马祖伟[1]2003年在《聚乳酸软骨组织工程支架制备、改性及其细胞相容性研究》文中研究指明研究了聚-L-乳酸(PLLA)软骨组织工程支架的制备、改性及细胞相容性。首先以PLLA平面膜为研究模型，研究了亲水性单体在PLLA表面的接枝聚合、生物大分子在PLLA平面膜表面的化学接枝和涂层、生长因子在PLLA平面膜表面的引入。以致孔剂法和热致相分离法制备了PLLA多孔支架。最后将PLLA平面膜的表面改性技术应用于PLLA多孔支架的改性，制备了具有良好细胞相容性的软骨组织工程用可降解多孔支架。 采用过氧化氢溶液中紫外光氧化的方法在PLLA膜表面引入了大分子过氧化氢基团。采用碘量法测定了PLLA膜表面大分子过氧化氢基团的浓度，并考察了氧化时间和氧化温度的影响。随氧化时间延长，大分子过氧化氢基团的浓度先升后降。氧化温度升高能够加快氧化过程的进行。 利用光氧化后PLLA膜表面的大分子过氧化氢基团作为自由基接枝聚合的引发剂，采用紫外光引发或Fe~(2+)辅助引发的方式，引发了亲水性单体甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、丙烯酰胺(AAm)或甲基丙烯酸(MAA)在PLLA膜表面的接枝聚合，从而将羟基、酰氨基或羧基引入材料表面。ATR-IR和XPS测试结果证明了接枝聚合的发生。接触角测试结果表明改性后PLLA膜表面的亲水性明显提高。采用ATR-IR、XPS和比色法表征了PLLA膜表面亲水性聚合物的接枝量，结果表明接枝量随单体浓度的提高和接枝时间的延长而增大。采用SEM和SFM考察了改性前后材料表面形貌的变化，结果表明接枝改性使得材料表面的粗糙度增大。与紫外光引发接枝聚合所得到的PLLA改性膜相比，由Fe~(2+)辅助引发接枝聚合所得到的PLLA改性膜表面的亲水性聚合物的分布更为均匀，表面粗糙度较低。 采用软骨细胞培养考察了接枝改性对材料细胞相容性的影响。材料表面亲水性官能团的引入没有明显提高细胞的粘附率和增殖率，但却对细胞的铺展性能有重要影响。通过改变单体浓度和接枝时间，制备了一系列不同接枝量的PLLA-g-PAAm和PLLA-g-PMAA平面膜，并考察了材料表面不同的官能团以及材料表面的亲水性对细胞铺展性能的影响。结果表明细胞只有在适度亲水性的表面才有良好的铺展性能，呈多角状；而在较高疏水性或较高亲水性的表面细胞主要呈球形并团聚成细胞团。官能团的种类以及表面电荷对细胞的铺展性也有重要影响。 为了将生物大分子化学接枝于PLLA膜表面，首先在PLLA膜表面接枝PMAA，将羧基引入PLLA表面，利用水溶性碳化二亚胺EDAC作为缩合剂，与含有氨基的生物大分子反应，可将生物大分子如明胶、胶原和壳聚糖化学接枝在PLLA膜表面。ATR-IR、XPS和茚叁酮测试结果均证明了接枝的发生，但也表明一生物大分子的接枝量较小（q卜g／cm勺。为了提高材料表面生物大分子的含量，在化学接枝生物大分子后的PLLA表面进一步涂层生物大分子溶液。采用PBS中浸洗的方法研究了生物大分子涂层的稳定性，结果表明胶原涂层和壳聚糖涂层具有良好的稳定性。软骨细胞培养结果表明明胶涂层或胶原涂层可明显提高细胞在PLLA膜表面的粘附率、增殖率、细胞活性和铺展性能。进一步利用“接枝－涂层”技术，将含有生长因子BMP或bFGF的胶原溶液涂层在PLLA膜表面，制备了含有生长因子的活性PLLA材料。软骨细胞培养结果表明BMP可明显提高单个细胞的MTT活性。bFGF虽然能够大大提高单个细胞的MTT活性，但不利于细胞的增殖。 分别利用腊球滤出法和热致相分离法制备了具有良好孔连通性的PLLA多孔支架材料。对于腊球滤出法，研究了腊球直径、腊球用量和PLLA溶液浓度对多孔支架结构的影响。对于热致相分离法，研究了PLLA溶液浓度、溶剂组成、粗化时间、粗化温度对多孔支架结构的影响。通过控制适当的制备条件，可得到符合组织工程所要求的孔径在150上50仰，孔隙率大于90％的多孔支架。 利用抽真空然后恢复常压的办法将液体导入多孔支架内部，利用离心的办法将液体从支架内部去除，上述简单技术解抉了对多孔支架改性时的物质扩散难的问题，使得将PLLA平面膜的改性技术应用于PLLA多孔支架的改性成为可能。研究了采用h”辅助引发的方式在PLLA多孔支架内部表面接枝PAin和PMAA，与空白PLLA多孔支架相比，细胞在改性后的支架内部铺展良好、分布均匀。研究了明胶和胶原在多孔支架内部的接枝和涂层，利用苟叁酮法考察了多孔支架中的胶原或明胶的含量及其稳定性，结果表明多孔支架中的明胶和胶原涂层具有良好的稳定性。细胞在涂层明胶或胶原的支架内部有优良的铺展性能。利用“接枝－涂层”技术将含有BMP或bFGF的胶原涂层在多孔支架内部，制备了含有生长因子的活性多孔支架，活性支架中的细胞铺展良好，分布均匀，并有较高的MTT活性。利用激光共聚焦显微镜，研究了软骨细胞在多孔支架中的分布情况，在热致相分离法所制备的支架中，软骨细胞主要存在于孔的内壁表面，而在腊球法所制备的多孔支架中，软骨细胞不仅存在于孔壁表面，还大量存在于孔壁内部的微孔之中。
龚逸鸿[2]2006年在《聚乳酸多孔支架的制备、改性及组织工程化软骨的构建》文中认为本文研究了聚-L-乳酸(PLLA)软骨组织工程支架的制备、改性及生物相容性。利用热致相分离法和明胶致孔剂法制备了具有叁维多孔、高连通性PLLA多孔支架材料。通过层层自组装技术、明胶成孔剂原位改性技术及水凝胶填充技术对支架进行了改性以提高其生物相容性。将改性后的支架植入裸鼠皮下研究支架对于软骨再生的作用。利用传统的相分离法制备了孔径从几微米到150微米变化的PLLA支架。支架的孔径和孔隙率均可以通过调节粗化条件进行控制。通过改进的多步相分离法可以制备孔径大于300微米的大孔支架。多步相分离法和传统方法区别在于其方分离的过程存在差异，相区增长的区域不同。传统的相分离法，随着分相时间的延长，相区不断增长，孔径增大，但相区之间变得愈发孤立。而多步相分离法则是在体系分相一段时间后，再次降低体系的温度，使得新的相分离在原聚合物富相再次发生，随着新形成的聚合物贫相区增大，使得原有相对孤立的聚合物贫相区再次连通，孔径和孔连通性也随着提高。通过电镜和明胶、胶原等大分子物质导入实验也证明了上述结果。利用明胶微球或无规微粒为致孔剂的方法也制备了高连通性、孔形状为球形或无规的PLLA支架。通过乙醇溶液或高温饱和水蒸气，可将明胶微球或微粒相互粘接，再加入PLLA溶液，经冻干或室温下干燥去除溶剂，最后以热水洗去致孔剂明胶即可得到叁维的PLLA支架。支架的微结构、连通性可以通过致孔剂进行调控。压缩测试表明冻干支架具有比热干支架更大的机械强度。随着聚合物溶液浓度的提高，支架的孔隙率下降，而机械强度增大。通过层层自组装技术将I型胶原和硫酸软骨素固定到PLLA表面，以提高其生物相容性。通过表面胺解技术使PLLA表面带有正电荷，再通过层层自组装技术将两种分子固定到材料表面。通过紫外光谱跟踪并证明了整个组装过程。软骨细胞培养证明经过层层自组装改性的支架具有更好细胞相容性，如有更高的细胞黏附率，增值率和细胞活性，以及铺展的细胞形态。利用明胶致孔剂可以对PLLA支架进行表面修饰，该过程是在多孔材料制备过程中一次性完成的。以传统致孔剂NaCl微粒制备的PLLA多孔支架作为对照，进行体外细胞培养。结果表明，由于生物大分子明胶的存在，以明胶致孔剂制备的多孔支架具有更好的细胞相容性。以激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜可见更多的软骨细胞。细胞呈铺展状态且有更高的细胞活性和更多的糖胺多糖(GAG)分泌。多孔的聚合物材料及水凝胶均被软骨组织工程所大量使用，两种材料均各有优缺点。为了将这两种材料的优点整合，获得综合性能优异的软骨再生材料，本文发展了水凝胶填充技术对PLLA支架进行改性。将能够维持软骨细胞正常功能的琼脂溶胶导入热致相分离法制备的支架中，考察了导入后支架的各种性能。通过导入水凝胶，支架的力学性能得到了提高。通过扫描电子显微镜及激光共聚焦显微镜的观察发现，体外培养7～14天后，软骨细胞在复合体系中呈天然的球形。并且软骨细胞的细胞活性，胶原和GAG分泌的水平相比未填充琼脂的材料均有更大的提高。同时这种材料还有进一步改性的潜能，可以根据需要，添加水溶性的生物大分子材料，例如明胶，可以进一步提高复合物的生物相容性。最后，对上述几种PLLA多孔材料制备及改性的方法进行了比较，从中挑选了水凝胶填充支架和明胶致孔剂法制备的支架作为动物实验的材料。在裸鼠皮下埋植了4周后，水凝胶填充支架可以保持原有的外形，组织化学染色和组织化学分析表明复合物有更高的胶原GAG分泌，同时可以维持软骨细胞的正常表型。在明胶致孔剂法制备的支架的体内实验中，皮下埋植30天后，有类似于软骨状的组织生成，组织化学染色和组织化学分析也表明在该支架中有理想的胶原GAG分泌。这些结果表明该支架在软骨组织工程中有着很好的应用前景。
陈达[3]2004年在《功能微球改性聚乳酸组织工程材料及其细胞相容性研究》文中指出聚乳酸作为应用广泛的组织工程材料具有优良的物理机械性能和良好的生物可降解性，但其生物相容性还有待进一步改善。另一方面，聚合物微球具有简便的制备工艺、可控的粒径大小以及优异的表面性质等特征，因此在众多领域得到了广泛的应用。本文针对聚乳酸组织工程材料存在的生物相容性问题以及聚合物微球的优异性能，从一种新的设计手段出发，采用聚合物微球表面改性聚乳酸组织工程材料，构建得到功能微球改性聚乳酸组织工程材料表面，并研究改性后的聚乳酸组织工程材料表面的细胞相容性。 采用o／w乳液溶剂挥发法以不同的物质作为微球制备过程中的表面稳定剂，低分子量的聚乳酸作为成核材料，制备得到具有不同表面性质的微米级或纳米级的核壳型聚合物微球。激光共聚焦显微镜(CLSM)和原子力显微镜(AFM)观察分析结果证实可通过上述技术获得具有不同表面性质的微米级或纳米级聚合物微球，而荧光标记技术(FITC)则证实了聚合物微球具有明显的核壳型结构，表面稳定剂存在于微球的壳层。 采用表面截留法将具有不同表面性质的微米级聚合物微球结合到聚乳酸组织工程材料表面，构建得到功能微球改性聚乳酸组织工程材料表面。扫描电镜(SEM)、激光共聚焦显微镜(CLSM)以及稳定性测试分析结果反映出采用表面截留法能成功制备得到具有不同表面性质的功能微球改性聚乳酸组织工程材料表面。不同表面性质的聚乳酸组织工程材料微球化表面的细胞相容性测试结果说明：正电荷性质的聚乳酸微球化表面的细胞相容性要好于负电荷性质或中性的聚乳酸微球化表面，而且其细胞相容性改善程度与表面正电荷的分布密度相关，适当的正电荷分布密度能最有效地改善材料表面的细胞相容性；聚乳酸组织工程材料表面经表面含氨基酸(或多肽RGD)的功能微球改性后，细胞相容性能在一定程度上得到改善，而且改善程度与氨基酸(或多肽RGD)的种类相关，其中赖氨酸和多肽RGD的改善效果更为明显，尤其是多肽RGD的改善效果最佳。 采用静电自组装法将明胶纳米微球或壳聚糖纳米微球结合到聚乳酸组织工程材料表面，构建得到聚乳酸组织工程材料纳米微球化表面。原子力显微镜(AFM)和接触角测试分析结果说明采用静电自组装法可以成功制备得到具有不同表面性质的纳米微球改性聚乳酸组织工程材料表面。聚乳酸纳米微球化表面的细胞相容性测试结果说明：聚乳酸组织工程材料表面经明胶纳米微球或壳聚糖纳米微球改性后，细胞相容性能在很大程度上得到改善，而且明胶纳米微球的改善效果更为明显；明胶纳米微球改性聚乳酸组织工程材料表面的细胞相容性与明胶纳米微球在聚乳酸表面的分布密度相关，分布密度越大，细胞相容性越好。 本文结果反映出采用表面截留法或静电自组装法可以分别实现微米级或纳米级聚合物微球改性组织工程材料表面，为组织工程材料的表面改性提供了一种新的设计思路。
周庆亮[4]2005年在《聚乳酸软骨组织工程支架的制备、降解及细胞相容性研究》文中研究指明本文以聚-L-乳酸(PLLA)为原料,研究了多孔支架的制备、体外降解和软骨细胞的相容性。 采用致孔剂—溶剂淋洗的方法制备多孔支架。按传统方法将明胶颗粒、聚乳酸溶液共混,冻干制备的聚乳酸多孔支架,难以保证支架孔间的连通性和最佳的力学性能。而将明胶颗粒预湿,使颗粒相互粘结成型,然后滴加聚乳酸溶液,则可得到具有适当孔径、高孔隙率和较好孔间连通性的聚乳酸多孔支架。采用明胶颗粒预湿的手段,也可制备不对称结构的聚乳酸多孔支架,实现简单几何形状的多孔支架(如管状)的塑型。 采用了不同溶剂挥发方法(冻干法和热干法)去除聚乳酸的溶剂,并比较了所得支架的微观结构、表观密度、结晶度和力学性能。微观结构和结晶度的差别造成了两者的力学性能的差异,使得冻干法制备的支架具有更好的力学性能,有更好的应用前景。 采用不同浓度的聚乳酸溶液制备多孔支架,研究了溶液浓度的变化对支架的微观结构、表观密度、孔隙率和力学性能的影响。同时,考察了聚乳酸多孔支架中残留的明胶对支架力学性能的影响。结果表明,残留的明胶对多孔支架有增强作用;明胶残留越多,增强作用越明显。 将聚乳酸多孔支架切成小块,浸泡在37℃的PBS中,研究聚乳酸支架的体外降解行为。由于聚乳酸多孔支架中存在明胶,明胶的不断溶出导致多孔支架降解过程中吸水率先减小后增加;同时,使支架失重速度呈现初期较快,后期缓慢的特点。聚乳酸在37℃的PBS中遵循本体降解的机理,所以支架中聚乳酸分子量减小的速度远比多孔支架失重的速度快。聚乳酸降解产生的羧基会在支架中富集,产生自催化效应,加速了支架的降解,使支架产生大的缺陷。聚乳酸支架降解时间愈长,缺陷越大,支架的Tm也会不断降低,但结晶度相对升高。 最后,将明胶颗粒制备的聚乳酸多孔支架与氯化钠颗粒制备的聚乳酸多孔支架相比较,进行体外软骨细胞的培养,研究了明胶残留对软骨细胞相容性的影响。明胶为致孔剂的支架能更好地促进软骨细胞的黏附和增殖,表现为软骨细胞在明胶改性的支架中数量更多,分布更均匀,形态更为铺展,细胞的MTT活性更高,浙江大学硕士学位论文(2005)摘要GAG的分泌量更多。可见,与其它致孔剂不同,残留的明胶不仅没有任何副作用,相反能够对支架进行原位改性,从而有效地促进软骨细胞的生长与功能表达。关键词:聚乳酸,致孔剂一淋洗法,多孔支架,体外降解,细胞相容性,软骨,组织工程。
朱惠光[5]2003年在《聚乳酸组织工程材料的细胞相容性表面设计研究》文中研究表明本论文针对目前聚乳酸组织工程材料存在的细胞相容性问题，对聚乳酸材料进行了叁种不同类型的促细胞相容性表面设计与研究，并对促细胞相容性表面修饰的聚乳酸组织工程材料进行了软骨细胞和成骨细胞相容性测试。 两亲共聚物-氨基酸(RGD)杂化体原位自修饰构建聚乳酸细胞相容性表面的研究一本论文首先设计并合成了一类含疏水聚乳酸(PLA)链段和亲水聚氧乙烯(PEO)链段的两亲嵌段共聚物材料(PLA-PEO)，利用PEO链端的活性官能团羟基固定了促细胞粘附的氨基酸及整合素配体多肽片段RGD。采用简单的溶液共混-成膜法，获得了两亲共聚物表面自修饰的聚乳酸(PLA)组织工程材料。利用衰减全反射傅立叶转换红外光谱(ATR-FTIR)、X-射线光电子能谱(XPS)分析以及接触角测定对改性聚乳酸材料表面进行了表征。基于两亲共聚物在疏水高聚物材料内的自迁移和表面富集行为，在聚乳酸材料上构建了以PEO桥联氨基酸或整合素配体多肽片段的类细胞外基质表面。 在两亲共聚物-氨基酸(RGD)修饰的聚乳酸平面材料上的软骨细胞和成骨细胞相容性测试结果表明：以碱性氨基酸及RGD为活性端基的两亲共聚物改性聚乳酸体系，对细胞的粘附、生长及活性均有明显的促进作用。在该体系中，PEO的链长对细胞的粘附与生长也有重要的影响作用。本论文的实验结果在PEO链长为2000分子量时对软骨细胞的粘附与生长有最佳的作用。 采用基于水相体系的盐溶-沥出(salt-leaching)技术和两亲共聚物表面自富集行为有机结合，本文成功地获得了一种在叁维支架成型过程中原位自修饰获得PEO桥联氨基酸(RGD)表面的制备方法。该改性技术可显着提高聚乳酸支架的亲水性，尤其可显着提高聚乳酸支架的吸水能力，非常有利于叁维支架的细胞培养。激光共聚焦显微镜(CLSM)对荧光标记两亲共聚物修饰聚乳酸支架的研究表明，两亲共聚物材料确实在聚乳酸支架内表面形成了很大程度的富集。这种亲水表面不仅有利于细胞悬液和培养介质的进入，并可以通过PEO桥联的氨基酸(RGD)为细胞在叁维多孔支架内的生长提供类细胞外基质环境； 根据以上结果，本文对碱性氨基酸为PEO链端基的两亲共聚物-氨基酸类细胞外基质修饰的聚乳酸叁维支架进行了细胞相容性的测试。软骨细胞的蛋白质含量和细胞活性测试结果表明，软骨细胞在原位自修饰的聚乳酸叁维支架内有较强的分裂增殖能力和较高的细胞活性。扫描电镜和激光共聚焦显微镜的测试结果显示了软骨细胞在原 浙江大学博士学位论文（2003）位自修饰的聚乳酸叁维支架内部良好的粘附与生长情况。成骨细胞在原位自修饰聚乳酸叁维支架内的蛋白质含量、DNA含量和细胞活性测试结果表明，成骨细胞在原位自修饰的聚乳酸叁维支架内有较高的细胞活性和较强的分裂增殖能力。扫描电镜的分析结果显示了软骨细胞在原位自修饰的聚乳酸叁维支架内部良好的粘附与生长情况。该结果显示两亲共聚物－氨基酸杂化体原位自修饰聚乳酸组织工程支架材料具有良好的细胞亲和性。但本文成骨细胞碱性磷酸酶活性的测试结果表明两亲共聚物－氦基酸类细胞外基质修饰的聚乳酸材料对成骨细胞的分化没有明显的促进作用。 生物大分子截留洁构建聚乳酸细胞相容性表面的研究一本文通过将氨基酸（L－天冬氨酸。L－精氨酸、L。赖氨酸和卜苯丙氨酸）和天然聚多糖（海藻酸钠和壳聚糖）结合，设计了模拟细胞外基质组分的天然聚多糖．氨基酸衍生物。核磁氢谱厂HNMRX傅立叶转换红外光谱吓TIR）和紫外－苟叁酮（n讪吟drin－UV）的分析结果证实产物具有预期的结构。论文突破传统表面截留技术仅针对合成聚合物的局限，将其拓展到天然生物大分子一聚多糖及其氨基酸衍生物在聚乳酸组织工程材料的表面修饰中，构建了新型的细胞相容性表面。结合聚多糖的荧光标记技术，本文首次利用激光共聚焦显微镜研究并直接验证了表面截留区域的存在。利用该技术，测得生物大分子表面截留层的厚度为 10上0pm。对截留表面进行的衰减全反射傅立叶转换红外光谱（ATRFTIR）、X－射线光电于能谱（XPS）分析、接触角测定以及原子力显微镜观察也显示：通过表面截留技术，可以在聚乳酸材料上获得稳定的亲水化聚多糖－氨基酸截留表面。 软骨细胞的细胞粘附率、增殖率和细胞活性以及细胞形态的实验结果表明，聚多糖及其氨基酸衍生物改性的聚乳酸表面能明显促进软骨细胞的粘附与生长，并具有较高的细胞活性。该结果表明聚多糖及其氨基酸衍生物改性聚乳酸材料表面具有良好的细胞相容性。 生物大分子静电自组装构建聚乳酸细胞相容性表面的研究一本文通过大分子胺解的方法，将聚乙烯亚胺（PEI通过化学键合固定在聚乳酸组织工程材料上，在聚乳酸材料表面构建了稳定的正电荷表面层。采用静电自组装（Electrostatic Assemb火技术，本文将各种类细胞外基质组分如蛋白质、聚多糖等天然大分子材料固定在阳离子化的聚乳酸材料表面，构建了第叁种细胞相容性表面。X－射线光电子能谱（XPS）和衰减全反射傅立叶转换红外（ATR－FTIR）对PEI活化聚乳酸表面的分析结果显示：聚
李澎[6]2016年在《制备具有生物相容性和机械强度的半月板组织工程支架的实验研究》文中提出因为半月板组织解剖结构的独特性,所以半月板的损伤是很常见的骨科疾病,而通过外科手术技术很少能真正地重建半月板组织。半月板是纤维软骨组织,由纳米级胶原纤维交错相连构成半月板结构的基本框架,从微观上观察,它又分为叁层不同结构,构成每一层结构的胶原纤维有各自排列模式。半月板损伤后,无血液供应部分不能再生,所以研究人员尝试利用组织工程技术来重建半月板。从目前国内外的研究发现,尚无一种单一材料和单一的制备技术能制备出具备半月板纤维软骨组织特征的组织工程支架。应用复合材料的原理和方法,将具有互补特性的两种或两种以上材料按一定比例和方式组合,制成兼备机械强度、可降解性和生物相容性的复合材料,并选择适宜的制备工艺,可以设计构造出能够满足组织工程支架所需的结构和性能优化的叁维复合材料支架。目前复合材料种类繁多,而天然生物材料与人工合成高分子材料之间的复合,显现了良好的组织相容性及生物力学特性,适合应用在半月板这种组织构造比较特殊的软骨组织重建。在本课题中,根据人工合成材料聚乳酸(PLA)具备一定的机械强度,又有弹性,符合半月板的―双相‖特性,我们选用其作为生物材料中的基本成分,为了增加它的可降解性,将它与聚羟基乙酸(PGA)复合,为了改善它的生物相容性,我们又利用天然生物聚合物明胶对它进行表面修饰。同时,考虑到组织工程支架的形貌结构对引导细胞增殖方向,诱导组织形成起到关键作用,设计制备的支架就要很好地仿生组织的细胞外基质结构。静电纺丝技术能够制备纳米级的纤维结构支架,很好地仿生了细胞外基质的胶原纤维结构。根据前期工作,改变接收板材质为铜质,增加一个电场,先行应用静电纺丝技术制备聚乳酸聚羟基乙酸(PLGA)纤维结构的支架作为支架基底层,仿生半月板组织的细胞外基质纤维结构,再在plga纤维结构支架表面纺一层明胶纤维结构支架对plga进行表面修饰,制成双层结构支架,增加plga支架的亲水性和组织相容性。制备的支架兼具机械强度、可降解性和组织相容性。鉴于静电纺丝技术制备的支架达到一定厚度后,因高分子材料的绝缘性和电场力的限制,再想提高支架的厚度,有相当大的挑战。而热致相分离(tips)技术,使叁维立体结构支架的厚度得到大大地改观,改良的梯度热致相分离技术,又使支架孔隙的排列走向得到控制。我们选用有韧性可降解材料聚3-羟基丁酸酯共聚4-羟基丁酸酯poly(3-hydroxybutyrateo-co-4-hydroxybutyrate),简称p(3hb-co-4hb),复合聚乳酸(pla),改善pla的降解性,利用梯度热致相分离技术制备pla/p(3hb-co-4hb)取向孔隙叁维支架,再结合物理吸附作用,将天然生物聚合物明胶涂覆在支架表面,更加改善了支架的生物相容性,使其具备诱导细胞取向增殖,促进组织形成,发挥组织工程支架的作用。第一部分静电纺丝技术制备有机械强度和细胞相容性的双层纳米纤维结构半月板组织工程支架目的:1.利用静电纺丝技术制备组织工程支架。2.通过明胶纤维的表面修饰提高支架生物相容性。3.评估支架具备适合组织工程支架要求的物理化学性质。方法:在前期工作基础上,改进静电纺丝设备,将接收板改用铜质材料,并在接收板上增加一个新的电场,利用―层-层沉积‖技术,先纺出一层plga纤维结构支架作基底层,再纺制一层明胶(gelatin)纤维结构在其表面上沉积制备双层结构支架。同时以纯的plga和明胶混合plga分别各纺出一种纤维支架作为对照组。将叁种支架的表征、亲水性、降解性和机械强度进行测试比较。结果:gelatin/plga双层纤维结构支架与另外两种支架对比,具备直径合适的纳米级纤维、有较大孔径、较高的孔隙率、较高的亲水性、满意的降解率和良好的机械强度。结论:明胶/plga双层纤维结构支架仿生了半月板组织细胞外基质结构,具备作为组织工程支架的理化特性。第二部分骨髓间充质干细胞诱导分化的半月板细胞种植支架联合培养目的:1.提取兔的骨髓间充质干细胞,进行诱导分化为半月板细胞。2.将细胞种植于前面制备的叁种不同的纤维结构支架上,在体外进行培养。3.观察细胞在支架上的形态,通过细胞增殖情况及合成分泌功能的比较分析,评估不同支架的细胞相容性。方法:应用密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,在软骨诱导培养基中培养,获得的纤维软骨细胞通过表征观察和特异性染色(h.e、甲苯胺蓝、ab-pas、i、ii型胶原免疫组化染色)进行鉴定。接种细胞于叁种不同支架,通过观察细胞表征、组织染色、增殖测试评估叁种不同支架对细胞的相容性及对细胞特性的保持。结果:提取的骨髓间充质干细胞可以诱导分化成半月板纤维软骨细胞,种植于支架后能够增殖,并保持纤维软骨细胞的表征和功能,尤其在明胶/plga双层纤维结构支架上增殖显着。结论:明胶/plga双层纤维结构支架接种经诱导分化的纤维软骨细胞的联合培养为组织工程技术重建半月板提供理论依据。第叁部分制备具有生物相容性和机械强度的gelatin/pla/p(3hb-co-4hb)叁维组织工程支架目的:1.改进的梯度热致相分离技术制备pla/p(3hb-co-4hb)叁维多孔取向支架。2.在支架表面吸附明胶(gelatin)进行修饰,制备的支架进行表征、亲水性、降解性和机械强度的测试评估。3.支架上种植前面获得的诱导分化的骨髓间充质干细胞,评估支架的细胞相容性。4.与第一部分制备的gelatin/plga双层纤维结构支架进行机械强度和细胞相容性方面的对比。方法:应用改进的梯度热致相分离技术制备pla/p(3hb-co-4hb)叁维多孔支架,用物理吸附方法以明胶对支架进行表面修饰,标记为gelatin/pla/p(3HB-co-4HB)支架,制备的支架与未经过修饰的PLA/P(3HB-co-4HB)支架进行表征、孔隙率、降解性、亲水性和机械力学性能的测试对比后,种植经诱导分化的骨髓间充质干细胞,通过观察细胞在支架上的生长,及细胞—支架复合体的特异性染色和扫描电镜、共聚焦显微镜观察情况进行对比分析,评估明胶修饰支架在细胞相容性方面的优越性。为了选择更优越的支架,再与第一部分制备的Gelatin/PLGA双层纤维结构支架进行拉伸强度和细胞种植支架增殖情况的对比。结果:梯度热致相分离技术制备的叁维多孔支架经明胶修饰后,具备较理想的理化性质,种植其上的经诱导分化的骨髓间充质干细胞能够很好地增殖,并保持纤维软骨表征。与Gelatin/PLGA双层纤维结构支架对比,有更强的机械强度和优越的细胞相容性。结论:相比Gelatin/PLGA双层纤维结构支架,明胶修饰的PLA/P(3HB-co-4HB)叁维立体结构支架更适于成为半月板组织工程支架。第四部分Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)支架负载诱导分化的干细胞植入裸鼠体内构建纤维软骨的实验研究目的:检测细胞—支架复合体植入裸鼠皮下构建纤维软骨组织。方法:首先测试支架的安全性,用支架浸提液进行皮下刺激试验和急性毒性实验。然后将前面实验中已经得到的经示踪剂染色的诱导分化干细胞负载于支架上构成复合体与单纯无细胞支架植入裸鼠皮下,进行培养4周后,在多功能活体成像系统下观察,确认支架内细胞存活、增殖。将裸鼠处死,取出细胞—支架复合体,制成切片,进行组织染色和免疫组化染色观察对比。结果:制备的Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)支架是有生物相容性的,是安全的。负载诱导分化干细胞的支架植入裸鼠皮下后,可见支架内被标记的细胞增殖明显,细胞融合,相互联系,分泌纤维软骨细胞外基质。在支架环境中,有半月板纤维软骨组织形成的趋势。结论:负载诱导分化干细胞的Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)支架于裸鼠皮下培养成纤维软骨组织,为组织工程技术重建半月板提供理论依据。
杜江华[7]2007年在《降解速率可调控的聚β-羟基丁酸酯组织工程支架的研究》文中研究指明组织工程支架是组织工程中重要的研究对象之一，其支架在体内的降解速率能否与生长组织部位修复速率相匹配是组织工程支架能否临床应用的关键因素之一。聚β-羟基丁酸酯(PHB)是良好的组织工程支架材料之一，但降解速率较慢的特点影响了其在组织工程中的进一步应用。本文针对PHB降解速率慢的不足，从影响材料结晶度的因素考虑，将PHB与生物相容性好的聚乳酸(PLLA)及聚氧乙烯(PEO)共混改性，通过调整其比例以调控PHB的降解速率。另外，结合溶剂浇铸／粒子滤出法制备组织工程支架的优点，初步探讨研究了一种新的制备组织工程支架的方法，并考察了支架在动物体内的降解情况。 实验运用DSC、POM、SEM手段研究了PHB／PLLA及PHB／PLLA／PEO共混体系的相容性、冷结晶性及结晶度的变化情况及其在溶菌酶／PBS缓冲溶液中的降解情况，结果表明，PHB与PLLA有一定的相容性，PEO的加入提高了PHB与PLLA的相容性；PHB与PLLA共混，各组分的冷结晶温度不变，PHB的冷结晶速率不受PLLA的影响，而PLLA冷结晶速率随PHB含量增大而加快，共混体系的结晶度随PLLA的含量的增多而变小；对含有PEO的PHB／PLLA共混体系，PHB与PLLA的冷结晶温度都有减小；PLLA含量小于50％时，共混体系的降解速率要慢于纯的PHB，PLLA含量为50％时，PHB＜体系的降解速率＜PLLA，含有5％PEO的PHB／PLLA(1:1)共混体系降解速率显着提高，在实验90天前要快于PLLA，而后降解速率慢于PLLA，当体系降解120天后，PHB与PLLA的冷结晶温度几乎相同，说明PEO的加入加快了其体系的降解速度。 实验研究制备出由PHB多孔膜片与PHB／PLLA／PEO纤维复合而成的“夹芯”组织工程支架，并确定了制备PHB多孔膜片的最佳溶液浓度为2-3％：另外，将制备的“夹芯”支架植入兔子体内，SEM电镜观察，支架不但显示出了良好的组织相容性，而且降解显着；此外，该支架的结构也有利于细胞的生长。
许媛媛[8]2008年在《胶原海绵的改性及其作为活性因子载体的研究》文中研究说明目的胶原海绵是组织提取物胶原经冻干制成的海绵状轻质片。本研究旨在通过对胶原海绵进行化学改性,改善胶原海绵机械强度不足、降解过快、过高的凝血酶活性和过度溶胀造成负载药物或活性细胞因子快速释放等缺点,使其在化学组成、物理结构、分子结构和生物学功能等方面尽可能与细胞外基质相似。改性后的胶原海绵不仅具有良好的生物相容性、较高的孔隙率、适中的机械强度和细胞粘附生长的结合位点,而且可以通过包埋和释放活性因子为损伤修复提供一个传输和诱导性环境。制备出一种理想的深度创伤敷料或组织修复支架,调节组织生长的环境,加速组织修复再生的血管化进程。方法采用酶解法从猪皮中提取胶原,通过HAc溶解制成均匀的胶原凝胶,SDS-PAGE鉴定其组成成分。-80℃冷冻保存,冷冻干燥制成胶原海绵。再分别采用零长度EDC/NHS交联一步法和EDC/NHS交联与肝素复合同步法对胶原海绵改性加工,主要从交联度、变性温度、焓、红外光谱峰值、微观形貌、吸水力、酶解稳定性、机械强度、细胞复合及增殖实验、复合bFGF的缓释周期和活性保持情况几方面比较分析未经处理的对照组、EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组胶原海绵在理化性能、生物性能和对复合bFGF的缓释和活性保持作用几方面的差异。初步考察上述两种改性方法的优越性。结果胶原SDS–PAGE图谱表明提取纯度较高,主要是Ⅰ型胶原,无Ⅲ型胶原存在。甲苯胺蓝分光光度法测定肝素均匀复合在胶原海绵表面,复合量为30mg/g。红外光谱峰值的改变说明了胶原分子间或胶原与肝素分子间或胶原分子内酰胺间的形成,部分–NH2转变为–NH,–COOH参与了交联反应,而且活化的肝素分子通过–COOH与–NH2共价键结合牢固结合胶原海绵表面,经改性处理后任意的α螺旋结构没有减少,反而在交联作用和肝素的共价结合下,肽链结合更牢固,螺旋结构的稳定性增强,体现在改性两组胶原海绵吸收峰的差异。TNBS比色法测定EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组自由氨基数大幅度减少,从对照组381(±7.36)nmol/mg分别降低到230(±5.53)nmol/mg和203(±16.27)nmol/mg,且EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin两组之间存在显着性差异(One way, ANOVA; p=0.023),反映两种改性方法在增强材料交联度方面的差异。改性胶原基质的湿热稳定性大大增强,变性温度从27.5℃分别升高到71℃和65℃。在两组之间交联度和成分差异的基础上,改性胶原海绵吸水力的增强程度也有不同,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组分别是36.85(±2.17)和32.41(±1.78)mg/mg,两组之间有显着性差异(One way, ANOVA; p=0.043)。另一方面,在干燥湿润状态下,胶原海绵形态稳定性增强。酶解稳定性方面也得到提高,经过9d的酶解后,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组剩余海绵基质分别是原始质量的81.4%和84.7%,而对照组在1.5-2h内几乎完全降解,EDC/NHS交联处理(One way, ANOVA; p<0.0001)和酶作用时间(One way ANOVA; p<0.0001)对胶原海绵基质降解有显着性差异,酶解后海绵微观结构和表面形态同样证实了这一结论。在机械性能的对比研究中,在干燥状态下,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组的最大载荷、断裂应力和弹性模量均显着增强,且存在差异性;在湿润状态下,两组最大载荷、断裂应力和断裂应变大幅度降低,但弹性模量均高于对照组。在HUVECs复合和共培养研究中,对照组细胞存活良好,但与后者相比,增殖速度较慢。而细胞在EDC/NHS组海绵支架上,细胞存活良好,沿微孔孔壁粘附伸展良好,增殖速度高于对照组。EDC/NHS-Heparin组,细胞不仅能存活粘附生长,而且在相同的时间内增殖速度明显高于另外两组,细胞沿孔壁生长,分布较均匀,大部分细胞融合且沿着海绵孔壁形成孔状结构,部分细胞向孔中央迁移。同时,共培养早期,对照组胶原海绵在内皮细胞分泌的蛋白酶作用下部分降解,叁维网状结构彻底塌陷,无孔状结构;而EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组在长时间共培养期间,叁维网状结构均保持良好,无任何塌陷。在进一步的bFGF复合、缓释和bFGF活性保持方面的评价中,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组的释放时间明显延长,且复合bFGF的EDC/NHS-Heparin组海绵在第1d内的突释量18%明显低于EDC/NHS组19.5%和对照组30.9%,缓释周期较长,在37d时释放量约94%。负载bFGF的海绵基质活性检测表明胶原海绵负载bFGF有利于生长因子的缓释,经MTT检测,叁组海绵载体复合bFGF,对bFGF的活性保持作用有明显差异。对照组在57d时仅21.9%具有活性,而EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组分别约有48.4%和58.6%保持活性。结论改性处理使胶原海绵交联度、热变稳定性、吸水力和酶解稳定性大大增强,孔径变大,形态稳定性和机械强度显着提高。相对EDC/NHS组,EDC/NHS- Heparin组交联度和酶解稳定性均有所提高,而变性温度和焓有少许降低,吸水力减小,且干燥/湿润状态下形态稳定性避免了胶原海绵接触体液后形变过大带来的不便和负载的生长因子或药物快速释放的缺点。EDC/NHS-Heparin组不仅能蓄积充足的营养液促进细胞快速增殖迁移,叁维网状结构保持良好,有利于长期培养过程中氧与营养成分的传输和代谢物的排出。HUVECs接种到EDC/NHS- Heparin组海绵支架上,快速黏附伸展,生长良好,且在短时间内增殖迅速,融合并向海绵微孔中央迁移,明显高于EDC/NHS组和对照组。体外评价表明改性海绵促内皮细胞增殖,预示其具备加速组织血管化速度的能力,创伤修复速度将会明显高于另外两组,且在肝素的作用下,修复处皮肤疤痕会比较小,且光滑。复合微量bFGF的释放和活性检测试验表明,与对照组相比,改性两组降低了突释量,延长释放周期,活性保持良好。说明改性的胶原海绵有利于bFGF缓释和活性保持,且EDC/NHS-Heparin组优于EDC/NHS组。总之,EDC/NHS交联和肝素复合同步法不仅简化通常两步法繁琐的操作,而且在不明显降低活性的情况下,对改善材料理化性能、生物性能和缓释bFGF方面有显着作用。
杨丁柱[9]2015年在《超临界流体技术构建粗糙纳米纤维组织工程支架研究》文中认为组织工程支架是组织工程的基础,是组织工程技术的关键因素。支架的性能对于修复受损组织或重建功能具有重要的意义。目前传统方法如模压沥滤法等制备组织工程支架存在操作条件复杂,有机溶剂残留量高,孔洞贯通性差或需要盐析法除去固体致孔剂,负载的生长因子容易失活,同时无法获得与天然细胞外基质相类似的微观纳米拓扑结构等缺点。为克服上述缺点,本研究旨在利用超临界二氧化碳相转化技术,使用碳酸氢铵颗粒和左旋薄荷醇作为双重致孔剂,制备出具有粗糙表面的左旋聚乳酸纳米纤维组织工程支架。此外,探讨聚乳酸支架的生物相容性、不同拓扑结构与细胞相互作用以及对前成软骨细胞C5.18体外成软骨分化潜能的影响。本论文主要包括以下几方面内容:1.聚乳酸纳米纤维组织工程支架的制备及结构表征通过Minitab实验设计,考察碳酸氢铵颗粒尺寸、薄荷醇/聚乳酸质量比以及聚乳酸浓度对支架孔隙率和压缩强度的影响。实验结果表明,在一定的聚合物浓度下,选择合适薄荷醇/聚乳酸质量比,获得的支架具有较高的压缩强度和孔隙率。考察超临界二氧化碳相分离过程中,压力、温度、聚合物浓度以及薄荷醇/聚乳酸质量比等工艺参数对支架形貌的影响。实验发现,通过改变操作压力,可以有效地控制聚合物溶液的分相过程,从而获得具有不同微观纳米拓扑结构的组织工程支架。在合适的压力条件(15 MPa)下,促进聚合物溶液的液-液分相和固-液分相,从而成功制备出具有粗糙表面的纳米纤维支架。操作温度及聚合物浓度对支架形貌影响较小。致孔剂薄荷醇的存在改善了非溶剂的传质环境,有助于在聚合物固化过程中成孔,从而提高了纳米纤维间孔洞的贯通性。气相色谱分析表明,经过超临界二氧化碳流体处理后,支架中致孔剂薄荷醇已经被去除完全,支架中有机溶剂二氧六环残留量小于3 ppm,远低于USP467药典的要求(380 ppm),这体现了超临界相转化技术的独特优势。通过原子力显微镜进一步表征了纳米纤维表面的微观结构。差示扫描量热、衰减全反射傅里叶红外光谱和广角X射线衍射分析证实,经过超临界二氧化碳相转化技术处理后,促进了聚乳酸在结晶过程中发生再结晶现象;同时薄荷醇的存在导致在相分离过程中,聚乳酸的α-型与α'-型晶体发生转化。2.聚乳酸支架生物相容性研究使用L929细胞作为实验细胞模型进行细胞毒性实验,进行Alamar Blue和吖啶橙/溴化乙啶染色,实验结果表明,各实验组中细胞相对增殖率大于80%,制备出的支架细胞毒性较低,属于合格水平。急性全身毒性实验结果表明,小鼠经腹腔注射支架浸提液后,生长状况良好,生命活动正常,说明制备的支架材料为无毒材料。细胞溶血实验结果表明,支架材料溶血率均低于1.5%,具有良好的血液相容性。3.聚乳酸组织工程支架表面拓扑结构与细胞相互作用研究选择叁种具有不同结构特征的支架,考察具有不同拓扑结构的支架对蛋白吸附、细胞粘附、增殖以及细胞分泌蛋白情况的影响。蛋白吸附实验结果表明,具有粗糙表面的纳米纤维支架能够提高纳米纤维的比表面积,为蛋白的吸附提供了更多的结合位点,有利于蛋白质的吸附。细胞粘附实验结果表明,在相同的接种时间内,纳米纤维支架能够更快的促进细胞的粘附,接种7小时后,细胞的粘附率为94%,高于其他实验组。细胞增殖及细胞分泌蛋白质实验结果表明,不同拓扑结构支架均具有良好的生物相容性,适合细胞的生长和增殖。特别地,纳米纤维支架由于其具有与天然细胞外基质相类似的结构特征,能够为细胞的生存提供更合适的微环境。4.体外评价C5.18细胞在聚乳酸组织工程支架上的成软骨分化潜能通过诱导C5.18成软骨分化条件的考察,证明成软骨诱导液中地塞米松浓度为10-6 M时,能够更好地促进细胞的成软骨分化。在相同的诱导条件下,进一步考察具有不同拓扑结构的支架对C5.18细胞成软骨分化潜能的差异。实验结果表明,在各实验组支架上细胞分布均匀。特别地,在纳米纤维组支架上细胞出现了团聚现象。随着诱导时间的延长,培养7天后,C5.18细胞在各组支架上分泌糖胺聚糖、胶原蛋白等细胞外基质成分的能力呈现出显着性差异。C5.18细胞在纳米纤维支架上具有最高的表达量。
邹鹏[10]2016年在《PHBV纤维支架的表面功能化及其生物相容性的研究》文中认为软骨细胞和骨髓间充质干细胞的体外扩增是制约软骨组织工程发展的关键问题,通过生物活性支架模拟体内细胞生存微环境,调控种子细胞的体外增殖,维持种子细胞的生长活性,是解决软骨组织工程种子细胞体外扩增的有效策略。聚羟基丁酸-聚羟基戊酸(PHBV)是革兰氏菌在非平衡状态下合成的作为细胞碳源和能源的储存物质,由于其具有良好的生物相容性、可控的降解速率、降解产物无毒性和良好的可加工性,被广泛的应用在组织工程领域。但是由于其高分子疏水性和表面缺少细胞识别位点,不利于细胞在材料上的黏附和生长,因此需要对PHBV材料进行表面改性。本研究通过化学改性提高PHBV材料的亲水性,以用于促进软骨细胞和骨髓间充质干细胞的体外增殖。本研究通过静电纺丝法制备了PHBV纤维支架,通过化学改性分别将葡聚糖、氨糖和明胶叁种生物活性分子接枝到PHBV纤维支架的表面,并且通过染色法检测PHBV纤维支架的表面接枝密度,探讨改性参数对接枝密度的影响,优化PHBV纤维支架的改性参数。通过傅里叶红外光谱、润湿角和体外降解实验表征改性的PHBV纤维支架,结果表明葡聚糖、氨糖和明胶被成功的接枝到PHBV纤维支架表面,显着改善PHBV纤维支架的亲水性,并且提高了PHBV纤维支架的体外降解速率。为了探索改性PHBV支架对于软骨细胞和骨髓间充质干细胞的体外调控作用,通过将软骨细胞和BMSCs种植在改性支架上,采用Alamar Blue试剂检测细胞在不同支架上的增殖率,其结果表明叁种改性方法均可以提高PHBV纤维支架的生物相容性,软骨细胞在叁种物质改性PHBV纤维支架上都展现了较高的增殖率,而BMSCs仅在葡聚糖改性支架上具有较高的的增殖率,通过电镜观察两种细胞在不同支架上的形貌发现改性PHBV纤维支架更加有利于软骨细胞和BMSCs的黏附,细胞在两种不同支架上均形貌正常,表明了改性均提高了PHBV的生物相容性,可以作为一种潜在的组织工程支架应用在软骨组织工程领域,促进软骨组织工程的发展。
参考文献：
[1]. 聚乳酸软骨组织工程支架制备、改性及其细胞相容性研究[D]. 马祖伟. 浙江大学. 2003
[2]. 聚乳酸多孔支架的制备、改性及组织工程化软骨的构建[D]. 龚逸鸿. 浙江大学. 2006
[3]. 功能微球改性聚乳酸组织工程材料及其细胞相容性研究[D]. 陈达. 浙江大学. 2004
[4]. 聚乳酸软骨组织工程支架的制备、降解及细胞相容性研究[D]. 周庆亮. 浙江大学. 2005
[5]. 聚乳酸组织工程材料的细胞相容性表面设计研究[D]. 朱惠光. 浙江大学. 2003
[6]. 制备具有生物相容性和机械强度的半月板组织工程支架的实验研究[D]. 李澎. 大连医科大学. 2016
[7]. 降解速率可调控的聚β-羟基丁酸酯组织工程支架的研究[D]. 杜江华. 西北工业大学. 2007
[8]. 胶原海绵的改性及其作为活性因子载体的研究[D]. 许媛媛. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[9]. 超临界流体技术构建粗糙纳米纤维组织工程支架研究[D]. 杨丁柱. 华侨大学. 2015
[10]. PHBV纤维支架的表面功能化及其生物相容性的研究[D]. 邹鹏. 湖南大学. 2016
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