞凋亡的影响:(1)TUNEL法显示:Sham组顶叶皮层神经元细胞浅染为淡蓝色,绝大部分细胞结构完整、排列整齐,胞膜光滑,胞浆丰富,细胞核清晰可见,细胞间质无水肿等;偶见细胞凋亡;MCAO/R组可见大量神经细胞凋亡,细胞排列紊乱、固缩、胞膜皱缩、细胞质被染成棕色,胞核被染成褐色或棕褐色,或固缩、碎裂,甚至崩解、形成空泡;NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组神经元细胞形态改善、排列较为整齐,结构相对完整,部分神经细胞核固缩、碎裂、形成空泡;Ros+NRG1β组,较NRG1β组、Ros组明显改善,变性坏死神经元减少。(2)FCM法与TUNEL法均显示:MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组与Sham组相比,早期凋亡细胞指数(EACI)、凋亡细胞指数(ACI)均显着升高(P<0.05)。Ros+NRG1β组、NRG1β组、Ros组与MCAO/R组相比,EACI、ACI不同水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。Ros+NRG1β组与NRG1β组、Ros组比较,EACI、ACI均有下降,差异有显着性(P<0.05)。(7)NRG1β对蛋白定位表达的影响:IHC染色显示:(1)Calpain 1:MCAO/R组较Sham组,阳性细胞数指数(PCI)显着升高(P<0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组,PCI较MCAO/R组明显降低(P<0.05),而两两比较无统计学意义(P>0.05);Ros组Calpain 1表达较MCAO/R组无显着性差异(P>0.05),与NRG1β组、Ros+NRG1β组差异明显(P<0.05)。(2)Cdk5:与Sham组比较,MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组PCI明显升高,差异有显着性(P<0.05);而MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组PCI之间两两比较,差异无显着性(P>0.05)。(3)p35/p25:MCAO/R组、Ros组p35/p25表达较Sham组明显增强,PCI显着升高,(P<0.05),但两两比较无显着差异(P>0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组p35/p25表达较MCAO/R组、Ros组明显减少(P<0.05),而NRG1β组与Ros+NRG1β组比较无统计学意义(P>0.05)。(4)p-Tau:MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组,与Sham组比较,蛋白表达明显增加,PCI显着升高(P<0.05);NRG1β组、Ros组、Ros+NRG1β组,PCI较MCAO/R组不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05);Ros+NRG1β组,与NRG1β组和Ros组比较PCI降低,差异显着(P<0.05);与Ros组比较,NRG1β组p-Tau表达较低,PCI下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(8)NRG1β对蛋白定量表达的影响:Western blot显示:(1)Calpain 1:MCAO/R组较Sham组,Calpain 1相对蛋白含量明显增加(P<0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组,相对蛋白含量较MCAO/R组明显降低(P<0.05),而其两两比较无统计学意义(P>0.05);Ros组Calpain 1表达较MCAO/R组无显着性差异(P>0.05),与NRG1β组、Ros+NRG1β组比较则均有统计学意义(P<0.05)。(2)Cdk5:与Sham组比较,MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组Cdk5相对蛋白含量明显升高(P<0.05);而MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组间两两比较,差异无显着性(P>0.05)。(3)p35/p25:MCAO/R组、Ros组较Sham组p35/p25蛋白表达明显增加,相对蛋白含量均显着升高(P<0.05),但MCAO/R组与Ros组蛋白表达无差异(P>0.05);NRG1β组、Ros+NRG1β组蛋白表达较MCAO/R组、Ros组明显减少(P<0.05),而NRG1β组与Ros+NRG1β组蛋白相对含量比较无统计学意义(P>0.05)。(4)p-Tau:MCAO/R组、NRG1β组、Ros+NRG1β组、Ros组,与Sham组比较p-Tau蛋白表达明显增加、相对蛋白含量显着升高(P<0.05);NRG1β组、Ros组、Ros+NRG1β组,p-Tau表达较MCAO/R组不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05);Ros+NRG1β组p-Tau相对蛋白含量最低,与NRG1β组和Ros组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);与Ros组比较,NRG1β组p-Tau蛋白表达较低,相对蛋白含量少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:脑缺血再灌注损伤发生后,Cdk5通路过度激活,导致神经元细胞凋亡;其特异性抑制剂Roscovitine可以阻断Cdk5通路诱导凋亡的作用,有利于脑缺血再灌注损伤后神经功能恢复。神经调节素1β可以抑制Cdk5通路中Calpain1、p35/p25、p-Tau的表达,减少神经元凋亡,缩小脑梗死体积,改善神经行为功能,在脑缺血再灌注损伤后发挥神经保护作用。
赵燕玲[4]2006年在《益气活血复方芪丹通脉片对脑缺血再灌注损伤的保护作用及拆方研究》文中认为目的： 缺血性脑血管病是临床常见病，具有致残率高、死亡率高的特点，近年来该病的发病率有升高的趋势。随着溶栓疗法的应用，再灌注损伤的问题越来越受到重视。研究表明，脑缺血再灌注损伤与神经细胞凋亡、炎症反应、钙超载、氧自由基的产生、兴奋性氨基酸的毒性作用等密切相关。脑缺血再灌注损伤的防治成为广大学者普遍关注的问题。中医学认为，缺血性脑血管病属“中风”、“卒中”、“偏枯”范畴，主要病机为气虚血瘀，临床多采用益气活血为主要治则。芪丹通脉片由黄芪、丹参、红花、当归、桂枝组成，具有益气活血、温通经脉功效，临床治疗缺血性中风，疗效颇佳。本实验应用脑缺血再灌注大鼠模型，探讨芪丹通脉片对脑缺血再灌注损伤的影响及分子机制，为其治疗缺血性脑卒中提供实验依据。同时中药复方的组方原理具有深刻的科学内涵，拆方是研究中药复方组方原理的重要手段之一。因此本实验还拟通过比较芪丹通脉片及拆方(益气组、活血组)对脑缺血再灌注的影响，探讨该方的组方原理。 方法： 线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型。研究内容共分叁部分。(1)芪丹通脉片对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究：健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型
朱晓瓞[5]2016年在《NF-κB信号通路在小鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用及机制》文中认为目的:初探核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号传导通路对小鼠脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)后发生细胞凋亡的作用及机制。方法:通过无创微动脉夹夹闭小鼠双侧颈总动脉建立小鼠脑缺血再灌注损伤动物模型。根据缺血后再灌注时间的不同,将各模型组分为3h、6h、12h、1d、3d、7d、14d、21d,共8组。TTC染色确定脑缺血损伤区域;HE染色观察细胞形态变化;Nissl染色观察神经元功能改变;免疫组织化学染色SV法检测NF-κB p65/RelA表达变化;TUNEL法检测脑缺血再灌注过程中不同时间节点缺血区细胞凋亡数量;通过原位杂交法和western blotting检测各时间节点损伤区域NF-κB信号通路的靶基因/蛋白Bcl-2和C-myc mRNA及蛋白表达的变化情况;运用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)特异性抑制NF-κB信号通路后,采用TUNEL检测法和原位杂交检测建模后1d、7d、14d各组与相对应时间点模型组比较,神经细胞凋亡数和Bcl-2 mRNA、C-myc mRNA变化情况。结果:TTC染色:各模型组在海马所在脑冠状层面出现不同程度苍白缺血灶,且以缺血再灌注后7d最为明显。HE染色:假手术组海马CA3区神经细胞形态及排列情况与正常组相比无明显差异;CIRI后各模型组在该区域可出现神经细胞肿胀(3h)、胶质细胞增生和炎性细胞增多(6h)、胞内空泡(12h)、组织水肿(1d出现,7d明显)、细胞排列疏松紊乱(14d)、胞核变形、核固缩(21d)等病理形态改变。Nissl染色:随病程的进展,出现有细胞肿胀(3h)、尼氏小体数量减少或消失(12h出现尼氏小体减少,随后逐渐加重,21d部分神经元尼氏小体消失)、组织水肿(1d出现,7d严重)、神经元变性坏死成空泡状(21d)等病理变化。免疫组化:正常组及假手术组低表达NF-κB p65/RelA;3h出现NF-κB p65/RelA表达增高,并在随后的7d内均逐渐增高至峰值,且第3d起可观察到NF-κB p65/RelA移位入核增加;14d及21d时,胞质及胞核内NF-κB p65/RelA表达量逐渐下降,但仍高于正常组及假手术组,差异具有统计学意义(P<0.05)。应用PDTC后,不同时间点海马CA3区内神经细胞胞核内的阳性表达明显减少,且平均光密度值与同时间点的模型组相比均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。TUNEL检测法、原位杂交及western blotting结果显示:各模型组海马CA3区凋亡细胞数量、NF-κB p65/RelA蛋白表达量、Bcl-2 mRNA和C-myc mRNA阳性细胞数量及二者蛋白表达量较正常组、假手术组增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。PDTC抑制NF-κB信号通路后,各抑制组与对应时间点模型组相比,Bcl-2 mRNA阳性细胞数减少[1d:(43.10±3.712)<(76.05±2.964);7d:(64.05±4.807)<(79.90±3.508);14d:(42.00±3.309)<(70.00±4.496)],TUNEL阳性细胞数[1d:(46.20±3.205)>(29.90±2.292);7d:(103.95±3.348)>(65.50±3.411);14d:(116.10±3.093)>(45.55±1.959)]和C-myc mRNA阳性细胞数[1d:(109.00±7.609)>(101.40±8.287);7d:(126.45±9.572)>(109.25±6.206);14d:(98.00±5.058)>(89.20±5.836)]增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:通过夹闭双侧颈总动脉能够成功复制小鼠脑缺血再灌注损伤动物模型;NF-κB细胞信号通路参与了小鼠脑缺血再灌注损伤的病理过程;CIRI发生后的早期(3h)即出现有凋亡细胞数的增加,并在其后较长一段时间(21d)内细胞凋亡过程仍存在着持续性的进展;NF-κB信号通路在CIRI病程进展中对神经细胞凋亡起抑制作用,其机制可能通过Bcl-2诱导和C-myc抑制共同发挥调节作用。
汪芸[6]2009年在《缺糖缺氧/复糖复氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究》文中进行了进一步梳理缺血性脑血管病具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点,造成了严重的社会问题和经济负担。因此,深入认识其发病机制,寻找新的治疗靶点是目前亟待解决的问题。缺血性脑血管病的直接原因是脑血流减少,导致氧和能量供应中断,细胞死亡。治疗后脑血流恢复,但往往出现神经系统损伤加重的情况,即缺血再灌注损伤。中医理论认为中风病(这里主要指缺血性脑血管病)的病因与风、火、痰、瘀等毒邪损伤脑络有关。传统中药丹参具有活血化瘀的功效,已广泛应用于缺血性脑血管病的临床治疗。丹酚酸B(Salvianolic acid B)是从传统中药丹参中提取的水溶性有效成分,由3分子丹参素和1分子咖啡酸缩合而成的酚酸类化合物,具有很强的抗氧化、清除自由基作用,但其在脑缺血再灌注损伤过程中的作用机制还不完全清楚。本论文以中医中风病理论为指导,在我们实验室已证明丹酚酸B对小鼠脑缺血性损伤具有治疗作用的基础上,采用原代培养大鼠皮层神经细胞,建立缺糖缺氧/复糖复氧的细胞模型,从兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、细胞凋亡的角度研究神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用的机制。论文的实验研究包括四个部分:一、缺糖缺氧模型的建立及丹酚酸B有效剂量的确定目的:建立稳定可靠的缺糖缺氧模型,并确定丹酚酸B的有效剂量。方法:体外培养大鼠大脑皮层神经细胞,复制神经细胞缺糖缺氧2h、3h、4h、5h的细胞模型,测氧仪测量培养液中溶解氧浓度,采用MTT法检测细胞活性和存活率。结果:体外培养的神经细胞状态稳定,经免疫组化神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定阳性细胞比例达70～80%,神经细胞Nissl's染色显示Nissl's小体丰富。随缺糖缺氧时间延长,培养液中溶解氧浓度逐渐降低,神经细胞活性、存活率也随之下降,各时间点与正常组比较均有显着性差异(P＜0.01)。选择对细胞损伤较重的缺糖缺氧4 h作为模型时间。神经细胞缺氧缺糖4 h后活性明显下降,与正常组比较有显着性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组包括10μg/L,100μg/L,1mg/L,5 mg/L,7.5 mg/L,10 mg/L,25 mg/L和50 mg/L共8个不同剂量,其中10、25、50 mg/L 3个剂量的丹酚酸B明显增强神经细胞活性,且存在量效关系,与缺糖缺氧4 h组相比差异明显(P＜0.01)。将10、25、50 mg/L3个剂量的丹酚酸B加入正常神经细胞,其活性与正常组之间没有显着性差异。选择终浓度10 mg/L作为以下实验丹酚酸B的用药剂量。二、缺糖缺氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究目的:探讨缺糖缺氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用的机制。方法:将培养的神经细胞随机分为正常组、缺糖缺氧4 h组和丹酚酸B治疗组。复制缺糖缺氧4 h的病理模型,MTT法观察神经细胞活性和存活率,比色法检测LDH漏出率和培养液中谷氨酸含量,流式细胞术测定神经细胞线粒体膜电位(MMP)、胞浆内Ca~(2+),倒置相差显微镜、HE染色及透射电镜观察神经细胞形态和超微结构的变化。结果:神经细胞缺糖缺氧4 h后活性、存活率、MMP荧光值明显降低,LDH漏出率、培养液中谷氨酸含量及胞浆内Ca~(2+)荧光强度显着升高,与正常组比较有显着性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组神经细胞活性、存活率、MMP荧光值均增高,LDH漏出率、培养液中谷氨酸含量、胞浆内Ca~(2+)荧光强度下降,与缺糖缺氧4 h组比较有显着性差异(P＜0.05～0.01)。正常组神经细胞胞体呈锥体形,细胞器丰富:缺糖缺氧4 h组大部分神经细胞肿胀,细胞器数目有所减少,可见线粒体肿胀明显;丹酚酸B治疗组神经细胞轻度肿胀,细胞器结构尚完整。叁、复糖复氧对神经细胞损伤及丹酚酸B干预作用机制的研究目的:研究复糖复氧对神经细胞的氧化损伤,并在体外模型中证实丹酚酸B的干预作用与其抗氧化能力有关。方法:神经细胞随机分为正常组、复糖复氧组和丹酚酸B治疗组。MTT法检测缺糖缺氧3h/复糖复氧1h、3h、6h、12h、18h、24h共6个时间点神经细胞活性、存活率。缺糖缺氧3h/复糖复氧3h、24h分别代表再灌注早期、晚期,并采用比色法观察神经细胞LDH漏出率,荧光标记和自旋捕集技术检测细胞内ROS水平,比色法测定神经细胞内Mn-SOD、CAT和GSH-PX的活性。倒置相差显微镜观察神经细胞形态变化。结果:缺糖缺氧3h后复糖复氧1h、3h、6h、12h、18h、24h,神经细胞活性、存活率均较正常组降低(P＜0.05～0.01);除复糖复氧1h、12h外,其他时间点丹酚酸B治疗组神经细胞活性、存活率均高于复糖复氧组(P＜0.05)。神经细胞复糖复氧3h、24h后,LDH漏出率、细胞内ROS均明显高于正常组(P＜0.05～0.01);而丹酚酸B治疗组神经细胞LDH漏出率、细胞内ROS则低于复糖复氧组(P＜0.05～0.01)。复糖复氧3h、24h神经细胞内Mn-SOD、CAT、GSH-PX的活性均降低,与正常组比较差异明显(P＜0.05～0.01),丹酚酸B治疗组神经细胞内抗氧化酶的活性明显高于复糖复氧3h、24h组(P＜0.05～0.01)。正常组神经细胞胞体饱满,突起粗大伸展;复糖复氧3h后神经细胞形态发生改变,至24h神经细胞皱缩,部分细胞死亡;丹酚酸B治疗组神经细胞形态变化有所减轻。四、复糖复氧诱导神经细胞凋亡及丹酚酸B抗凋亡作用机制的研究目的:探讨复糖复氧诱导神经细胞凋亡及丹酚酸B抗凋亡作用的机制。方法:神经细胞随机分为正常组、复糖复氧24h组和丹酚酸B治疗组。复制缺糖缺氧3h/复糖复氧24h的细胞模型。激光扫描共聚焦显微镜测定胞浆内Ca~(2+)荧光强度,流式细胞仪检测MMP、细胞凋亡率,免疫组化法观察细胞内Bcl-2、Bax的表达水平,Western blot测定细胞色素C释放率,Hoechst 33342染色观察细胞核形态变化,透射电镜观察神经细胞超微结构。结果:缺糖缺氧3h/复糖复氧24h引起胞浆内Ca~(2+)荧光强度明显增高,MMP荧光值降低,神经细胞凋亡率明显增高,与正常组相比有显着性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组胞浆内Ca~(2+)荧光强度降低,MMP荧光值增强,凋亡率下降,与复糖复氧24h组相比亦有显着性差异(P＜0.01)。神经细胞复糖复氧24h,Bcl-2表达减弱,Bax表达升高,与正常组相比有显着性差异(P＜0.01)。丹酚酸B治疗组Bcl-2表达增加,Bax表达降低,与复糖复氧24h组比较差异明显(P＜0.05)。正常组胞浆内细胞色素C含量很低,主要集中于线粒体,复糖复氧24 h后胞浆内细胞色素C含量明显升高,其灰度值与正常组相比有显着性差异(P＜0.01),丹酚酸B治疗组胞浆内细胞色素C含量低于复糖复氧24 h组(P＜0.05)。复糖复氧24 h组细胞色素C释放率明显高于正常组(P＜0.01),丹酚酸B治疗组细胞色素C释放率明显降低,两组相比差异明显(P＜0.05)。正常神经细胞经Hoechst33342荧光染色,核呈均匀的蓝色荧光;复糖复氧24 h组则有较多细胞核呈凝聚固缩,荧光明显增强,并有核碎裂;丹酚酸B治疗组细胞核大部分呈淡蓝色或蓝色荧光,接近正常组,仅见个别细胞核浓染呈明亮蓝色荧光。透射电镜观察复糖复氧24 h组神经细胞核染色质凝聚,细胞膜完整,符合凋亡的形态改变;丹酚酸B治疗组神经细胞超微结构变化较复糖复氧24 h组有所减轻。结论:本研究建立了稳定可靠的神经细胞原代培养体系,复制的细胞模型可以实现体外神经细胞缺糖缺氧损伤。缺糖缺氧4 h引起神经细胞培养液中谷氨酸含量增加、细胞内Ca~(2+)超载、MMP下降。丹酚酸B通过减少培养液中的谷氨酸含量,抑制神经细胞内Ca~(2+)超载,稳定MMP,从而对缺糖缺氧神经细胞起到保护作用。缺糖缺氧3 h/复糖复氧3 h、24 h对神经细胞的损伤与氧化应激有关,丹酚酸B可以清除细胞内ROS,提高抗氧化酶Mn-SOD、CAT、GSH-PX的活性,从而对复糖复氧神经细胞起到保护作用。缺糖缺氧3h/复糖复氧24 h可诱导神经细胞发生凋亡,丹酚酸B通过保护线粒体功能,提高Bcl-2的表达,降低Bax的表达,减少促凋亡物质的释放,起到抗凋亡作用。综上所述,神经细胞缺糖缺氧损伤的机制与兴奋性毒性、细胞内Ca~(2+)超载有关,而复糖复氧损伤的机制则涉及到氧化应激、线粒体途径的细胞凋亡。丹酚酸B通过减轻兴奋性毒作用,抑制神经细胞内Ca~(2+)超载保护缺糖缺氧的神经细胞,通过改善细胞的氧化-还原状态,保护线粒体功能,拮抗凋亡,对复糖复氧神经细胞起到保护作用。
佚名[7]2008年在《神经发育、损伤和再生》文中提出1.离体培养人神经干细胞中NMDA受体亚单位NR1、NR2A和NR2B的表达胡忠浩王姗姗徐铁军徐州医学院解剖学和神经生物学教研室徐州221002 NR1、NR2A和NR2B是组成海马神经元NMDA受体的主要亚单位,但在早期培养的人胚脑神经干细胞(Human neural stem cells,hNSCs)中是否有NR1、NR2A和NR2B的表达目前尚不清楚。本实验从正常流产孕10～12周的人胚胎脑海马区分离培养hNSCs,血清诱导分化后,用Nestin、β-ⅢTubulin、GFAP免疫细胞化学反应鉴
李雪[8]2014年在《芒果苷对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中研究表明研究背景和目的脑血管疾病是世界最常见的疾病之一,因其发病率高、致残率高、死亡率高的特点,严重威胁人类生命与健康。缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease, ICVD)指供应大脑血流的主要动脉发生狭窄或闭塞,结果导致脑组织(特别是大脑中动脉区域)急剧缺血缺氧,最终引起局部脑组织发生缺血或坏死,出现相应的临床症状。缺血性脑卒中后可通过溶解血栓或机械再通的方式恢复缺血区的血液灌注,但一些病人在缺血后再灌注后不仅没有使组织功能恢复,反而使缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重,即我们所说的脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion (IR) injury)。脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,近来研究发现,脑血流中断和再灌注使脑的细胞产生损伤是一个快速的级联反应,这个级联反应包括许多环节,如能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。这些环节互为因果,彼此重迭,并相互联系,形成恶性循环,最终导致细胞凋亡或坏死。目前虽然对脑缺血的病理生理机制研究取得重大进展,但治疗选择仍然有限。一种成功抢救缺血组织的治疗方式是恢复再灌注,溶解血栓的重组组织型纤溶酶原激活剂型(recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA)是唯一批准临床使用的药物,然而其时间窗有限(3h-4.5h),且造成出血并加重缺血再灌注损伤的风险。另一种方法则是以缺血级联反应中的各个关键环节为靶点,阻断其发展,达到神经保护的目的。遗憾的是虽然目前许多神经保护剂在动物实验上能缩小脑梗塞体积并改善神经功能,但没有一种被证实临床有效。天然存在的抗氧化物质所具有的神经保护作用近来成为人们关注的焦点。芒果苷(mangineferin, MAG)是一种天然的多酚类物质,广泛存在于许多药材如百合科植物知母以及芒果叶中。芒果苷分子中的四个芳香族羟基使其具有较强的抗辐射以及抗氧化作用。大量已发表的体内及体外研究表明芒果苷在炎症、氧化应激、肿瘤生长、微生物感染、代谢调节、免疫调节以及辐射保护方面具有广泛的药理学活性。本研究通过在整体动物水平和细胞水平上来建立神经元缺血再灌注损伤模型,探讨芒果苷对缺血性脑损伤的保护作用及其可能的机制,从而为芒果苷更安全、合理的应用于临床提供理论依据。研究方法在整体动物实验中,(1)采用线栓法阻塞大鼠中动脉(middle cerebral artery occlusion, MCAO),建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,观察MAG对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分,评价造模是否成功。大鼠脑缺血2h,再灌注24h后,观察存活大鼠行为变化,参考Zea-longa的5分制评分标准进行神经行为学评分。在剂量研究中,将大鼠随机分成6组：模型组、假手术组、阳性对照组(edaravone, Eda)、MAG各剂量组(5mg/kg、10mg/kg,20mg/kg)。假手术组除不插线外,其余步骤同上。假手术组与模型组均给予等体积生理盐水。HE染色观察组织形态学改变,观察MAG对大鼠缺血大脑的梗塞面积及含水量的影响；(2)较长周期给药实验中,将大鼠随机分成6组：模型组、假手术组、阳性对照组、MAG的高、中、低各剂量组,造模成功后分别于第2、4、6、8d,称量体重,采用姿势反射试验、肢体不对称试验两种方法作为行为学评价指标,观察MAG对大鼠缺血再灌注损伤后运动功能康复的影响；(3)氧化应激生化指标的检测：实验大鼠分组同上。脑缺血2h,再灌注24h后,比色法检测MAG对脑组织匀浆中丙二醛(malonaldehyde, MDA),还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性的影响；(4)炎症生化指标的检测：实验大鼠分组同上。RT-PCR检测MAG对脑组织匀浆中炎性因子肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)在转录水平表达的影响,随后实验采用ELISA法对上述两种炎性因子在蛋白质水平加以测定；(5)体外培养PC12细胞,应用化学方法建立细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)损伤模型,观察细胞形态学改变,并且应用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法观察不同浓度MAG对PC12细胞活力的影响,测定细胞外液乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)浓度。研究结果1.MAG对大鼠脑缺血再灌注损伤神经行为学的影响假手术组大鼠均无异常症状,行为评分为0；模型组动物出现不能完全伸展对侧前爪,或向对侧转圈或向对侧倾倒等的神经损伤症状,其行为学评分与假手术模型组有显着性差异(P=0.000)。芒果苷中剂量组、高剂量组与模型组相比可显着降低行为学评分(P=0.023,P=0.030)。阳性对照组与模型组比较,行为学评分显着改善(P=0.020)。而芒果苷低剂量组与模型组相比无显着差异(P=0.818)。2.MAG对大鼠脑缺血再灌注损伤大脑组织病理学的影响组织形态学结果显示：假手术组的大鼠脑组织细胞形态规则,连接紧密。模型组的大鼠细胞周围间隙增宽,神经细胞大小不等,毛细血管萎缩,神经细胞肿胀,排列紊乱,细胞核呈深染固缩,部分胞质自溶,周围出现较大空泡,缺血脑组织形态改变严重。各给药组的大鼠均可见神经细胞缺血性改变减轻,细胞轻度肿胀,间质较致密,坏死细胞数量减少。其中MAG高剂量组可见神经细胞缺血性改变明显减轻,血管周围间隙和神经细胞周围间隙增宽明显减轻,优于模型组,坏死细胞数量明显减少。3.MAG对大鼠脑缺血再灌注损伤脑梗塞体积及水肿的影响图像分析行MCAO术后的大鼠脑冠切面,与假手术组相比,经TTC染色后可见明显且可重复出现的脑梗塞。假手术组的脑组织无梗塞。芒果苷低剂量处理组与模型组比较,无显着性差异(P=0.093),芒果苷中、高剂量组均可显着缩小缺血侧脑组织梗塞体积(P=0.001,P=0.000)。阳性对照组与模型组比较,脑梗塞体积显着降低(P=0.001)。与假手术组比较(62.46±0.63%),脑缺血所致的脑含水量显着增高(65.81±1.81%)说明了脑水肿的存在,模型组的脑组织含水量显着高于假手术组(P=0.000)；与模型组相比,芒果苷低、中、高剂量组(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)脑组织含水量显着降低(P=0.006,P=0.000,P=0.000)。阳性对照组脑组织含水量显着降低(P=0.000),与模型组相比有统计学意义。4.MAG对大鼠较长时间给药后体重及神经功能恢复的影响①体重变化率：所有大鼠除假手术组外术后均体重下降。模型组由于缺血再灌注引起的损伤,造成体重呈下降趋势。比较MCAO术后2、4、6、8d各组间体重变化率的差异,结果显示与假手术组同时间点(1.49±8.70,4.61±7.55,7.54±6.83,11.65±6.99)比较,模型组MCAO术后第2d、4d、6d和8d体重变化率显着降低(-10.36±2.55,-13.33±±6.05,-12.97±±7.61,-12.39±8.23),有显着性差异(P均<0.01)。与模型组比较,MAG高剂量组(20mg/kg)在造模后4、6d时可显着改善缺血再灌注引起的体重下降(-5.34±10.30,-5.06±8.34),有显着性差异(P均<0.05)。MAG低、中剂量组(5、10mg/kg)及阳性对照组(6mg/kg)给药后可改善缺血再灌注引起的体重下降,但无统计学差异(P均>0.05)。②姿势反射试验：假手术组大鼠肢体功能正常,评分为O。MCAO术后第2d、4d、6d和8d各时间点与假手术组(0±0)比较,模型组有显着性增加(1.90±0.13,1.71±0.32,1.74±0.22,1.41±0.43),具有显着性差异(P--0.000)。与模型组比较,芒果苷低剂量组(5mg/kg)各时间点均无显着性差异(P均>0.05)外,中、高剂量组(10.20mg/kg)各时间点大鼠姿势反射测量值均显着下降(P均<0.01)；与模型组比较,阳性对照组仅在2、6d两个测量时间点对大鼠脑缺血引起的运动障碍有显着的改善作用(P=0.000,P=0.000)。③肢体不对称试验：与假手术组(18.08±17.50,0±23.98,5±27.76,13.46±21.25)比较,造模后第2d、4d、6d和8d各时间点模型组前肢不对称应用评分均显着升高(68.89±21.33,52.78±33.36,48.89±35.16,52.78±30.01),具有显着性差异(P=0.000)。比较MCAO术后2、4、6、8d时各组间肢体不对称评分的差异,结果显示与模型组比较,仅MAG高剂量(20mg/kg)在各个时间点均有显着下降(P均<0.01)；芒果苷低、中剂量组(5、10mg/kg)和阳性对照组(6mg/kg)虽然在MCAO术后能改善在各个时间点的肢体不对称评分,但只有第2d和第8d有显着意义(P均<0.01)。5.MAG对缺血再灌注大鼠脑SOD、GSH和MDA水平的影响模型组脑缺血半球SOD活力显着低于假手术组(P=0.007)；与模型组比较,MAG低、中、高剂量组(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)大脑SOD水平显着高于模型组(P=0.050,P=0.011,P=0.001),表明芒果苷对脑缺血再灌注后脑组织SOD活力有一定恢复作用。阳性对照药依达拉奉组大脑SOD活力显着高于模型组(P=0.014)。模型组大脑GSH含量显着低于假手术组(P=0.000)；与模型组比较,仅高剂量组(20mg/kg)脑组织GSH含量显着高于模型组(P=0.002),低、中剂量组(5mg/kg、10mg/kg)则无显着性差别(P=0.994,P=0.171)；阳性对照药依达拉奉组GSH含量显着高于模型组(P=0.001)。模型组大脑MDA含量与假手术组比较有显着升高(P=0.000),表明缺血再灌注后脑组织脂质过氧化反应强烈,伴有脑组织自由基的聚积以及抗氧化酶活性的降低；与模型组比较,MAG低、中、高剂量(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)脑组织MDA含量显着低于模型组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),表明MAG对缺血再灌注后脑组织脂质过氧化反应有显着抑制作用。阳性对照药依达拉奉组MDA含量显着低于模型组(P=0.000)。6.MAG对缺血再灌注大鼠脑炎症因子IL-1β,TNF-α的影响定量RT-PCR分析显示在假手术组中,脑组织IL-1βmRNA与TNF-α mRNA的表达较低,在缺血再灌注后均显着上升。缺血2h,再灌注24h后,模型组缺血脑组织匀浆中IL-1β mRNA与TNF-α mRNA的表达均显着高于假手术组(P=0.004,P=0.000)。与模型组比较,芒果苷低、中、高剂量组显着降低IL-1pmRNA的表达(P=0.000,P=0.000,P=0.000),且呈一定剂量依赖性；与模型组比较,MAG低、中、高剂量组显着降低TNF-α mRNA的表达(P=0.000,P=0.000,P=0.001)；阳性对照药依达拉奉与模型组比较也显着降低IL-1βmRNA与TNF-α mRNA的表达(P=0.001, P=0.000)。ELISA法在蛋白质水平也证实了上述对炎症因子的抑制作用。7.MAG对PC12细胞OGD损伤后细胞形态学的影响正常对照组PC12细胞生长速度快,接种3d后,在倒置显微镜下可看到PC12细胞贴壁生长,形状呈梭形、叁角形,边界清楚,胞浆丰富,突触相互交织成网状,折光性强,呈典型的神经元形态。模型组细胞折光度减弱,细胞圆缩、脱落。模型中PC12细胞的损伤及药物保护的形态学表现基本一致,MAG各组和阳性对照组的细胞损伤程度均有所减轻,呈现一定的药物形态保护。8.MAG对PC12细胞OGD损伤后细胞存活率及LDH漏出量的的影响MAG低、中、高剂量组(5,10,20μM)及阳性对照药依达拉奉(10μM)对氧糖剥夺模拟的缺血性损伤有明显的神经保护作用。与正常对照组比较,模型组细胞存活率显着降低(P=0.000)。MAG各组呈剂量依赖性的提高细胞存活率,与模型组比较有显着差异(P<0.01)。与正常对照组比较,模型组细胞LDH释放量显着增加(P<0.01)；而MAG各组呈剂量依赖性减少LDH释放量,与模型组比较有显着差异(P<0.01)。阳性对照组提高细胞存活率,降低LDH漏出量,与模型组相比有统计学意义(P<0.01)。结论MAG能够在大鼠脑缺血再灌注后显着升高脑组织中SOD活性和GSH含量,降低MDA含量,从而增强自由基清除能力,减轻脂质过氧化损伤；降低脑组织中炎症因子IL-1β mRNA与TNF-α mRNA基因的表达,从蛋白质水平也证实了对上述两个炎症因子的抑制作用,从而显示其抗炎作用；同时MAG还能增强氧糖剥夺损伤后PC12细胞的存活力,降低细胞上清中LDH含量。这些可能是MAG能改善脑缺血后大脑的组织形态学变化,缩小脑梗死面积,减轻脑水肿损伤,促进神经功能恢复,有效治疗局灶性脑缺血再灌注损伤,发挥神经保护作用的重要机制。
陈春美[9]2006年在《NOS反义RNA重组腺相关病毒载体（rAAV-AsnNOS、rAAV-AsiNOS）抑制缺血缺氧神经细胞凋亡的体内外实验研究》文中研究表明先天性心脏病、后天性瓣膜疾病形成的栓子脱落、体外循环心脏手术和手术后血流动力学的改变，都可能导致脑缺血缺氧，出现不同程度的神经系统并发症。一氧化氮(nitricoxide，NO)在神经系统损害中起重要作用，并且参与了缺血性神经元损害。一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)是生物体内NO合成的限速酶，内皮型一氧化氮合酶(neuronal nitricoxide synthase，nNOS)来源的NO在脑缺血早期发挥损伤作用，诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)来源的NO在脑缺血晚期发挥损伤作用。p38 MAPK通路与包括脑缺血、缺氧等多种因素所导致的神经损伤的病理过程有关，通过启动凋亡信号引起细胞损伤。细胞凋亡信号的出现可导致Caspase-3的活化，后者在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。 线栓法制作大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MACO)局灶性脑缺血模型，成为现在应用最广泛的体内脑缺血模型；通过改变PC12细胞的培养环境，建立的缺氧细胞模型，是目前研究神经细胞缺氧最常用的体外模型。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus rAAV)载体是目前唯一没有引起人类宿主任何病理反应的载体，具有低免疫原性、长期稳定表达携带的外源基因以及嗜神经等特点，已经成为神经系统疾病的新型基因治疗工具。 本研究目的在于探讨NOS和NO在脑缺血组织表达特点，以及NOS和NO对神经细胞毒性作用和引起神经细胞凋亡可能的通路，构建携带NOS反义基因的腺相关病毒载体，并转染到体内和体外缺血缺氧模型中，分别探讨转染后的神经细胞耐受缺血缺氧损伤和抑制缺血缺氧导致神经细胞凋亡的发生机制。本研究分为六部分展开论述，研究方法、结果和结论如下。 1．大鼠局灶性脑缺血模型的建立及一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)表达特点 1．1方法 应用线栓法制作大脑中动脉阻塞(MCAO)局灶性脑缺血模型，应用硝酸还
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