辽宁中医药大学附属医院，110003
【摘要】目的:探讨氨茶碱对过敏性哮喘患者T淋巴细胞亚群自噬的影响。方法：选取2015年9月~2016年9月我院收治的28例过敏性哮喘患者为本研究观察组，同期选取19例体检健康者为对照组，采集所有受试者外周血，分离T淋巴细胞亚群CD8+T、CD4+T以及CD4+CD25+T细胞，观察组细胞分组给予不同浓度氨茶碱(10-3mol?L-1、10-4mol?L-1、10-5mol?L-1、10-6mol?L-1、10-7mol?L-1)进行培养，对照组细胞不做处理，培养72h后观察各组细胞自噬形态改变情况，经丹酰戊二胺(MDC)染色后，采用流式细胞仪检测细胞自噬水平。结果：观察组与对照组T淋巴细胞纯度及亚群细胞纯度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；氨茶碱处理后细胞出现典型自噬形态学改变；10-3mol?L-1、10-4mol?L-1、10-5mol?L-1氨茶碱处理组CD4+CD25+T细胞自噬率明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；10-5mol?L-1氨茶碱处理组CD4+CD25+T细胞自噬率随时间延长呈现明显升高趋势(P＜0.05)。结论：氨茶碱诱导过敏性哮喘患者CD4+CD25+T淋巴细胞亚群自噬水平升高可能是其发挥治疗哮喘作用的机制之一。
【关键词】氨茶碱；过敏性哮喘；T淋巴细胞亚群；自噬
邮寄地址：110003 辽宁省沈阳市和平区光荣街5号 中国人民解放军第二0二医院
过敏性哮喘是临床上比较常见的顽固性慢性气管炎症，临床以反复性喘息、胸闷、气促等为主要症状[1]。近年来，我国过敏性哮喘发病率呈现出明显上升趋势，已成为严重威胁我国公民健康的主要慢性疾病之一[2]。茶碱类药物是目前过敏性哮喘的主要治疗性药物[3]。本研究旨在探讨氨茶碱对过敏性哮喘患者T淋巴细胞亚群自噬的影响，进一步了解氨茶碱治疗过敏性哮喘药理机制，为临床应用提供一定的理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2015年9月~2016年9月我院收治的28例过敏性哮喘患者为本研究观察组，所有患者均为符合全球哮喘防治创议(GINA)(2014)[4]及我国哮喘防治指南(2013)[5]中支气管哮喘诊断标准，且经皮肤点刺试验证实为过敏性哮喘者。其中男性13例，女性15例，年龄20~68岁，平均年龄46.42±4.37岁。
纳入标准：①年龄≥18岁，性别不限者；②符合GINA及我国哮喘诊治指南中支气管哮喘诊断标准，且经皮肤点刺试验证实为过敏性哮喘者；③病情稳定并持续1个月者；④近3月内无糖皮质激素药物及其他免疫抑制剂治疗史；⑤了解本研究，并同意签署知情同意书者。排除标准：①排除近1个月内发生呼吸道感染者；②排除怀孕及哺乳期妇女；③排除伴有其他系统慢性疾病者；④排除伴有肝脏、肾脏、肿瘤等严重疾病者。
同期选取19例体检健康肺功能正常者为对照组，皮肤点刺试验阴性，其中男性8例，女性11例，年龄18~48岁，平均年龄27.31±4.28岁。两组患者年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义。本研究经本院伦理委员会批准进行。
1.2主要试剂与仪器
注射用氨茶碱(0.125g?mL-1, 批号：070402)，购自于广州白云山制药厂；RPMI-1640完全培养基，购自于杭州吉诺生物医药技术有限公司；小牛血清购自杭州四季青公司；丹酰戊二胺(Monodansylcadaverin, MDC)、T淋巴细胞分离试剂盒，均购自于Sigma公司；CD8+T、CD4+T细胞纯化抗体，购自于美国Becton Dickinson公司；淋巴细胞分离液(1.073g?mL-1)，购自于上海恒信试剂公司；FACSCalibur流式细胞仪，购自于美国Becton Dickinson公司；Zeiss Axioskop 2 plus荧光显微镜，购自于德国Zeiss公司。
1.3 方法
1.3.1 T淋巴细胞的分离、鉴定及分组培养
无菌采集所有受试者外周静脉血10mL，分离并洗涤外周血单核细胞，采用尼龙棉柱法分离T淋巴细胞，加入各纯化抗体分离T淋巴细胞亚群CD8+T、CD4+T以及CD4+CD25+T细胞，具体操作严格按照试剂盒使用说明，采用流式细胞仪鉴定CD8+T、CD4+T以及CD4+CD25+T细胞纯度。
采用经不同浓度氨茶碱(0mol?L-1、10-3mol?L-1、10-4mol?L-1、10-5mol?L-1、10-6mol?L-1、10-7mol?L-1)预处理，24孔板RPMI-1640完全培养基(调整每孔细胞数为5x105个)培养细胞，观察培养72h。
1.3.2 MDC染色后荧光显微镜观察
取100?L细胞悬浮液，经MDC染液处理后，37℃孵育1h，取细胞悬浮液滴片，盖上盖玻片后，与荧光显微镜下观察镜检。
1.3.3 流式细胞仪检测
经MDC染液处理后，利用流式细胞仪检测细胞自噬水平，于FSC-SSC点图设置矩形门R1，排除细胞碎屑，再作FSC-SSC点图，以0h时右侧象限3%细胞设置矩形门R2，复制R2于24h、48h、72h点图中，统计记录R2阳性率改变情况。具体操作严格按照仪器使用说明。
1.4 统计学分析
利用统计学软件SPSS 19.0进行统计学分析，统计数据均用均数+标准差表示，两两比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组T淋巴细胞及亚群纯度比较
观察组与对照组T淋巴细胞纯度、CD8+T纯度、CD4+T纯度、CD4+CD25+T纯度及CD4+CD25+Treg占CD4+T比例比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。具体结果见表1。
表1 两组T淋巴细胞及亚群纯度比较
3 讨论
过敏性哮喘是在致敏原作用下，由机体淋巴细胞、肥大细胞及嗜酸性粒细胞等多种炎性因子参与而导致的一种慢性呼吸系统炎症[6]。近年来，过敏性哮喘在我国的发生率大有增长趋势，严重威胁了我国居民的身体健康。研究表明[7]，免疫功能紊乱在过敏性哮喘发病中起重要作用，T淋巴细胞活化以及各种炎性细胞因子分泌是过敏性哮喘发病的中心环节，也是导致疾病难以控制的主要原因之一。
综上所述，本研究结果表明，氨茶碱可诱导过敏性哮喘患者CD4+CD25+T淋巴细胞亚群自噬水平升高，推测其是氨茶碱治疗过敏性哮喘、调节机体免疫功能的作用机制之一，本研究仍存在样本量较少等不足之处，其具体作用机制还有待进一步扩大样本量深入研究。
参考文献
[1]肖仁. 过敏性哮喘与非过敏性哮喘的临床特征[D].成都中医药大学,2015.
[2]孙慧媛,孙瑞华,张秀艳,等. 基于临床流行病学的支气管哮喘慢性持续期证候特征研究[J]. 中华中医药杂志,2016,31(11):4494-4498.
[3]赵娴. 采用茶碱类药物治疗哮喘的临床效果[J]. 临床医学研究与实践,2016,1(23):70-71.
[4]何权瀛. 2014年全球哮喘防治创议(GINA)简介[J]. 浙江医学,2014,19:1588-1600.
[5]林江涛,祝墡珠,王家骥,等. 中国支气管哮喘防治指南(基层版)[J]. 中国实用内科杂志,2013,33(08):615-622.
论文作者:李全生,张东伟
论文发表刊物:《医师在线》2017年4月上第7期
论文发表时间:2017/6/12
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