东台市人民医院药剂科 江苏东台 224200
摘要：目的：探讨microRNA-340（miR-340）基因在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者中的临床意义及其对化疗药物敏感性的影响。方法：应用实时荧光定量PCR方法检测25例缺铁性贫血患者和70例初诊AML患者中骨髓单个核细胞miR-340基因的水平并分析临床意义。通过细胞计数法评估细胞生长，同时应用流式细胞术评估细胞凋亡。结果：AML患者中miR-340表达水平显著低于对照组（P=0.007）。以miR-340表达中位数为界将AML患者分为高和低表达组，两组之间比较发现性别、年龄、外周血细胞、骨髓原始细胞比例、FAB分型以及常见基因突变无统计学差异（P>0.05）。然而，miR-340高表达组患者经诱导化疗后完全缓解（complete remission，CR）率显著低于miR-340低表达组（P=0.049），且定量分析发现经1-2疗程诱导化疗获得CR的患者初诊时miR-340表达水平显著高于未获得CR的患者（P=0.009）。生存分析发现miR-340低表达组患者总体生存时间显著短于miR-340高表达组患者（P=0.034）。此外，对THP-1细胞株过表达miR-340可以显著增强阿糖胞苷诱导的细胞凋亡（P<0.001），抑制细胞生长（P<0.05）。结论：miR-340在AML患者中表达下调，并且跟化疗反应和预后相关。miR-340可以增强白细胞株THP-1对阿糖胞苷的敏感性。
关键词：MicroRNA-340；预后；阿糖胞苷；敏感性；急性髓系白血病
Clinical Significance of MicroRNA-340 in Acute Myeloid Leukemia and Its Effect on Cytosine Sensitivity
Cao Jing-jing
(Department of Pharmacy, Dongtai People’s Hospital, Dongtai Jiangsu 224200, China)
[Abstract] Objective: This study intended to explore clinical significance of microRNA-340 (miR-340) expression in patients with acute myeloid leukemia (AML) and its effect on cytosine sensitivity. Methods: Real-time quantitative PCR was performed to detect miR-340 level in bone marrow (BM) mononuclear cells from 25 erytic anemia patients and 70 de novo AML patients. Cell proliferation assays were determined by cell counting, whereas cell apoptosis assays were determined by flow cytometry analysis. Results: miR-340 expression level in AML patients was significantly lower than controls (P=0.007). Based on the median level of miR-340 expression, AML patients were divided into two groups, namely low and high miR-340 expression. No significant differences were found between two groups in sex, age, peripheral blood cells, percentage of BM blasts, and common gene mutations (P>0.05). However, patients with low miR-340 expression presented a significantly lower complete remission (CR) rate than those with high miR-340 expression (P=0.049), and patients who can achieve CR showed a significantly higher miR-340 expression level in newly diagnosis time than those who cannot achieve CR based on 1-2 course of induction chemotherapy (P=0.009). Survival analysis showed that patients with low miR-340 expression had shorter overall survival (OS) than those with high miR-340 expression (P=0.034). Overexpression of miR-340 significantly enhanced the pro-apoptotic and anti-proliferative effects mediated by cytosine in THP-1 cell lines (P<0.05). Conclusions: Our findings revealed that miR-340 expression was decreased in AML patients, and low miR-340 expression correlated with unfavorable prognosis. Overexpression of miR-340 significantly enhanced sensitivity of THP-1 cell line to cytosine.
Keywords: MicroRNA-340; prognosis; cytosine; sensitivity; acute myeloid leukemia
MicroRNA在许多物种和组织中广泛表达，并且在各种生物学过程中（包括细胞增殖、分化、凋亡、侵袭和迁移）发挥重要作用，其表达异常在肿瘤发生发展中也起到重要作用[1-2]。AML是一种遗传学，分子生物学和临床表现异质性的疾病，其特征是克隆性的造血干细胞由于增殖失控、凋亡受抑和分化阻滞等，从而无法进入终末分化成为成熟的血细胞[3]。除细胞遗传学和分子遗传学（染色体异常和基因突变）改变外，microRNA转录后调控的表观遗传学改变也参与AML发生，并且与患者预后有关[4]。
最近，越来越多的研究报道揭示microRNA-340（miR-340）在恶性肿瘤发生发展中的作用。MiR-340可以通过影响癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移，所以被认为是抑癌基因，并且在多种恶性肿瘤中下调[5-15]。一些常见的促癌基因如EZH2、JAK1、NRAS及CCND1被鉴定为miR-340的靶基因，从而参与多种恶性肿瘤的发生发展[5-8]。此外，还有一些报道发现miR-340与药物耐药性有关，并与恶性肿瘤患者的预后相关[8-15]。然而，miR-340在AML中的临床意义和生物学功能研究还尚未见报道。
1 材料和方法
1.1 研究病例
25例缺铁性贫血患者（年龄：23-88岁）和70例AML患者（年龄：20-87岁）均为既往在我院血液科治疗案例。两者之间年龄和性别均无统计学差异。AML患者的其他具体临床参数见表1。诊断分型按FAB和2016版WHO标准[16-17]。所有AML患者均接受诱导缓解治疗和巩固治疗，治疗方案以阿糖胞苷为基础，按照成人AML（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南[18]。
1.2 BMMNCs分离、RNA提取和逆转录
所有缺铁性贫血患者和AML患者行骨髓穿刺时留取10 mL骨髓血（bone marrow，BM），使用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BM mononuclear cells，BMMNCs）。总RNA应用TRIzol（Thermo Fisher Scientific，美国）提取，并使用miScript Reverse Transcription Kit（Qiagen，德国）逆转录为cDNA。其中反应体系为20 μL包括14 μL去RNA酶水、4 μL缓冲液，1 μL总RNA和1 μL逆转录酶。反应体系离心后跑PCR，程序包括两步：①37℃ 1h；②95℃ ５min。PCR产物4℃短期保存待用。
1.3 实时荧光定量PCR
应用实时荧光定量PCR检测miR-340的表达，并按照miScript SYBR green PCR kit（Qiagen，德国）进行。miR-340基因上游引物序列为5’-TTATAAAGCAATGAGACTGATT-3’；下游为试剂盒提供的特异性引物。内参基因U6引物序列参照报道[19]。两个基因具体的反应体系为20μL包括双蒸水 6μL、cDNA 2μL（50ng）、miScript SYBR green PCR Mix 10μL、上下游引物各1μL（1μM）。PCR反应条件：①95℃预变性15min（1个循环）；②94℃变性15s、55℃退火30、72℃延伸30s、75℃收集荧光30s（40个循环）；③溶解曲线95℃ 15s、60℃ 60s、95℃ 15s、60℃ 15s（1个循环）。miR-340的表达水平使用2-△△CT方法分析其相对定量。
1.4 细胞培养与转染
THP-1细胞购于ATCC（American Type Culture Collection，美国），培养于含青霉素（100U/mL）、链霉素（100U/mL）和10%胎牛血清的RPMI 1640中，于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中孵育。miR-340 mimics质粒购自上海吉玛基因有限公司，使用HiPerFect Transfection Reagent（Qiagen，德国）进行转染，并通过杀稻瘟菌素（Thermo Fisher Scientific，美国）进行筛选转染成功的阳性细胞。
1.5 细胞生长实验
将对照组和实验组细胞按1×105/mL接种到6孔板，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，每天加入阿糖胞苷（终浓度6μg/mL）。分别在第24h、48h和72h后，通过计数板对细胞计数三次。
1.6 细胞凋亡检测
将对照组和实验组细胞按2×105/mL接种到6孔板，培养于含1%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，每天加入阿糖胞苷（终浓度6μg/mL）。在48h后使用Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒（BD，美国）通过通过流式细胞术检测细胞凋亡率。每个实验重复三次。
1.7 统计学分析
数据统计应用SPSS 22.0软件和GraphPad Prism 5.0软件处理。两组连续性变量间的差异分析使用Mann-Whitney U检验（无正态性）和T检验（正态性），分类变量之间的差异比较采用卡方检验或Fisher确切概率法，生存分析采用Kaplan-Meier法，以P<0.05为具有统计学差异。
2 结果
2.1 AML患者中miR-340的表达态势
通过PCR检测，miR-340在对照中表达中位水平为0.024（范围为0.000-1.000），AML患者中的表达中位水平为0.007（范围为0.000-2.721），显著低于对照组（P=0.007，图1）。
2.2 miR-340表达与AML患者临床参数的关系
以miR-340表达水平的中位数值为界将AML分为低和高表达组，两组AML患者之间比较常见的临床参数见表1。两组之间比较发现性别、年龄、外周血细胞、骨髓原始细胞比例、FAB分型以及常见基因突变无统计学差异（P>0.05）。
2.3 miR-340表达与AML患者预后的关系
miR-340表达与患者化疗反应之间的关系：miR-340高表达组患者经诱导化疗后完全缓解（complete remission，CR）率显著低于miR-340低表达组（P=0.049，表1），且定量分析发现经1-2疗程诱导化疗获得CR的患者初诊时miR-340表达水平显著高于未获得CR的患者（P=0.009，图2）。
图4：过表达miR-340对阿糖胞苷诱导THP-1细胞增殖和凋亡的影响
（*：P<0.05；***：P<0.001）
3 讨论
越来越多的研究发现miR-340在多种实体肿瘤中扮演了抑癌作用。例如，miR-340在非小细胞肺癌中通过靶向p27的多个负调节因子抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡[20]。抑制miR-340通过靶向癌蛋白c-Met促进乳腺癌细胞迁移和侵袭[9]。本次的研究中，我们证明了AML患者中miR-340的表达与对照相比显着降低，这表明miR-340在AML发生发展中起着至关重要的作用，并且结合后续的体外细胞实验，初步推测miR-340可能抑癌基因的作用。当然，也需要体外功能研究来验证和证实其确切的作用，以及致病机制。
除了生物学作用之外，一些研究还揭示了miR-340在致癌过程中对耐药性的作用。Song等报道，miR-340-5p通过靶向骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中的LPAATβ增强了对顺铂的敏感性[10]。另一项研究也得出类似结论：miR-340通过靶向ZEB1减轻了骨肉瘤细胞的化疗耐药性[21]。此外，Shi等人表明，miR-340通过靶向Nrf2依赖性抗氧化剂途径逆转肝细胞癌细胞系的顺铂耐药性[12]。我们通过初步的体外细胞实验证明miR-340可能显著增强THP-1细胞株由阿糖胞苷介导的促凋亡和抗增殖作用，从而增加了THP-1细胞株对阿糖胞苷的敏感性，降低了耐药性。
由于miR-340与阿糖胞苷药物敏感性相关，miR-340可能就存在一定的预后价值。我们本次研究通过生存分析也证实了miR-340对预后的影响。尽管目前miR-340在白血病中的预后意义未见报道，但是其他的多种肿瘤已经证实了miR-340表达对预后的影响。比如：在乳腺癌中，miR-340表达的缺失与5年OS和无复发生存期较短有关[9]。Cai等发现miR-340和ROCK1 mRNA结合可以预测小儿骨肉瘤的肿瘤进展和预后[14]。Takeyama等证实骨髓中miR-340的表达降低与结直肠癌的肝转移相关[15]。此外，miR-340也可以影响胶质母细胞瘤患者的OS[8]。当然，由于本研究中的一些局限性，比如病例数较少等，需要进行前瞻性研究来验证我们的结果。
综上所述，miR-340在AML患者中表达下调，并且跟化疗反应和预后相关。miR-340可以增强白细胞株THP-1对阿糖胞苷的敏感性。
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论文作者:曹兢兢,朱兴萍
论文发表刊物:《健康世界》2018年15期
论文发表时间:2018/8/27
标签：患者论文; 细胞论文; 敏感性论文; 基因论文; 诱导论文; 凋亡论文; 靶向论文; 《健康世界》2018年15期论文;