帕侬赛(PHAKAN, Phanomsay)[1]2001年在《肝癌相关抗原衰老标记蛋白-30(SMP30)在肝癌组织的表达及其意义的研究》文中认为目的：检测一种新的肝癌相关抗原——衰老标记蛋白-30（SMP30）在肝癌组织中的表达情况，探讨其在肝癌组织表达的特异性程度。方法：取原发性肝癌的癌组织，以癌旁肝组织、良性肝病肝组织以及肝外其他恶性肿瘤的癌组织作对照，采用RT-PCR技术检测组织中SMP30的表达情况。结果：原发性肝癌患者24例，SMP30在肝癌组织表达阳性率为70.83%（17/24），相应的癌旁肝组织阳性率为41.67%（10/24），13例良性肝病患者肝组织及26例肝外其他恶性肿瘤患者的癌组织表达阳性率分别为30.77%（4/13）和23.08%（6/26）,各组与肝癌组比较差别有显着意义（P <0.05或P <0.01），而非肝癌组之间差别无显着意义。SMP30从分子生物学水平诊断肝癌的灵敏度和特异性分别为70.83%和68.25%。结论：衰老标记蛋白-30是一种肝癌相关抗原，其在肝癌组织的表达具有一定的组织特异性，并且在今后的肝癌血清学诊断方面可能具有一定临床意义。
李晓龙[2]2010年在《肝癌相关抗原SMP30 mRNA在癌细胞中的表达及其单克隆抗体的制备》文中研究说明目的：检测衰老标记蛋白(SMP30)mRNA在不同癌细胞系中表达水平,探讨其在不同细胞中的表达差异性；建立稳定分泌SMP30单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法：常规培养正常肝细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,设计SMP30及内参P53基因上下游引物,分别采用RT-PCR与荧光定量PCR检测SMP30 mRNA在正常肝细胞和四种癌细胞系中的表达情况。基因工程表达、分离,纯化SMP30蛋白后,用此蛋白免疫4-6周BALB/c雌性小鼠,应用间接ELISA法测定免疫小鼠血清效价,取血清效价大于1：16000的小鼠脾细胞与sp2／0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,并进行HAT、HT选择培养后,观察融合细胞克隆的生长,应用间接ELISA法测定融合细胞培养上清液中抗SMP30抗体的存在,将抗体阳性融合细胞进行克隆化培养。结果：紫外分光分析仪检测各种癌细胞总RNA的A260／A280比值,结果均为1.895±0.082,表明提取的总RNA质量较好。半定量RT-PCR测得SMP30mRNA在肝癌、胃癌、乳腺癌和宫颈癌的相对表达量分别是0.612±0.324、0.579±0.304、0.486±0.223和0.469±0.215,各癌细胞之间SMP30 mRNA表达没有明显差异,而在正常肝细胞中SMP30 mRNA的表达量为0.102±0.065,相对前几种癌细胞表达量较低,差异有统计学意义(P<0.05)。荧光定量PCR法测得SMP30 mRNA在所有细胞株中均有表达,在肝癌、胃癌、乳腺癌和宫颈癌细胞中的表达量分别为0.926±0.340、0.922±0.379、0.614±0.356和0.608±0.346。正常肝细胞的表达量为0.175±0.158,显示SMP30mRNA在癌细胞的表达量较正常肝细胞表达量高(P<0.05)。基因工程表达、分离纯化得到纯的SMP30蛋白,免疫雌性小鼠后获得5只血清效价大于1:16000BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与sp2／0小鼠骨髓瘤细胞融合,成功得到5孔阳性较高的融合细胞克隆。结论：SMP30mRNA在癌细胞中的表达量高于正常肝细胞。探索了SMP30单克隆抗体的研制方法,得到了5孔阳性较高的融合细胞克隆,为后续研究提供平台。
宾业鸿[3]2005年在《肝癌相关抗原SMP-30抗体血清学筛选及其意义研究》文中进行了进一步梳理目的:检测衰老标记蛋白30(SMP-30)抗体在肝细胞癌病人血清以及其它肿瘤病人、非癌性肝病、非肿瘤病人和正常人血清中出现的频率,探讨其在肝细胞癌(HCC)诊断应用方面的价值。方法:以基因工程表达纯化的SMP-30融合蛋白为抗原,运用间接酶联免疫吸附实验(间接ELISA)和Western blot技术检测SMP-30抗体在145例HCC患者血清、371例其它肿瘤、79例非癌性肝病、20例非肿瘤性疾病以及138例正常人血清中的阳性率,并进行统计学分析。结果:阳性抗体主要出现在HCC患者血清,阳性反应率为32.4%(47/145),正常人为0.72%(1/138),两组比较有显着统计学意义(P<0.001)。同时,在其它肿瘤组中,鼻咽癌、食道癌、肠癌、宫颈癌分别有13.3%(13/98)、7.7%(2/26)、2.5%(1/40)和7.3%(3/41),非癌性肝病组中乙肝和肝硬化分别有6.6%(4/60)、5.3%(1/19),与HCC组相比较均有明显的统计学意义。另外,在AFP阴性的HCC病人中,SMP30抗体的阳性率达到43.6%(17/39),预示着其对AFP阴性HCC的诊断起弥补作用。高、中分化HCC病人血清SMP-30抗体阳性率较低、未分化HCC高,亦提示着其抗体的产生与肝癌组织类型和恶性程度相关,有望作为肝癌预后的评价指标。另外,SMP30诊断肝细胞癌的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比以及阴性似然比分别为32.4%、95.9%、83.7%、65.3%、85.6%、7.9和0.71,也提示其作为HCC血清学辅助诊断的应用价值。结论:SMP30抗体在HCC中有一定的特异性,特别是对AFP阴性HCC病人诊断方面有一定弥补作用,在HCC的鉴别诊断方面也有很好的作用,有望作为肝细胞癌血清学诊断新的辅助指标。
张胜昌[4]2013年在《SMP30在肝细胞癌发展过程中的作用机制研究》文中认为目的：1、观察细胞传代对SMP30蛋白表达变化的影响,并验证SMP30是否为分泌蛋白。2、检测SMP30蛋白在肝细胞癌发生发展过程中的表达水平变化趋势,判断其表达水平变化是否与肝细胞癌发展病程有关。3、从DNA甲基化和siRNA的角度探讨SMP30在肝细胞癌发展中的表达变化机制。4、初步探讨SMP30对肝癌细胞生物学特性(增殖、凋亡、侵袭以及细胞周期)的影响。方法：1、用生物信息学方法预测SMP30的分泌特性；用高糖DMEM培养基培养Hep G2细胞株,从第2代开始每隔1代收集培养细胞,提取细胞总蛋白；同时分别提取Hep G2细胞的细胞膜蛋白、细胞浆蛋白和细胞核蛋白,收集细胞培养液上清,超滤离心管浓缩,蛋白质印迹法检测SMP30蛋白的含量。2、用注射器将人肝癌Hep G2细胞注入裸鼠腋部皮下制作裸鼠种植瘤模型,将荷瘤裸鼠按取材时间不同分为2周组、4周组、6周组,每组10只,并取10只无荷瘤裸鼠作为对照组。根据分组情况分别取材,经眼眶静脉丛取血后处死裸鼠,分离血清,Western-blot法测裸鼠血清SMP30蛋白含量；剥离瘤组织,一部分做成蜡块,用免疫荧光组织化学法检测瘤组织内SMP30蛋白的表达情况。一部分以-80℃冰箱冻存,用来提取总RNA和基因组DNA,用提取的总RNA进行逆转录,做荧光定量PCR,检测SMP30mRNA含量；提取的基因组DNA用亚硫酸氢盐进行修饰,做甲基化特异性PCR(MSP),检测SMP30基因启动子甲基化的情况。3、收集广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科2012年2月至2012年7月外科手术切除的新鲜肝癌组织标本、癌旁组织及距肿瘤边缘5cm以上的正常肝组织各40例,提取总RNA进行逆转录,做荧光定量PCR,检测SMP30mRNA含量；提取的基因组DNA用亚硫酸氢盐进行修饰,做甲基化特异性PCR(MSP),判断DNA甲基化和SMP30蛋白表达及AFP的相关性。4、设计3条siRNA及1条对照序列交上海吉玛公司合成,转染Hep G2细胞,利用荧光定量PCR测各组siRNA对SMP30mRNA的干扰效率,Western-blot法检测各组siRNA对SMP30蛋白的干扰效率,筛选出干扰效率最好的序列。用MTT法检测细胞增殖情况；用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western-blot法检测凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2;用Transwell、室检测Hep G2细胞的侵袭能力；用流式细胞仪检测细胞周期变化。结果：1、用生物信息学软件Secretome2.0预测SMP30分泌性,其NN值为0.544,说明其可能是非经典途径分泌蛋白。2、Hep G2细胞在传代过程中SMP30蛋白含量无明显变化；细胞浆和细胞核中SMP30蛋白含量也无明显变化；无统计学意义差异(均P>0.05)。对细胞培养液上清进行Western blot检测,发现有相当数量的SMP30蛋白。3、接种于裸小鼠皮下的Hep G2细胞均成瘤(30/30),病理切片显示符合肝细胞性肝癌特征,肿瘤分化程度中等。免疫荧光结果显示,2周组瘤组织内SMP30蛋白表达量高于4周组和6周组,差异均有统计学意义(均P<0.01),4周组和6周组无差异。4、对裸鼠血清进行Western blot检测,发现各时间组荷瘤裸鼠血清皆有SMP30蛋白。在无荷瘤裸鼠血清未检测到SMP30蛋白。5、用2△△Ct。法比较SMP30mRNA的相对表达量,2周组瘤组织内SMP30mRNA表达量高于4周组和6周组,4周组高于6周组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。6、MSP结果显示,2周组各组裸鼠移植瘤组织SMP30基因启动子甲基化率为(37.74%)低于4周组(57.78%)和6周组(58.14%),差异均有统计学意义(均P<O.05),4周组和6周组的甲基化率无差异(P>0.05)。对临床切除的肝组织进行MSP检测,肝癌组织甲基化率(57.50%)明显高于正常肝组织(12.50%)和癌旁组织(17.50%),差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常肝组织和癌旁组织无差异。Spearman相关系数分析,SMP30蛋白的表达与血清AFP浓度无关。7、选取对SMP30mRNA干扰效率(65.58±12.69%)和对SMP30蛋白干扰效率(68.62±13.77%)都最高的RGN-homo-1681组为干扰序列。8、MTT法检测结果表明,空白组与对照组细胞之间无显着性差异(P>0.05),实验组经siRNA转染后细胞增殖程度显着增加,与前两组相比有显着性差异(P<0.05)。9、Transwell侵袭实验显示,siRNA干扰组较空白组和对照组穿膜细胞数量明显增加,差别有统计学意义(P<0.05),而空白组与对照组相比无显着性差异(P>0.05)。10、用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果发现虽然干扰组(7.54±1.36%)比其他两组(2.17±0.36%、3.36±0.28%)略有升高,但都属于正常范围。紫外灯照射后24h。流式检测结果发现,干扰组细胞、空白组和阴性对照组细胞凋亡率分别为45.45±±11.36%、25.54±4.33%和26.45±5.37%,干扰组与其他两组比,有明显差异(P<0.05),而空白组与阴性对照组无统计学差异(P<0.05)。11、Western-blot法检测紫外照射后Hep G2细胞内Bcl-2蛋白,实验组、空白组和对照组Bcl-2相对表达量分别为24.33±2.53、44.67±2.76和47.25±5.45,实验组的Bcl-2表达明显下降,有统计学差异(P<0.05),空白组与阴性对照组的Bcl-2表达无统计学差异(P>0.05)。12、Western-blot法检测紫外照射后Hep G2细胞内Bax蛋白,实验组、空白组和对照组Bax相对表达量分别为65.38±5.46、45.13±3.26和46.25±5.45,实验组的Bax表达明显升高,有统计学差异(P<0.05),空白组与阴性对照组的Bax表达无统计学差异(P>0.05)。13、用流式细胞仪检测细胞周期。实验组、空白组和对照组细胞增殖指数分别为44.38±5.28%、25.45±3.89%和26.25±5.64%,实验组的细胞增殖指数明显升高,有统计学差异(P<0.05),空白组与阴性对照组的细胞增殖指数无统计学差异(P>0.05)。结论：1、SMP30蛋白属于非经典途径分泌蛋白。2、细胞传代对Hep G2细胞内SMP30蛋白表达无明显影响。3、SMP30表达水平变化与肝癌发生发展有关。4、DNA甲基化是肝癌SMP30蛋白降低的原因之一。SMP30蛋白的表达与血清AFP浓度无关。5、SMP30可抑制Hep G2细胞的侵袭能力。6、SMP30可抑制紫外照射导致的Hep G2细胞凋亡,其机制之一为降低Bax/Bcl-2比值。
黄朋[5]2012年在《分子伴侣促进SMP30蛋白可溶性表达及表达蛋白在HCC血清检测中的作用》文中指出目的：应用基因工程方法构建、表达和纯化肝癌相关抗原SMP30；探索分子伴侣促进两种重组质粒表达可溶性SMP30蛋白的策略；分离纯化SMP30蛋白,利用SMP30作为抗原检测HCC患者血清中抗SMP30抗体的表达情况。方法：PCR扩增SMP30cDNA序列,用基因工程技术将SMP30基因重组到两种表达质粒pET30a及pColdⅢ中,分别转化E.coli.BL21(DE3) pLysS宿主菌。优化表达条件(如,诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度以及加入诱导剂的最佳时机等),大体积培养基因工程菌、菌体经超声破菌离心后,经Ni-NTA亲和柱纯化获得His-SMP30融合蛋白；分别将五种表达不同分子伴侣的质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16)转入E.coli.BL21(DE3)宿主菌中,再将重组质粒(pET30a-SMP30和pCold Ⅲ-SMP30)分别转化到含有分子伴侣质粒的宿主细胞中,进行分子伴侣与重组质粒的共表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,比较两种表达载体对促进SMP30蛋白可溶性表达与促进SMP30蛋白表达量的不同,选择有可溶性目的蛋白表达较多的共表达体系进一步作优化(不同浓度IPTG等),SDS-PAGE检测可溶性目的蛋白的表达情况；用重组表达的SMP30蛋白包被酶标板,摸索间接ELISA实验过程中各种反应条件,用建立起来的ELISA方法检测HCC病人血清中抗SMP30抗体存在的情况。结果:pET30a-SMP30和pCold Ⅲ-SMP30两种重组质粒分别转化DH5仅菌,两种基因工程菌均能在含有Kan(pET30a)和Amp(pCold Ⅲ)的培养基上生长,菌体经蓝白斑筛选、PCR验证以及从基因工程菌中提取质粒后用Nde I和Sal I双酶切,出现500bp左右的SMP30条带和较大的质粒条带,最后测序并与NCBI上已有序列进行比对,结果完全吻合,相似度100%,证实已成功重组、构建出两种SMP30重组表达质粒。表达质粒通过优化表达条件,取过夜培养菌经1：100转菌液,37℃培养2.5h后,加入0.6mM IPTG诱导剂,37℃诱导7h是最佳表达条件,可获得最大SMP30蛋白表达量。基因工程菌经诱导表达,超声波破菌,取上清和沉淀分别走SDS-PAGE,发现目的蛋白质主要出现在沉淀中,说明SMP30蛋白均主要以包涵体形式表达,蛋白质电泳扫描图谱显示两种重组质粒所表达的SMP30蛋白表达量均占总蛋白的60%以上；表达蛋白经Ni-NTA亲和柱纯化后获纯度高达90%以上的HIS-SMP30蛋白；将pET30a-SMP30重组质粒分别与四种分子伴侣质粒共表达,IPTG诱导后发现SMP30目的蛋白在上清含量极少,有分子伴侣质粒共表达的SMP30蛋白表达量要比不加分子伴侣的均要少,其中pKJE7共表达体表达量又是最少的；而五种分子伴侣质粒分别与pCold Ⅲ-SMP30共表达时,目的蛋白在上清中的含量明显增加,其中含有pKJE7、pG-Tf2、pTf16这叁种分子伴侣的表达体系,SMP30蛋白可溶性表达量明显增多,并在15kDa大小左右有大量蛋白条带出现,；WB检测显示15kDa条带能与抗HIS鼠单克隆抗体和抗SMP30抗体结合,说明为SMP30降解片段；表达的可溶性SMP30蛋白经分离纯化,用其作为抗原检测HCC病人血清抗SMP30抗体,结果175例HCC血清中有22例为阳性,分别统计分析了阳性血清与临床诊断资料的关系,x2双侧检验结果P均大于0.05,无统计学意义,判断为还不能确定阳性血清与临床资料有关系。结论：成功构建出高效表达的SMP30重组质粒；四种分子伴侣质粒分别与pET30a-SMP30共表达时不能有效的促进可溶性蛋白的表达,同时分子伴侣不能提高目的蛋白的表达量,相反却会抑制SMP30蛋白的表达,以pKJE7的抑制效果最为明显；pCold Ⅲ-SMP30与pKJE7、pG-Tf2、PTf16分子伴侣质粒共表达时能较好的促进可溶性SMP30蛋白的表达,他们的最佳IPTG诱导浓度分别是0.1mM、0.6mM(或1.OmM)和0.6mM,最后纯化获得可溶性His-SMP30融合蛋白；不明蛋白降解片段为HIS-SMP30的降解片段；HCC病人血清SMP30抗体检出率为12.6%,且统计结果还不能确定阳性率与临床资料有关系
李晓龙, 康飞科, 雷鸣, 蒋玲玉, 林朝群[6]2010年在《衰老标记蛋白30 mRNA在癌细胞中的表达研究》文中研究指明目的:检测衰老标记蛋白(SMP)30 mRNA在不同癌细胞系中的表达情况,探讨其在不同细胞中的表达差异。方法:分别采用RT-PCR与荧光定量PCR检测SMP30 mRNA在正常肝细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞中的表达,并用SPSS13.0进行统计学分析。结果:SMP30 mRNA在所有被检测的细胞株中均有表达,在癌细胞中的相对表达量分别为肝癌细胞(0.926±0.340)、胃癌细胞(0.922±0.379)、乳腺癌细胞(0.614±0.356)、宫颈癌细胞(0.608±0.346),而在正常肝细胞中为0.175±0.158,显示SMP30 mRNA在癌细胞中的表达量较正常肝细胞中高(P<0.05),且在肝癌细胞中的表达量比在其他癌细胞中更高。结论:SMP30 mRNA在癌细胞中的表达高于正常肝细胞,且在肝癌细胞中的表达高于其他癌细胞,具有临床应用价值。
莫发荣[7]2006年在《抗人肝癌相关抗原SMP-30抗体的制备及其免疫组化的研究》文中指出目的:通过表达人肝癌肿瘤相关抗原SMP-30羧基端165个氨基酸的MBP-SMP-30融合蛋白,免疫兔子制备出抗MBP-SMP-30多克隆抗体,使用免疫组织化学方法检测人肝细胞癌(HCC)中SMP-30的蛋白表达,探讨其在HCC发生、发展中的作用及临床意义。方法:(1)将本课题组构建的含SMP-30羧基末端165个氨基酸的DNA序列的表达质粒,经原核表达和亲和层析纯化获得的目的蛋白MBP-SMP-30免疫兔子,制备抗MBP-SMP-30多克隆抗体,并经ELISA和Western blot鉴定其免疫活性。(2)制备48例人HCC及相应的癌旁组织、6例正常人肝组织和1例正常人肾组织的石蜡切片。采用免疫组织化学SABC法,检测SMP-30在上述组织中的表达情况,结合临床资料进行统计分析。结果:(1)经ELISA和Western blot鉴定,抗MBP-SMP-30多克隆抗体可以和MBP-SMP-30特异性结合。(2)SMP-30定位于肝细胞和肾小管上皮细胞的胞浆和胞核。(3)HCC癌旁组织的SMP-30蛋白表达高于HCC组织,具有显着性差异(P<0.05)。(4)SMP-30蛋白表达与HCC患者性别、年龄、肿瘤大小、病理分级、伴肝硬化情况、HBsAg和AFP检测情况未见有相关性(P>0.05)。结论:(1)使用MBP-SMP-30融合蛋白制备的多克隆抗体可成功检测到人肝组织和肾组织中的SMP-30。(2)SMP-30与HCC的发生、发展有关。(3)SMP-30过度表达可能是HCC的早期性、保护性事件。
侯刚强[8]2006年在《衰老标记蛋白SMP-30mRNA在肝细胞癌中的表达研究》文中研究指明目的:检测衰老标记蛋白(SMP-30) mRNA在正常肝组织、HCC组织以及HCC相应癌旁组织中的表达情况,探讨SMP-30 mRNA的表达与HCC发生、发展的可能关系。方法:采用原位杂交方法检测SMP-30 mRNA在7例正常肝组织、40例HCC组织以及40例HCC癌旁组织中的表达情况,并结合临床相关指标进行统计学分析。结果:在7例正常肝组织中均呈阳性表达,阳性颗粒分布于肝细胞胞浆中,细胞分界清晰;在40例HCC组织中均为阴性表达;在40例相应的癌旁组织中均为阳性表达,阳性颗粒亦分布于肝细胞胞浆中。癌旁组织中SMP-30 mRNA阳性程度与肿瘤的大小、包膜形成之间差异具有显着性(P<0.05);并且与患者年龄之间有相关性( rs =0.556,P<0.05)。结论:SMP-30 mRNA在正常肝组织及HCC癌旁组织中均有表达,表达位置限于肝细胞胞浆中。在癌旁组织中,SMP-30 mRNA的表达随着患者年龄的增加而减少,且其表达与肿瘤的大小以及包膜形成有关。而在HCC组织中未检测到其表达,提示肝细胞的癌变可能与此有关。
赖伟霞[9]2014年在《SMP30及CaM在正常人及不同年龄白内障患者晶状体上皮细胞中的表达研究》文中研究表明目的本实验通过检测两种钙结合蛋白-SMP30及CaM在正常人及不同年龄白内障患者LECs的表达情况。以了解这两种蛋白在正常人和白内障患者LECs的表达是否存在差异性、在不同年龄白内障患者LECs的表达是否有年龄相关性，及二者之间的关系。同时应用正常细胞培养技术，观察正常培养条件下人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞株的形态改变，衰老状态的出现，同时检测SMP30的表达是否具年龄相关性。方法收集正常青年组(19~45岁)晶状前囊膜12例；白内障患者按不同年龄收集1~18岁儿童组、19~45岁青年组、46~60岁中年组、＞60岁老年组晶状体前囊膜各12例。对所取囊膜进行固定、脱水、石蜡包埋、切片。采用间接免疫荧光法检测LECs中SMP30及CaM的表达情况。采用体外正常培养技术，正常培养人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞，倒置显微镜观察其形态学改变并拍照，检测β-半乳糖苷酶的含量了解细胞衰老情况，同时细胞爬片免疫荧光法检测其SMP30的表达。结果SMP30及CaM在所有标本LECs中均有表达，且均主要在细胞浆，胞核少量表达。SMP30在白内障青年组（0.181±0.034）LECs的表达明显高于正常青年组（0.087±0.007）(P＜0.01)； SMP30在儿童组（0.185±0.020）、青年组、中年组（0.207±0.018）白内障患者LECs的表达无统计学差异(所有P值均＞0.05)，但在老年组（0.126±0.027）的表达明显低于其它叁组(P值均＜0.01）。CaM在白内障青年组（0.507±0.288）LECs的表达也高于正常青年组（0.297±0.007）(P＜0.05)；而CaM在不同年龄白内障组患者儿童组（0.624±0.207）、青年组（0.507±0.288）、中年组（0.704±0.168）、老年组（0.5607±0.288）LECs间的表达无统计学差异（所有P值均＞0.05）。五组中所有样本LECs中CaM的表达均较SMP30高，差异具有统计学意义（P值均＜0.05）。SRA01/04细胞株中，8th代细胞呈梭形或椭圆形，β-半乳糖苷酶的阳性细胞率＜5%，SMP30平均IOD为0.0869±0.0148；但28th代细胞形态改变，由梭型变成椭圆形或圆形，细胞变大，胞浆变少，胞浆出现空泡，胞核色淡染，β-半乳糖苷酶的阳性细胞＞85%，认为出现衰老，SMP30（0.0130±0.0016）表达明显低于8th代细胞（P值均＜0.05）。结论SMP30及CaM表达于正常人及白内障患者LECs。SMP30及CaM在白内障患者LECs的表达均较正常人高，可能是晶状体损伤的标志，作为人LECs中一个保护因子，发生白内障时反应性增高。SMP30在白内障患者LECs及SRA01/04表达均具年龄相关性，＞60岁时其表达量的下降是年龄相关性白内障发生的原因之一。CaM在白内障患者LECs的表达无年龄相关性。CaM在所有样本LECs中的表达均较SMP30高，二者在人LECs的钙调节中可能起协同作用。
龙家敏[10]2015年在《SMP30、CNN2与GP73叁种HCC相关抗原对肝细胞性肝癌诊断价值的研究》文中进行了进一步梳理研究背景：肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)和乙型肝炎在我国有很高的发病率和死亡率,广西是这两种疾病的高发区。目前对肝癌的诊断手段主要有临床检查、影像、病理检查,但由于肝癌早期临床症状体征不明显,一旦发现多为晚期。因此,寻找肝癌早期血清检测标记物并进行简单有效的检测是本课题研究的重点内容。目前检测HCC的血清标记物主要是甲胎蛋白(Alpha fetoprotein, AFP),但是其灵敏度并不能让人满意。目前有大量报道称几种指标的联合检测对疾病的检出率有明显提高。本课题组前期研究发现,抗衰老标记蛋白-30 (senescence marker protein-30, SMP30)抗体和抗中性调宁蛋白(H2-calponin, CNN2)抗体主要见于HCC病人,但是对HCC患者血清中SMP30、CNN2蛋白水平的检测目前没有报道。同时已有大量报道称高尔基体糖蛋白(Golgi protein-73, GP73)对肝癌的检出率比较高且与AFP有很好的互补性。研究目的：探讨血清SMP30、CNN2、GP73蛋白含量对HCC的诊断价值及分析叁种蛋白和AFP联合检测对HCC诊断的临床意义,为HCC诊断提供更好的选择。研究方法：利用本课题组构建并保存于-80℃的基因工程菌BL21-pET30a-SMP30、BL21-pCold Ⅲ-CNN2表达纯化得到高纯度的SMP30蛋白和CNN2蛋白,并以此作为标准蛋白,分别建立双抗体夹心ELISA,同时购买Gp73检测试剂盒，检测原发性肝癌患者、慢性乙肝患者、慢性乙肝携带者、肝硬化患者及正常人血清中SMP30、CNN2、GP73蛋白含量。研究结果：1.表达纯化的SMP30浓度为0.6mg/mL,纯度为92.82%,双抗体夹心ELISA包被抗体(兔抗人SMP30多克隆抗体)、检测抗体一抗(鼠抗人SMP30单克隆抗体)以及酶标二抗(羊抗鼠1g G-HRP)的最佳工作稀释比例分别为1：200,1：400,1：5000,血清最佳稀释比例为1：5,标准曲线的回归方程为：y=1.673x+0.025,R2=0.996,P<0.001,标准蛋白在3.6～500ng/mL之间有很好的的剂量效应关系。批内和指间变异系数分别为8%和12%。HCC组、肝炎组、健康组的阳性率分别为8.4%(21/250)、0.6%(1/170)、1.4%(3/217),HCC阳性率高于肝炎组(P<0.001)和健康组(P=0.001),尚不能认为肝炎组和健康组的阳性率有差别(P=0.795)HCC组血清标本SMP30蛋白含量明显高于正常对照组(P=0.002)和肝炎组(P=0.001),正常对照组与肝炎组差异无统计学意义(P=0.503)。该方法的敏感度为8.4%,特异度为98.86%。血清中SMP30蛋白含量与HCC患者的年龄、AFP含量、肝功能、肿瘤大小、临床分期、肿瘤病理等临床指标无显着性相关。2.双抗体夹心ELISA包被抗体(羊抗人CNN2多克隆抗体)、检测抗体一抗(兔抗人CNN2多克隆抗体)以及酶标二抗(羊抗兔1g G-HRP)的最佳工作稀释比例分别为1：200,1：2000,1：5000,血清最佳稀释比例为1：10。检测结果,HCC组、健康组和肝炎组的阳性率分别为2.1%(3/143)、2.8%(6/217)和2.4%(4/170)。叁组的CNN2蛋白含量差异无统计学意义。该方法的敏感度为2.4%,特异度为97.2%。血清中CNN2蛋白含量与临床指标之间尚不能确定有关。3.血清GP73蛋白水平在HCC、肝硬化、慢性乙肝、慢性乙肝携带者、健康人分别为88.09±64.13、184.20±88.70、149.53±89.76、39.32±8.99和25.27±12.221(ng/mL)。健康组中,血清GP73蛋白水平在不同性别中没有差别(P=0.819)；HCC组中,男患者血清GP73蛋白水平高于女患者(P=0.001),有肝硬化的患者高于无肝硬化的患者(P=0.002),肿瘤直径>3cm的患者高于肿瘤直径<3cm的患者(P=0.020)。GP73诊断HCC的临界值为61.93ng/mL,特异度为98.56%,灵敏度为56.93%。4.多个HCC相关抗原同时检测可以显着提高HCC的检出率。联合检测价值最高的组合为AFP+GP73,阳性率为82.35%。结论：1.成功建立了双抗体夹心ELISA检测人血清SMP30蛋白,所建立的ELISA方法,批内批间差异和稳定性均满足实验要求。HCC血清SMP30检出率大于健康组和肝炎组,提示SMP30有望成为一种新的肝癌血清标志物。2.HCC血清CNN2水平与健康组和肝炎组没有差别,尚不能用作肝癌血清标志物。3.GP73是一种敏感度和特异度都很好的肝癌血清标志物,可以和AFP媲美。4.联合检测可以有效减少AFP阴性的肝癌的漏诊率,提高肝癌的检出率。
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[4]. SMP30在肝细胞癌发展过程中的作用机制研究[D]. 张胜昌. 广西医科大学. 2013
[5]. 分子伴侣促进SMP30蛋白可溶性表达及表达蛋白在HCC血清检测中的作用[D]. 黄朋. 广西医科大学. 2012
[6]. 衰老标记蛋白30 mRNA在癌细胞中的表达研究[J]. 李晓龙, 康飞科, 雷鸣, 蒋玲玉, 林朝群. 生物技术通讯. 2010
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[8]. 衰老标记蛋白SMP-30mRNA在肝细胞癌中的表达研究[D]. 侯刚强. 广西医科大学. 2006
[9]. SMP30及CaM在正常人及不同年龄白内障患者晶状体上皮细胞中的表达研究[D]. 赖伟霞. 广西医科大学. 2014
[10]. SMP30、CNN2与GP73叁种HCC相关抗原对肝细胞性肝癌诊断价值的研究[D]. 龙家敏. 广西医科大学. 2015
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