冯 莉 夏景林 董文洁 赵 缜 谢 蕴上海市闵行区中心医院/复旦大学附属闵行医院 上海 ２０１１９９
【摘要】 目的 研究LMX１A 基因启动子在胃癌细胞中的甲基化状态.方法 运用甲基化特异PCR (MSP)法检测３０例原发胃癌和癌旁组织中LMX１A 基因的甲基化水平.甲基化修饰后亚硫酸盐测序PCR (BSP)分析胃癌细胞MKN４５细胞LMX１A 基因启动子CpG岛甲基化状态.提取细胞RNA,通过实时定量PCR(realtime－PCR)检测LMX１A 基因mRNA 在不同浓度的DNA 甲基化酶抑制剂５’－杂氮－２’－ 脱氧胞嘧啶(５－aza－dC)处理MKN４５细胞后,LMX１A 基因mRNA 的改变情况.结果 原发性胃癌的甲基化异常检出率是３３％ (１０/３０).LMX１A 基因在MKN４５细胞中存在高甲基化状态,MKN４５细胞经５－aza－dC处理后LMX１A 基因mRNA 表达明显上调.结论 LMX１A 基因在原发性胃癌中存在甲基化异常,说明LMX１A 基因基因甲基化异常可能参与胃癌的发生. 【关键词】 胃癌细胞; LMX１A 基因; DNA 高甲基化; ５－aza－dCHypermethylationofLMX１AgeneinhumanGastriccancer【Abstract】Objective TodetectthemethylationstatusofLMX１Apromoteringastriccancercells．Methods ３０primarygastriccancertissuesandcorrespondingnormaltissuesweredetectedby Methylation－specificPCR (MSP)method．MethylationstatusofLMX１ApromoterinCRCcelllineMKN４５wasexaminedbyBisulfite－sequencingPCR (BSP)．ExpressionofLMX１AinMKN４５orcellstreatedwithincreasingmountofdemethylationagent,５－aza－dC,wasidentifiedbyRT－PCR．Results Aberrantmethylationinprimarygastriccancerwas３３％ (１０/３０)．HypermethylationofLMX１AwasobservedinMKN４５cells．DecreasedLMX１A mRNAcanberestoredinMKN４５aftertreatmentwith５－aza－dC．Conclusions ThefreＧquentaberantmethylationofLMX１Aisobservedinprimarygastriccancertissues,anddecreasedLMX１AinMKN４５cellsissignificantlycorrelatedwith【pKroeymowtoerrdshy】permethylation,suggestingthatpromoterhypermethylationofLMX１Amayplayanimportantroleintumorigenesisofgastriccancer． Gastriccancercancer; LMX１A; Hypermethylation; ５－aza－dC 【中图分类号】R７３５．２【文献标识码】A 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１０－００４２－０１
胃癌是我国常见的肿瘤之一,上海地区的胃癌发生率紧随肺癌和乳腺癌位列第三.一般认为胃癌的发生与胃的慢性疾病和胃黏膜的上皮异性增生等因素有关,但总的来说其病因未明[１].因此,了解胃癌的发生和发展机理将有助于胃癌的防治.LMX１A 是新发现的转录因子,研究表明,LMX１A 基因在宫颈癌中高甲基化,并与病人的预后呈正相[２].LMX１A 基因启动子甲基化在胃癌中尚未有报道.本试验通过甲基化特异性PCR(MSP)方法检测LMX１A 基因启动子在原发性胃癌的甲基化情况,并通过实时定量PCR分析胃癌细胞在去甲基化药物处理前后,LMX１A 基因mRNA 是否出现变化,以探讨启动子甲基化是否参与LMX１A 基因的表达调控[３].
１ 材料与方法１．１ 细胞系MKN４５细胞维持在含有１０％胎牛血清的DMEM 培养液中,于３７C 及５％ CO２条件下进行培养. １．２ DNA 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 加入NaOH 于４２℃水浴变性３０min,再加入亚硫酸氢钠和对苯二酚,混合充分后离心,用石蜡油封层,５０℃水浴１６－１８h.移去石蜡油, 用WizardDNAClean－UpSystem 纯化DNA.纯化的DNA 加入NaOH,室温放置５－１０min.加入乙酸钠和乙醇,－２０℃沉淀５h,然后４℃下１２０００r/min离心３０min.室温干燥后５０μl灭菌双蒸水重新溶解DNA,－２０℃保存. １．３ 甲基化特异性PCR(MSP) 用MSP检测TIG在胃癌组织的甲基化状态.反应条件:９５℃ 预变性５min;９５℃４０s,６１℃４５s,７２℃ ４５S,共４０ 个循环;７２℃ 延伸１０min.取５μlPCR反应产物,于２％琼脂糖凝胶上电泳,自动电泳凝胶成像分析系统扫描分析. １．４ BSP 以经亚硫酸氢钠修饰后的DNA 为模板,９５℃ 预变性１０ min,然后９５℃３０s,５６℃３０s,７２℃ ３０s,共３４个循环,循环结束后继续于７２℃延伸１０min. 反应产物胶回收后连接到pMD－１８Tsimple载体上,选择６个克隆测序. １．５ ５－aza－dC处理细胞分别予１μmol/L、２．５μmol/L、５μmol/L浓度５－aza－dC及等量PBS缓冲液处理后,将细胞置于３７℃、５％CO２、饱和湿度孵箱中培养,定量PCR 检测基因表达.Trizol提取细胞总RNA,应用逆转录试剂盒合成cDNA 第一条链,以合成的cDNA 为模板进行realtime－PCR.反应条件为９５℃ １５s,６０℃ １min, 共４０个循环. １．６ 统计学分析数据用SPSS１１．０统计软件分析,计数资料用χ２ 检验,计量资料用t检验, 以p＜０．０５为差异有统计学意义.
２ 结果２．１ 原发性胃癌LMX１A 基因甲基化率通过MSP检测３０例胃癌和相应正常癌旁组织中LMX１A 基因的甲基化情况.发现１０例LMX１A 基因基因出现甲基化(３３％),正常癌旁组织未发现有甲基化异常(p＝０．００１).图１为部分MSP结果.
图１ T,肿瘤组织;N,正常组织;U,非甲基化条带;M,甲基化条带．２ MKN４５ 细胞中LMX１A 基因启动子甲基化状态亚硫酸盐修饰MKN４５细胞和一例正常胃组织的基因组DNA,对处理过的DNA 进行BSP分析,检测LMX１A 基因启动子甲基化状态,正常胃组织的基因组DNA 为阴性对照.BSP结果显示MKN４５细胞中LMX１A 基因存在高密度甲基化状态,而对照组没有检测到甲基化异常(图２).２．３５－aza－dC对LMX１A 基因基因mRNA 表达的影响实时定量PCR 结果显示,不同浓度的５－aza－dC处理MKN４５细胞７２h后,LMX１A 基因mRNA 明显增加且呈剂量依赖性.MKN４５细胞在１０μmol/L５－aza－dC作用下,LMX１A 基因mRNA 表达是对照组的１５倍左右(p＜０．０５).
３ 讨论研究发现,肿瘤的发生一般与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关[２],其中, 启动子甲基化是抑癌基因失活的重要机制[４].这种DNA 修饰方式并没有改变基因序列,但是它调控了基因的表达[３].人类癌症中整个基因组的低甲基化现象是最早发现的表观遗传学改变,后来发现抑癌基因的高甲基化导致基因失活是肿瘤发生的重要机制[５].
目前,在胃癌和癌前病变中就已经发现很多基因受甲基化调控,如APC、COX－２、E－cadherin、p１６、BTG４、RUNX３等, 且有些基因的甲基化水平随着胃癌的发展呈积累性改变[６]. 本课题组的研究证实胃癌组织及胃癌细胞株中LMX１A 基因存在甲基化异常,而正常胃粘膜组织则表现为没有或很低的甲基化状态[７].且LMX１A 的mRNA 在多数胃癌组织中较对应的正常组织低表达,这些结果说明LMX１A 基因很可能在胃癌的发生发展中扮演重要角色.因此,研究LMX１A 基因甲基化异常情况对胃癌的发生机制有很大帮助.这对于我们进一步深入探讨改变抑癌基因的甲基化状态,研究胃癌去甲基化治疗的新方法具有重要意义.
参考文献[１] DongW,TuS,XieJ,etal．:Frequentpromoterhypermethylationandtranscriptionaldownregulationofbtg４geneingastriccancer．Biochem[ BiophysResCommun２００９;３８７:１３２－１３８． ２] VillaA,ListeI,CourtoisET,etal．:Generationandpropertiesofanewhumanventralmesencephalicneuralstemcellline．ExpCellRes２００９;[ ３１５:１８６０－１８７４． ３] BarzilayR,Ben－ZurT,BulvikS,MelamedE,OffenD:LentiviraldeＧliveryoflmx１aenhancesdopaminergicphenotypeindifferentiatedhumanbonemarrow mesenchymalstem cells．Stem Cells Dev２００９;１８:５９１[ －６０１． ４] CaiJ,DonaldsonA,YangM,etal．:Theroleoflmx１ainthedifferentiＧationofhumanembryonicstemcellsintomidbraindopamineneuronsincultureandaftertransplantationintoaparkinson＇sdiseasemodel．Stem[ Cells２００９;２７:２２０－２２９． ５] LiuCY,ChaoTK,SuPHetal．CharacterizationofLMX－１AasameＧ[ tastasissuppressorincervicalcancer．JPathol２００９;２１９:２２２–３１． ６] ChenX,CaoX,Dong W,LuoS,SuoZ,JinY．ExpressionofTIP３０tumor suppressor gene is down － regulated in human colorectal[ carcinoma．DigDisSci２０１０;５５:２２１９–２６． ７] SuHY,LaiHC,LinYW,etal．:AnepigeneticmarkerpanelforscreenＧingandprognosticpredictionofovariancancer．IntJCancer２００９;１２４:３８７－３９３
论文作者:冯莉 夏景林 董文洁 赵缜 谢蕴
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年9月供稿
论文发表时间:2016/2/23
标签：基因论文; 胃癌论文; 甲基化论文; 细胞论文; 组织论文; 状态论文; 异常论文; 《中国综合临床》2015年9月供稿论文;