（西安市西电集团医院 陕西 西安 710077）
【摘 要】目的：探讨γ－维生素E抗哮喘的作用及机制。方法：将40只雄性小鼠随机分为正常组、哮喘组、治疗组，治疗组包括地塞米松组及γ-维生素E组(γ-T组)。给予小鼠腹腔注射及雾化吸入卵蛋白（OVA）建立哮喘气道炎症反应模型，记数小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及嗜酸性粒细胞百分比，酶联免疫吸附（ELISA）法测定小鼠全血和BALF中白介素-4（IL-4）。用ANOVA检验组间差异，探讨γ-维生素E抗哮喘的作用及可能的作用机制。结果：1.与哮喘组相比，治疗组小鼠BALF中白细胞总数及EOS均明显下降，差距具有统计学意义(P＜0.01)；2.治疗组间比较白细胞总数、EOS百分比差异无统计学意义(P＞0.05)；3. 与空白对照组比较，哮喘组小鼠血清及BALF中IL-4浓度均显著升高（P<0.01）；与哮喘组比较，地塞米松组及γ－T组小鼠血清及BALF中IL-4浓度显著降低（P<0.01）。4. γ-T组及地塞米松组小鼠肺叶局部炎症反应均较哮喘模型组轻。结论：1.使用OVA联合佐剂氢氧化铝可成功建立小鼠肺部变态反应性模型。2.γ-维生素E可通过降低肺泡EOS浸润，减少IL-4生成使小鼠哮喘发作症状轻微，肺部变态反应性炎症程度减轻，治疗效果类似于地塞米松。
【关键词】γ-维生素E；哮喘；嗜酸性粒细胞；IL-4
【中图分类号】R256.12 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）6-0480-02
支气管哮喘是一种以嗜酸性粒细胞为主的众多炎症细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病，支气管黏膜内增加的EOS是其中一条主要标志。支气管肺泡灌洗液中查见嗜EOS增多能为疾病的诊断、治疗提供可靠的依据，并能监测治疗效果。随着社会和环境的发展，越来越多的研究认为哮喘与人类进食的营养素的缺乏或比例失调有关。其中脂溶性维生素E获得了极大的关注[1-3]。维生素E按甲基位置分为α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ生育三系酚。不同维生素E的异构体，其作用也不同[4]。其中γ-生育酚(γ-T)被认为与哮喘密切相关[5]。γ-T和它的代谢产物与花生四烯酸(AA)竞争COX-2的活性部位，特异性抑制环氧化酶(COX-2)，导致花生酸类物质减少[6]；减少前列腺素(PGE2)，白三烯(LTB4)和肿瘤坏死因子的释放等[7-8]。本实验旨在利用卵白蛋白（OVA）联合氢氧化铝凝胶激发构建哮喘小鼠气道炎症反应模型，用γ-T干预，探讨γ-T对哮喘后气道炎症程度、炎症细胞嗜酸性粒细胞（EOS）、炎性因子IL-4的影响，为γ-T应用于临床提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 动物与分组
4周龄健康小鼠40只（SPF级，雄性，体重18-20g），由西安交通大学实验动物中心提供，SPF级饲养。随机分为4组：哮喘组、正常对照组、治疗组，治疗组包括地塞米松组、γ-T组，每组10只。
1.2 试剂、器材和药物
OVA为美国Sigma公司产品；氢氧化铝凝胶为上海美兴化工股份有限公司产品；γ－T购自美国Sigma公司，纯化度95%；IL-4 ELISA试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司，批号：20140601A；地塞米松磷酸钠为河南润弘制药股份有限公司产品；食用玉米油，为中粮北海粮油工业（天津）有限公司产品；超声雾化器、常温及低温离心机等。
1.3 造模及给药
哮喘组及治疗组分别于第0、7、14天腹腔注射0.5mL致敏液（含OVA 10 μg＋氢氧化铝凝胶2 mg）进行致敏；第21天开始激发，将小鼠置于自制密闭箱内，给予雾化吸入25g/L的OVA溶液30 min，每日雾化1次，同时给予0.1mL玉米油灌胃，连续7天；γ－T组以上述同样的方法用OVA进行致敏和激发小鼠，并在每次激发前1 h分别予以灌胃2 mgγ－T及0.1mL玉米油；地塞米松组则在每次激发前1 h分别予以腹腔注射地塞米松0.1mg及0.1mL玉米油灌胃；正常对照组则用等量生理盐水代替OVA进行腹腔注射和雾化吸入。
1.4 小鼠BALF中白细胞和EOS记数
末次激发后24h内处死动物，迅速行支气管肺泡灌洗术：小鼠取仰卧位，75%酒精消毒，用蚊式钳和眼科剪剪开皮肤和皮下组织，游离气管，使用5ml注射器针头进行气管插管，丝线固定，分离肺组织，结扎左主支气管，对右肺进行灌洗。插管成功后用500 ?l/次预冷的PBS灌洗两次，收集灌洗液，回收率约80%。4℃，1500rpm，离心6min，收集BALF，PBS重悬BALF细胞沉渣，计数，计算每毫升细胞数；Wright-Gimsa染色少许重悬液涂片，显微镜下观察细胞形态，对细胞进行分类，计算嗜酸性粒细胞百分比。
1.5 小鼠血清及BALF中IL-4含量测定
末次激发后24h内处死动物，下腔静脉取血约0.5mL，常温离心留取血清保存于-70℃冰箱待测；生理盐水0.3mL灌洗右肺3次并收集BALF，低温离心后上清液保存于-70℃冰箱，采用ELISA法测定各组血清及BALF中IL-4的浓度。
1.6 小鼠肺组织病理学检测
取各组未经支气管肺泡灌洗的另一半小鼠肺组织，排空肺内气体，用10%甲醛溶液固定过夜。经脱水透明处理、浸蜡、石蜡包埋、切片与贴片等一些列处理后，再脱蜡行HE染色切片。光镜下观察肺组织切片炎症浸润、水肿及气道上皮损伤情况留取小鼠肺组织。根据Underwood的标准对小气道和小血管周围的炎症进行病理评分。
表1 Underwood的变应原激发肺部炎症改变的组织病理学评
1.7 统计学方法
各组实验数据以 表示，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。用one-way ANOVA检验组间差异，当方差齐性时，用SNK-q检验进行两两间比较；当方差不齐时，采用Dunnett＇s c(U)检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组激发后哮喘发作情况
哮喘组在激发后30 min内发作，哮喘组小鼠出现口唇发绀、呼吸急促，腹部翕动，烦躁不安，活动频繁，少动等表现，而γ－T干预组发作程度轻，地塞米松组发作程度最轻。正常组小鼠行动敏捷，未见异常。
2.2 肺组织病理学改变
与正常组相比，哮喘组小鼠气道壁及气道平滑肌明显增厚，肺脏小支气管血管外可见大量炎性细胞浸润，主要以单核及嗜酸性细胞为主，肺脏小支气管粘膜层杯状细胞增生。地塞米松可明显减轻炎性细胞的渗出并抑制杯状细胞增生。γ-T的干预亦部分逆转了上述炎性改变，肺脏小支气管外可见少量炎性细胞浸润，小支气管粘膜层杯状细胞增生减轻。见图、表2。
表4 γ－T对小鼠血清及BALF中IL-4的影响（ )
组别n血清(pg?mL-1)BALF（pg?mL-1）
空白组109.98±2.3614.44±1.64
哮喘组1034.22±2.40▼▼34.08±2.62▼▼
地塞米松组1021.00±2.03**22.60±1.75**
γ－T组1019.10±1.55**24.12±2.39**
注：与空白对照组比较▼P<0.05 ▼▼P<0.01；与模型组比较*P<0.05 **P<0.01
3 讨论
支气管哮喘是一种以嗜酸性粒细胞为主的众多炎症细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病，其发病率呈逐年上升趋势，严重威胁着公众健康。其中EOS浸润被认为是哮喘炎症的特征性标志，是气道炎症的中心环节[10]。支气管哮喘的其中一个重要标志是支气管黏膜内增加的EOS[11]。EOS主要存在于组织中，正常支气管肺泡灌洗液中EOS比例低于1%[12]。而支气管肺泡灌洗液中查见嗜EOS增多能疾病的诊断、治疗提供可靠的依据，并能监测治疗效果。有研究发现，哮喘患者发作期血中及支气管肺泡灌洗液中EOS数量明显增高，经治疗后,伴随着症状和体征的改善，EOS的数量亦明显下降[13]，EOS可以通过释放颗粒蛋白、白三烯和血小板激活因子等细胞因子导致支气管收缩、粘液分泌及血管通透性增加等一系列炎症反应,进而导致气道损伤、反应性增加和哮喘发作。
IL-4是一种多效性细胞因子，在人体内IL-4可由多种细胞如CD4+Ｔ细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞等激活后表达和释放，其在细胞因子网络中居于中心地位。哮喘的发病机制主要有：气道炎症，免疫反应，神经机制，气道高反应性和遗传因素等，具体机制尚不明确[14]。目前认为，免疫因素中Th1/Th2免疫应答失衡在哮喘的发展和持续中发挥重要作用，哮喘发作时Th2型免疫应答占优势，此时Th0向Th2分化增多。Th2细胞可分泌多种促炎介质，如白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-10和IL-13等，这些细胞因子可活化B淋巴细胞，进而促进特异性IgE合成、肥大细胞和嗜碱性粒细胞分化、杯状细胞高分泌和支气管高反应性等[15]， IL-4与哮喘患者慢性气道炎症的产生和维持也有密切关系[11]。IL-4是Th1/Th2分泌的炎症促进因子，能诱导Th0转化为Th2，同时促进Th2分泌IL-5、IL-8、IL-12、IL-13和炎症促进因子，间接抑制Th1分泌IFN、IL-12等炎症抑制因子，存在着Th2优势的免疫应答，如果能逆转其失衡状态促使Th1/Th2免疫应答的动态平衡将有利于哮喘的预防和治疗[16]
研究显示γ-T与支气管哮喘有紧密联系，γ-T的代谢产物可以竞争性抑制花生四烯酸(AA) COX-2的活性部位，导致花生酸类物质、前列腺素(PGE2)，LTB4生成减少[6-8]。本研究通过γ-T干预OVA诱导的哮喘小鼠模型，发现γ-T干预可以明显降低小鼠哮喘急性发作程度及气道炎症程度，降低肺泡灌洗液中EOS含量及血清中IL-4水平，效果与地塞米松作用相当。提示γ-T通过降低肺组织局部EOS浸润和IL-4水平，从而减轻肺组织局部炎性反应及组织损伤，抑制哮喘急性发作期的气道炎症反应。另一方面γ-T通过降低IL-4的含量逆转Th1/Th2免疫应答失衡状态从而有利于哮喘的预防和治疗。
参考文献：
[1]Allen s,Britton JR,Leonardi-Bee JA.Association between antioxidant vitamins and asthma outcome measurees:systematic review and mata-analysis［J］．Thorax,2009,64(7)：610-619.
[2]Al Abdulla NO,Naama LM,Hassan MK.An tiooxdant status in acute asthmatic in children[J].J Pak Med Assoc,2010,60(12):1023-1027
[3]Turner SW,Campbell D,Smith N.\Associations between fetal size maternal{alpha}-tocopherol and childhood asthma[J].Thorax,2010,65(5):391-397.
[4]刘艳，尚云晓．维生素E与儿童支气管哮喘关系研究进展[J].中国儿童保健杂志,2012,20(6):525-259．
[5]Wagner KH,Kamal-Eldin A,Elmadfa I.Gama-tocopherolan under estimated vitamin[J].Ann Nutr Metab,2004,48:169-188.
[6]Jiang Q，Ames BN. Gamma-tocopherol，but not Alpha-tocopherol, decreases proinflammatory eicosanoids and inflammation damage in rats[J].FASEB J,2003,17:816-822
[7]Wister J,Alexis NE, Jiang Q. In vivo gamma-tocopherol supplementation decreases systemic oxidative stress an dcytokine responses of human monocytes in normal and asthmatic subjects[J]. Free Radic Biol Med, 2008, 45(1):40-49.
[8]Dworski R, Han W, Blackwell TS. Vitamin E Prevents NRF2 suppression by allergens in asthmatic alveolar macrophages in vivo[J]. Free Radic Biol Med, 2011, 51(2):516-521.
[9]Underwood S, Foster M, Raeburn D, et al. Time-course of antigen-induced airway inflammation in the guinea-pig and its relationship to airway hyperresponsiveness[J]. European Respiratory Journal, 1995, 8 (12): 2104-2113.
[10]潘丰满，张德新.止哮平喘对大鼠全血和支气管肺泡灌洗液中EOS的影响[J].四川中医，2014,32(5)
[11]齐丽,王燕.白介素5与支气管哮喘[J].国际呼吸杂志2007,27(24):1889一1891
[12]Papakosta D,Manika K,et al. Bronchalveolar lavage fluid eosinphils are correlated to natural killer cells in eosinophilic pneumonias [J].International Review of Thoracic Diseases,2009,78(2):177.
[13]蔡望喜.麻藤四子汤对哮喘幼儿血清EOS调节的观察与分析[J〕.浙江中医药大学学报,2008,32(4):461一462
[14]陆在英, 钟南山. 内科学第七版. 北京: 人民卫生出版社, 2008.
[15]杨学敏,史海广,成家军,等.白介素在支气管哮喘发病机制中的作用及其靶向治疗研究[J].中华哮喘杂志,2011,5(2):112-116.
[16]冯喜英,赵丽萍,关巍.辛伐他汀对哮喘模型大鼠血清IL-4、IFN水平影响的实验研究[J].中华哮喘杂志,2012,6(5):334-337.
论文作者:吴艳梅,张莉莉,张晓艳,张卓红,薛智文
论文发表刊物:《河南中医》2015年6月供稿
论文发表时间:2015/10/16
标签：哮喘论文; 小鼠论文; 炎症论文; 支气管论文; 肺泡论文; 细胞论文; 气道论文; 《河南中医》2015年6月供稿论文;