王晓伟[1]2001年在《阿维菌素产生菌的定向育种与突变株代谢产物的研究》文中进行了进一步梳理本文以阿维菌素链霉菌为研究对象。 以菌株C514为试验菌株研究了影响阿维菌素C_5位氧甲基化程度的因素。试验结果表明：菌体内S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的浓度可以调控阿维菌素的C_5位氧甲基化程度。当菌体内SAM的含量升高时，可以增加阿维菌素A组分的比例，而减少菌体内SAM的含量可以使B组分的比例升高。 以亚硝基胍为诱变剂对出发菌株#7进行了选育。采用磺胺敏感、甲硫氨酸诱导筛选模型，获得了B组分含量达到82％的菌株M-2，其B组分含量较出发菌株提高了40％左右。以耐受氯化艳为筛选模型结合原生质体再生及诱变获得了总效价达到5600μg/ml以上的高产菌株Pr27，其中B_(1a)效价在2300μg/ml以上。 在菌种选育过程中，获得了两株突变菌株E107和#21。它们所产生的主要代谢产物E107a、21-A、21-B被鉴定为寡霉素A、阿维菌素糖苷配基A_(2a)、阿维菌素糖苷配基A_(1a)。两个次要代谢产物E107b、21-C可能为寡霉素C及阿维菌素糖苷配基B_(1a)。
李燕霞[2]2006年在《阿维菌素B1a组分高产菌株的定向选育》文中研究说明本论文以阿维链霉菌为研究对象,先后使用紫外线及亚硝基胍对出发菌株1-17进行诱变处理,并结合L-异亮氨酸诱导手段进行定向筛选,最后得到B1a组分高产突变株3-6,其阿维菌素Bla的产量较出发菌株提高了12.86%。传代实验表明该菌株的高产性能稳定。对高产菌株3-6的培养条件进行优化,结果表明:斜面培养基成分中酵母粉的产地、斜面种子的培养周期及棉塞的重量对斜面种子的质量及发酵结果的影响程度较大,经分析,得到最适酵母粉产地为湖北,最佳培养周期为8d,最适棉塞重量为7g。通过正交试验优化了发酵培养基配方,发酵产量可提高7.35%。此外,还研究了前体物质丙酸钠的添加对发酵结果的影响,结果表明发酵过程中在培养基内加入一定浓度的前体物质丙酸钠,可以显着提高发酵产量,其中在发酵24h时在培养基中加入2.5mmol/L的前体物质丙酸钠,发酵产量可提高9.89%。考察了高产菌株3-6在3吨种子罐和100吨发酵罐的代谢特性,并对其发酵条件进行了优化。结果表明:通过接种条件的选择和将种子罐温度调整为30℃的改进措施优化了种子罐工艺;通过基础料配方的调整、补料方案的调整和通气量的调整优化了发酵罐工艺,使得总体发酵水平有了较大提高,发酵单位、罐批发酵总量、发酵指数分别提高了14.81%、7.77%、6.92%。
王海彬[3]2003年在《阿维菌素菌种的选育及发酵工艺优化的研究》文中进行了进一步梳理作为目前发现是为有效的杀虫剂之一的阿维菌素，其生产水平的提高关键在于阿维菌素高产突变株的获得以及发酵工艺的优化。 本实验对阿维菌素的生产菌株采用了半理化的筛选方法：出发菌株R-V-22经UV、NTG和MMS叁轮的处理，同时分别以氮亮氨酸、氯乙酸钠和2-去氧葡萄糖作为筛子，最后得到高产抗性突变株AV-4-56，其阿维菌素B1a的产量提高了60％左右。 对高产菌株AV-4-56的培养条件进行优化，结果表明：AV-4-56相对于出发菌株R-V-22生长速度快，通气量要求偏高，以剪切力的敏感度降低，可以耐受0.1％的KH_2PO_4。加入0.1％的磷酸镁的捕铵剂和5.0ppm的Zn2+和40ppm的Co2+可以提高阿维菌素的产量。同时采用正交试验法确定最佳碳氮源的比例，并且在发酵优化条件的基础上，研究了种子的种龄和接种量的影响，最后，AV-4-56在摇瓶培养条件下比出发菌株R-V-22的阿维菌素产量提高了70％。 考察了高产菌株AV-4-56和出发菌株R-V-22在2吨种子罐和80吨发酵罐的代谢特性。结果表明：高产菌株AV-4-56比出发菌株R-V-22的代谢来得快，它在发酵培养48hr左右pH就下降到6.0附近，氨基氮消耗到整个发酵周期的最低水平，而菌丝浓度增加到最高水平，其生长转为产素期。但消沫剂用量和动力需求量都比出发菌株R-V-22要高10％以上。高产菌株AV-4-56比出发菌株的每天糖耗速率要高1.0％左右，因而其在80吨发酵罐的10天发酵周期内，阿维菌素B1a的产量可以达到2500ug／ml以上，比出发菌株R-V-22的产量提高了60％。
武发菊[4]2007年在《阿维菌素高产菌株的选育及发酵条件优化的研究》文中提出阿维菌素是一组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素,由阿佛曼链霉菌产生,其发酵产物共有8个组分,其中B1组分生物活性最为显着和有效,在医药、农业和畜牧业生产中,具有良好的应用价值和广阔的市场前景。本论文采取选育高产菌株以及优化培养基和培养条件的方法来提高阿维菌素的摇瓶发酵效价,从而为产业化的大规模生产提供了可靠的工艺参数。首先通过对原始菌株AV-0的复壮,获得了一株发酵效价较高且遗传稳定的分离株AV-3。以AV-3为出发菌株,探索了紫外线、亚硝基胍的单一诱变,紫外线和亚硝基胍的复合诱变。结果发现:从致死率看,出发菌株AV-3对紫外线比对亚硝基胍更敏感;从诱变后的正突变率看,亚硝基胍诱变的效果好于紫外线;从效价提高的幅度看,经紫外线诱变后,效价比原来提高8%,亚硝基胍诱变后效价提高了8.8%;而紫外线和亚硝基胍联合的复合诱变效果又甚于单一诱变剂的诱变,效价提高了11%。另外,我们采用一种新型的诱变手段,即运用中科院兰州近代物理研究所提供的重粒子加速器,尝试用能量为80.55Mev/u的12C+粒子束辐照阿维链霉菌,试验中设计了不同的剂量组。结果发现,诱变后的单菌生长较快(约2-3d即开始出现菌落);菌落形态、大小与处理前比较变化明显,菌落明显较处理前大;突变幅度广,正突变率高,突变株种类多;经摇瓶初筛、复筛,运用高效液相色谱仪测定效价,最终分离到四株高产菌株,并经传代试验,遗传稳定性较好,其中最高发酵效价比出发菌株AV-3提高了50%。以上紫外线和亚硝基胍诱变、重离子束辐照诱变筛选到的菌株均能不同程度地提高试验菌株的产素能力,其中重离子束辐照效果较好,效价提高显着而且运用离子束诱变具有离子源种类多和生物材料的局限性小等优点,是一种较好的诱变育种方法。另外,在摇瓶水平进行了阿维菌素发酵培养基优化的研究,探索了不同碳源、不同氮源、无机盐、微量元素和前体等单因子对阿维菌素生物合成的影响。结果表明:碳源以糊精和可溶性淀粉的混合碳源为最佳,氮源以酵母粉和黄豆饼粉的混合氮源为最佳,无机盐K_2HPO_4·3H_2O和KCl在低浓度时对于抗生素的合成均有一定的促进作用,而MgSO_4·7H_2O和CaCO_3的加入则起抑制作用,同时研究了微量元素和前体物质对于发酵的影响。最终在单因子试验的基础上,通过统计学分析确定了一套发酵培养基的最佳配方,即糊精11%、可溶性淀粉1%、酵母粉2.5%、黄豆饼粉0.5%、K_2HPO_4·3H_2O 0.06%、KCl 0.1%、CoCl_2·6H_2O 4mg/L、丙酸钠6mmol/L,其发酵效价提高了12%。另外,对阿维菌素发酵的条件也进行了考察,即菌株的装料量、温度、pH值、发酵时间、接种量等。发现250ml叁角瓶中装料量为40ml, pH值为7.2,接种量为4%时,在温度28℃条件下发酵10d,阿维菌素B1a发酵效价最高。同时,研究了阿维菌素发酵液中生物量、pH值、总糖含量、氨基氮含量等的代谢变化。
薄永恒[5]2012年在《阿维链霉菌高产菌株诱变选育及其基因与蛋白差异效果研究》文中提出阿维菌素是由阿维链霉菌分泌出的一种次级代谢产物，是迄今为止发现最有效的生物杀死寄生虫的药物，是农业部推荐的一种的高效低毒的兽用药品，具有良好的应用价值和广阔的市场前景。本实验选用了阿维链霉菌作为研究对象，利用中科院近代物理研究所提供的重离子束对其进行辐照诱变，从中筛选出具有高产性能的阿维链霉菌菌株；分析重离子束对高效价诱变菌株的基因诱变效果，寻找其差异性；分析重离子束对高效价诱变菌株的蛋白诱变效果。以碳离子~(12)C~(+6)（100Mev/u）为辐照源，选用0Gy，10Gy，30Gy，40Gy，45Gy，50Gy，70Gy七个剂量，对效价为3900μg/ml的阿维链霉菌的孢子进行辐照。从正突变率实验结果，45Gy剂量下正突变率达到最高11.5%，因此在重离子12C+6辐照的最佳剂量在45Gy能够获得更多的效价提高的菌株。通过对诱变菌株形态的观察，发现了4菌型皱缩型、馒头型、草帽型、光秃型，其中草帽型的菌株产抗能力最强。本实验共做了621个单菌筛选并进行了发酵效价的测定，共获得效价提高菌株44株，其中147、238和HS效价最高，最高效价可达4901ug/mL。通过对碳源、氮源、无机盐、微量元素等培养基成分的优化，获得了以糊精11%、可溶性淀粉1%、酵母粉2.5%、黄豆饼粉0.5%、K_2HPO_4·3H_2O0.06%、KCl0.1%、CoCl_2·6H_2O4mg/L最佳培养基配方，同时使高效价菌株HS效价提高了8%。对原始种和不同剂量下获得的高效价突变株、以及高效价菌株147、HS的DNA进行了随机扩增多态性(RAPD,Random AmplifiedPolymorphic)分析，电泳结果出现大量差异条带，经过分析结果表明~(12)C~(+6)离子束处理阿维链霉菌引起基因组发生改变，且同源性较高。分别对原始菌株以及高效价菌株147、HS的C、D、I、R基因设计引物、通过聚合酶链式反应，获得扩增产物，并进行测序对比分析，发现高效价突变菌株经过重离子束诱变，核酸发生碱基突变，碱基缺失，碱基置换等现象，其中I基因的部分片段缺失可能导致了147、HS效价的提高。实验对原始菌株以及高效价菌株147、HS的发酵45小时的菌液的可溶性蛋白进行提取，利用双向电泳对其蛋白进行分离。实验首先对提取条件、一向电泳程序的优化，其次选择适当的电泳胶条，最终获得分离度良好的蛋白质图谱。对AO、147、HS的可溶性蛋白的双向电泳图进行分析，AO、147、HS分别含有蛋白质点345、418、591个，且其分子量大多为24KD到67KD。147的蛋白比AO上调3倍浓度以上的有22个点，蛋白下调的有28个点；HS的蛋白比AO上调3倍浓度以上的有29个点，蛋白下调的有2倍的有19个。碳离子辐照选育的高效价阿维链霉菌在发酵初期，由于辐照诱变的效应使得核酸序列的改变，从而使得蛋白表达方面有了更多了差异，包括蛋白质点多少的差异，以及蛋白表达量的差异。AO的蛋白点最少345个，而突变高效价147与HS在发酵45小时的时候蛋白已经高效的表达，且已经超过原始菌株，这也许就是效价能够提高的原因之一。
张莹莹[6]2006年在《阿维菌素产生菌的菌种选育》文中研究说明本文以阿维菌素链霉菌为研究对象，以化学诱变剂对出发菌株AV20进行了诱变育种。首先采用了亚硝基胍和硫酸二乙酯进行诱变处理，处理后采用了甲硫氨酸诱导模型和甲胺耐受的模型，对菌株进行了选育，获得了有效组分Bla高达43.2％的菌株-DMa-46。 然后再采用亚硝酸作为诱变剂进行诱变处理，结合链霉素耐受筛选模型获得了菌株H_2S10-13，它的B组分含量较出发菌株提高了15％左右，效价较出发菌株提高了1986μg／mL。 在菌种选育过程中，获得了两株突变株H_120-40和H_320-12。对这两株突变菌株代谢产物的研究表明H_120-40产生的主要代谢产物是寡霉素A，含量可达85％左右，寡霉素A效价可以达到733μg／mL。突变株H_320-12产生两个主要组分：ZL和B2a，ZL百分含量为42％，效价为762μg／mL；B2a百分含量为40.6％，效价为732μg／mL，H_320-12总效价为1989μg／mL。
梁剑光[7]2010年在《基于多尺度参数相关分析的阿维菌素发酵过程优化及工业规模放大研究》文中提出阿维菌素(Avermectin, AVM)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的一类具有广泛杀虫和抗寄生虫等生物活性的抗生素,占我国生物农药50%以上,市场份额巨大。我国虽有众多厂家生产阿维菌素,但鉴于我国目前的阿维菌素发酵水平与国际相比还有很大差距,本论文以发酵过程多尺度参数相关的宏观代谢调控为手段,对阿维菌素工业生产菌种选育及发酵过程优化与放大策略进行了系统研究,具体结果如下：1.阿维菌素高产菌株的推理选育及接种生理特性研究以工业生产菌株AV-023为出发菌株,针对国内阿维菌素菌种发酵有效组分低,菌株对还原糖浓度敏感的特性,开展对该菌株进行提高阿维菌素有效组分Bla的推理选育和耐高还原糖浓度驯化研究。获得了高产突变菌株AV60s-32,阿维菌素Bla单位可达4520 IU/ml,比出发菌株提高了23.4%,同时,该突变菌株的耐高还原糖浓度能力从2%扩大到5%,为阿维菌素发酵补糖策略优化与放大奠定了重要基础。此外,孢子接种和挖块接种的发酵宏观代谢生理参数OUR具有显着的差别：孢子接种发酵前期OUR峰值较低(15～20 mmol/1/h),后期下降较慢,OUR较平稳(9～11 mmol/1/h),而挖块接种发酵过程OUR变化相反,最终孢子接种发酵效价比挖块接种效价(4493 IU/ml)高9.8%,这一现象为阿维菌素发酵前期调控和后期发酵补糖策略提供了有益思路。2.阿维菌素发酵培养基优化及发酵前期OUR调控研究阿维菌素工业生产菌株对营养需求极为复杂,孢子培养基中添加0.01%的Mg2+可促进菌株的孢子形成。采用中心组合试验设计(CCD)对棉籽饼粉替代酵母粉的发酵培养基进行优化,获得了全新的发酵培养基配方：玉米淀粉14.22%,棉籽饼粉1.19%,豆粕粉2.67%,硫酸铵0.05%,钼酸钠0.0023%,CoCl20.0023%,硫酸锰0.00023%。优化后阿维菌素发酵效价达到5235 IU/ml,比优化前(4450 IU/ml)提高了17.6%。同时,对2M3中试罐进行多尺度宏观代谢参数相关分析,发现发酵前期将OUR峰值控制在15～20 mmol/1/h,发酵后期菌体代谢能力较强,OUR变化较平稳,该控制策略能促进阿维菌素生物合成前体有机酸的积累,显着提高发酵后期阿维菌素的生物合成速率。3.建立了基于OUR调控的阿维菌素补糖发酵新策略通过对阿维菌素发酵过程补糖策略进行优化,发现以OUR为依据进行补糖,在发酵150h后,控制OUR在10～12 mmol/1/h,阿维菌素B1。效价为6430IU/ml,比对照(5250 IU/ml)提高了22.5%。对该策略的代谢机理进行初步分析表明,以OUR为依据的补糖策略促进了阿维菌素生物合成的直接前体物质丙酸、乙酸和支链氨基酸的积累。通过进一步对阿维菌素生物合成代谢途径关键酶活测定结果证实：柠檬酸合成酶活性明显提高,表明TCA循环的代谢通量得到加强；甲基丙二酰辅酶A变位酶活性极大的提高,表明导向阿维菌素生物合成的前体代谢通量增大,强化了阿维菌素合成的代谢流。4.基于细胞生理特性与流场特性相结合的发酵过程放大研究通过对阿维链霉菌菌形进行定量计算和发酵流体特性分析,建立了阿维菌素发酵液流体特性与菌形之间的数学模型。150 M3发酵罐流场计算流体力学(CFD)模拟表明,采用分批补糖策略时阿维菌素发酵罐中的气含率、剪切应力等参数有助于反应器流场特性的改善。通过CFD分析流场特性,采用多尺度参数相关分析与流场特性(CFD)研究相结合的方法,成功实现了基于OUR调控的阿维菌素补糖新策略在工业规模150 M3发酵罐上的放大,建立了以微生物细胞生理特性(菌形、OUR)与生物反应器流场特性相结合的阿维菌素发酵补糖策略的理性放大方法。进一步揭示了以OUR调控的阿维菌素发酵补糖策略成功放大到150M3工业规模的合理性,为微生物发酵过程优化与放大提供借鉴和参考依据。
张毅[8]2008年在《阿维菌素高产菌株的选育》文中提出阿维菌素(avermectins)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的是一组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素,在医药、农业和畜牧业生产中有良好的应用,并且具有广阔的市场前景。本文对工业生产阿维菌素的阿维链霉菌菌株进行了基因工程改造研究。orfX,aveR,afsR,afsQ1Q2是链霉菌中发现的四个正调控基因。本试验将上述4个正调控基因通过接合转移法导入到阿维菌素工业生产菌株Z1中,检测其对阿维菌素产生的影响。试验结果表明orfX基因有明显促进作用,阿维菌素产量提高了约30%;aveR基因作用不十分明显;afsR和afsQ1Q2基因使产素水平明显降低。本试验进行了工业阿维链霉菌原生质体制备研究。试验结果显示阿维链霉菌原生质体制备的最佳条件为:250ml叁角瓶装有35ml含0.5%甘氨酸的YEME培养基,孢子悬液接种,28℃,200r/min培养40h;3000r/min收集菌丝体,用10.3%蔗糖溶液清洗2次;溶菌酶浓度为4mg/ml的P缓冲液悬浮菌丝体,30℃下处理50min完成原生质体制备。50%PEG1000做促融剂,原生质体融合率最高。利用OLM菌株(Apr~R)和Z1菌株(Spc~R)进行连续融合发现,经过连续5轮融合,融合效率可达41.6%,并达到稳定。以四株不同产量和来源的阿维链霉菌作为出发菌株,通过过五轮基因组重排处理,比较发现,随着基因组重排的深入,重组群体中高效价菌株的比率例在逐步提高。五轮基因组重排后得到了2株高产菌株,菌株F5-64和F5-170,其效价分别达到3322 ug/mL和3328 ug/mL。
陈红霞[9]2002年在《阿维菌素生物合成基因改造的研究》文中研究指明本文以阿维菌素产生菌Streptomyces avermitilis为研究对象，利用基因工程方法，将出发菌株Streptomyces avermitilis S-2基因组DNA上的阿维菌素生物合成基因簇进行了基因改造。将该基因簇中的aveD基因通过插入外源的安普霉素抗性基因片段使其失活，导致发酵产物中4个A组分(不需要的组分)的消失；将基因簇中的aveC基因通过同样手段，使其失活，导致发酵产物中4个“1”组分的消失，而主要积累“2”组分(进一步改造可成为伊维菌素的前体B_2组分)。 为了得到aveD基因片段，首先根据已知的阿维菌素生物合成基因簇的核苷酸序列，设计并合成了由18和20个核苷酸组成的5′端和3′端引物；以Streptomyces avermitilis S-2基因组DNA为模板，经PCR扩增得到了2.2kb的含有aveD基因的DNA片段。将1.5kb的安普霉素抗性基因片段插入到aveD基因中的NruI酶切位点，再将此灭活的aveD基因片段插入到具有接合转移功能(含有oriT基因)的链霉菌—大肠杆菌穿梭质粒pHJL401的多克隆位点区，由此得到重组质粒pID03。 以含有aveC基因的3.1kb基因组DNA PstI片段为基础，将1.5kb的安普霉素抗性基因片段插入到aveC基因中的Sph I酶切位点，再将此插入失活的aveC基因片段连接到具有接合转移功能(含有oriT基因)的链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒pHJL401的多克隆位点区，由此得到重组质粒pC05。沈阳药科大学硕士学位论文 中文摘要一 将质粒pID03，pC05分别转化大肠杆菌ET12567，得到的转化子经扩大培养后，利用接合转移的方法分别将质粒转入到阿维链霉菌S－2（Streptomyces avermitilis S－2）细胞内。经过在MYM平板上的传代和抗性标记的筛选分别得到了同源双交换的菌株Av e D 2 4和AveCg。 分别提取同源双交换茵株Av e D 2 4和Av e C 9基因组DNA，通过萨瑟恩（Southern）DNA印迹杂交，结果证明 l．skb的安普霉素抗性基因分别插入到了基因组DNA的3．4kb（含有aveD基因）BamH片段，和 3．okb（含有 aveC基因）Notl片段中。 对菌株Av eD24发酵产物的HPLC分析表明，菌株正象预期的那样不再产生A组分，而只产生B组分。此外，该菌株还产生两个异常的组分D24和D242，经HPLC及质谱进一步分析，初步确定异常组分D241 为寡霉素A，而D24－2为5．酮阿维菌素la。 对菌株AveCg发酵产物的HPLC分析表明，菌株AveCg正如预料的一样不能生物合成四种“ 1” 组分，而只能合成四种“ 2” 组分。
参考文献：
[1]. 阿维菌素产生菌的定向育种与突变株代谢产物的研究[D]. 王晓伟. 沈阳药科大学. 2001
[2]. 阿维菌素B1a组分高产菌株的定向选育[D]. 李燕霞. 天津大学. 2006
[3]. 阿维菌素菌种的选育及发酵工艺优化的研究[D]. 王海彬. 浙江工业大学. 2003
[4]. 阿维菌素高产菌株的选育及发酵条件优化的研究[D]. 武发菊. 甘肃农业大学. 2007
[5]. 阿维链霉菌高产菌株诱变选育及其基因与蛋白差异效果研究[D]. 薄永恒. 甘肃农业大学. 2012
[6]. 阿维菌素产生菌的菌种选育[D]. 张莹莹. 沈阳药科大学. 2006
[7]. 基于多尺度参数相关分析的阿维菌素发酵过程优化及工业规模放大研究[D]. 梁剑光. 华东理工大学. 2010
[8]. 阿维菌素高产菌株的选育[D]. 张毅. 华中农业大学. 2008
[9]. 阿维菌素生物合成基因改造的研究[D]. 陈红霞. 沈阳药科大学. 2002