吴伊丽[1]2003年在《人骨形态发生蛋白4成熟肽DNA序列的克隆与表达》文中进行了进一步梳理BMP-4(bone morphogenetic protein 4)是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一，具有促进软骨和骨组织形成的作用，在治疗骨折和骨缺损等方面具有极大的临床应用价值。因此本研究利用基因工程生产人BMP-4成熟肽。 采用细胞裂解液法自毛发提取基因组DNA，通过PCR法扩增出编码人骨形态发生蛋白4(BMP-4)成熟肽的DNA序列，克隆到载体pUCm-T中。在此基础上，将编码人骨形态发生蛋白4(BMP-4)成熟肽的基因片段分别克隆到pBV220、pGEX-3X和pET42a载体上进行原核表达，并且克隆到pIC9酵母分泌型表达载体上，为BMP-4的真核表达奠定基础。 重组的表达载体pBV220／hBMP-4转化到大肠杆菌DH5α中诱导表达。经条件优化后，非融合蛋白产量为29.7mg／L培养基，主要存在于包涵体中，包涵体溶解复性后占包涵体总蛋白的85.5％，占菌体总蛋白的17.4％。经Westernblotting鉴定在成熟肽相应部位有特异条带，体外实验证明复性后的重组bBMP-4具有生物活性。 重组质粒pGEX-3X／hBMP-4和pET42a／hBMP-4分别转化到大肠杆菌DH5α和E.coliBL21(DE3)pLysS中诱导表达。经条件优化后，可溶性融合蛋白产量分别为5.85mg／L培养基和18.00mg／L培养基，经Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化后并在Xa因子作用下，产生N端多叁个氨基酸的重组hBMP-4成熟肽和完整的重组hBMP-4成熟肽。通过Western blotting证明在成熟肽相应部位有特异条带，体外实验亦证明重组hBMP-4具有生物活性。 本实验结果显示： 1、自发根可以提取出满足PCR需要的DNA；产天津医科大学博士学位论 2、国人bmP一4基因中编码hBMp一成熟肤的DNA序列，与白种人的序列 无差别; 3、利用原核非融合表达系统成功的表达了重组hBMP一4成熟肤，复性后的 重组蛋白有良好的生物活性; 4、利用原核融合表达系统成功的表达了重组hBMP一4成熟肤，经切割去除 担体蛋白后具有良好的生物活性;
石晓卫[2]2008年在《黄淮山羊骨形态发生蛋白-4（BMP-4）基因的克隆与表达》文中研究指明为了研究黄淮山羊多胎性状和遗传多样性,开发利用我国地方品种资源以及保护山羊物种多样性,同时为黄淮山羊的品种选育及产业化开发提供依据。本研究克隆BMP-4基因全长编码序列、内含子及启动子,在E.coli中诱导表达成熟肽并对诱导条件进行优化,同时用RT-PCR的方法检测其在黄淮山羊7种组织中的表达含量。通过研究得到如下结论:1结合NCBI数据库已登陆的其他物种BMP-4基因的序列,采用分段扩增的方法,从黄淮山羊的肾组织中克隆到一条长1230bp的完整阅读框(ORF)cDNA序列。本序列已提交NCBI,登录号为:EF632080。对所得到的编码序列进行同源性分析,山羊与绵羊、猪、人、小鼠和牛的相应序列同源性分别为:99.43%、96.10%、94.96%、91.79%、99.19%;表明此基因在各物种间高度保守。其中,与人和小鼠的BMP-4相比,山羊BMP-4编码序列多叁个碱基,而山羊与绵羊、牛相应序列的同源性达到了99%以上,暗示山羊和绵羊、牛亲缘关系较其他物种更近。黄淮山羊BMP-4基因全编码序列编码409个氨基酸,其前19个氨基酸为信号肽,后116个氨基酸为成熟肽,中间的274个氨基酸为前肽,蛋白的理论分子量为46.63kDa。氨基酸成熟蛋白区具有BMPs家族的典型特征:七个半胱氨酸残基。与绵羊、猪、人、小鼠和牛的同源性分别为:99.51%、98.53%、97.80%、98.04%、99.51%,这些也说明BMP-4基因是一种在进化上很保守的蛋白质。2通过PCR方法克隆得到了1053bp和962bp的内含子2和3序列,两序列含有内含子的一般特征-“GT-AG”规律,表明得到的序列为内含子的全长序列(NCBI登录号为:EU104684)。经分析发现,猪、人、小鼠和牛内含子2和3序列的相应长度分别为:1028bp、1046bp、1061bp、1062bp和949bp、964bp、1002bp、961bp;山羊BMP-4基因内含子2和3与它们相应序列的同源性分别为:83.80%、76.03%、66.94%、96.71%和87.15%、80.24%、67.20%、98.13%。得到的启动子部分序列长度为:676bp(NCBI登录号为:EU679369)。3将BMP-4成熟肽片段克隆入pET32a原核表达载体,在E.coliBL21(DE3)plysS实现了表达,表达的蛋白大小为31kDa,其中成熟肽为13.1kDa。根据蛋白的表达量对诱导条件进行优化,适宜的诱导条件为:0.5mMIPTG、22℃、诱导8h。参照分子克隆实验指南的方法对重组蛋白进行亚细胞定位,结果显示重组蛋白主要以包涵体的形式存在,胞质和周质中也有少量蛋白表达,而培养液中则没有重组蛋白出现。4通过半定量RT-PCR方法检测了黄淮山羊BMP-4基因7种组织的RNA表达谱,检测结果表明这7种组织中均有BMP-4基因的表达,其中BMP-4基因在肾脏中的表达量最高,其次为脾脏、肝脏和卵巢,而在胰腺、肺脏和心脏中的表达量较低。这个结果说明,BMP-4基因在各组织中的表达具有组织特异性。
刘永斌[3]2005年在《牛骨形态发生蛋白BMP-4 cDNA的克隆及序列分析》文中研究表明本研究从影响肉牛骨骼生长发育的 BMP 基因出发,利用 Genbank 中其他物种的序列信息,通过序列比对、分析和 PCR-RACE 方法,对尚未报道的牛 BMP-4 基因序列进行扩增、克隆及测序。方法:1、在 Genbank 中查找人、小鼠和羊的 BMP-4 基因序列,运用 DNAStar 软件对这些序列进行同源性分析。依据同源性较高外显子区域设计引物。首先提取牛血液基因组 DNA,采用 PCR 技术扩增牛 BMP-4 的部分序列,将此片段重组到 PMD18-T 载体中,双酶切和 PCR 鉴定后测序,获得长为 306bp 的牛BMP-4 部分外显子序列。2、通过已获得的 BMP-4 序列设计 PCR-RACE 的上游特异引物,从牛软骨中提取总 RNA,用 Oligo(dT)15 Adaptor primer 和所设计的上游特异引物进行 PCR-RACE,通过克隆、测序后获得一条包括 3′末端非翻译区和大部分编码区序列,并与已获得外显子序列拼接得到长度为 1306bp 的基因序列。通过序列分析,发现 3′端氨基酸序列含有 BMP 家族固有特定位置的 7 个半胱氨酸,并与其他物种包括人、羊、小鼠、大鼠、狗和鸡的核苷酸序列同源比对,发现它们的同源性分别为 90.2%、94.2%、90.9%、90.4%、85.4% 和 73.6%,证实克隆的序列为牛 BMP-4序列,同时进行了氨基酸序列的预测和分析,克隆片段编码 389 个氨基酸,3′末端非翻译区长为 121bp,与人、羊、鼠、狗和鸡的同源性很高,为克隆其他 BMP 家族成员提供了依据。此序列已登陆 Genbank,登陆号:AY854957。
王欣璐, 李华, 杨广夫, 王全颍, 杨广笑[4]2000年在《人骨形态发生蛋白4(2b)成熟区cDNA的克隆和序列分析》文中指出目的 研究人骨形态发生蛋白 4(2b)(BMP-4)成熟区 cDNA的克隆方法 ,并进行测序及序列分析。方法 采用异硫氰酸胍一步法从人骨肉瘤细胞株 U-2OS中提取总 RNA，通过逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)扩增为 BMP-4成熟区 cDNA基因片段。将此基因片段经适当酶切后克隆入载体 pUC19中，获得重组质粒 pUC19/BMP-4。采用 Sanger双脱氧链终止法双向测定核苷酸序列。结果 通过 RT-PCR方法获得了 BMP-4成熟区的 cDNA，并经核苷酸测序证实。计算机检索 Genebank,选择其中已发表的 BMP-4 DNA序列 (D30751)作为参考，经 DNA SIS软件分析显示， rhBMP-4成熟区 cDNA和 Genebank中 D30751 BMP-4成熟区（ 963～ 1 310 bp）的核苷酸和氨基酸序列同源性均为 99％。 rhBMP-4成熟区 cDNA中有 2个碱基发生突变，一个位于第 1 154(201)位的 G C，但它不引起缬氨酸（ Val）密码子改变，故为无意义突变；另一突变位于 1 222(269)位的 C T，其密码子亦随之发生改变，即由丙氨酸 (Ala)变为缬氨酸。结论 获得克隆的 BMP-4基因成熟区，该基因在骨关节系统的损伤与修复及疾病治疗中具有重要的临床应用价值。
袁绍辉[5]2005年在《重组BMP-4/7融合基因及其表达蛋白对骨髓基质干细胞生物学行为的影响》文中研究说明骨愈合的分子生物学研究近年来已经取得了突破性进展,在骨愈合过程中骨形成蛋白(BMPs)可诱导骨再生、促进骨愈合的作用已经被证实。目前BMPs 家族已发现十多种成员,它们能诱导未分化的间质细胞增殖分化,形成软骨和新骨。这一领域的研究具有巨大的临床应用潜力和广阔的前景。体内BMPs 多为同源二聚体,但同时也发现存在少量的异源二聚体。BMPs 异源二聚体比同源二聚体活性要高,其作用机理有待深入研究。本实验在组织及细胞中分别将BMP-4 和BMP-7 成熟肽cDNA 进行克隆,并将编码BMP-4 和BMP-7 成熟肽的基因连接,得到BMP-4/7 融合基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体中,转化大肠杆菌后进行诱导表达,融合基因表达蛋白经分离、纯化、复性后,观察其对培养骨髓基质干细胞(BMSCs)分化增殖及碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)活性的影响。本研究结果表明,可以利用人胎盘组织细胞及胎儿软骨细胞提取克隆BMP-4和BMP-7成熟肽cDNA,通过基因重组获得融合基因可以在原核细胞中进行表达,表达蛋白对BMSCs 具有诱导活性。采用融合基因的方法提高BMPs 的表达水平,形成促进细胞代谢机制,是解决诱导成骨促进骨愈合的新方法,也将为组织工程和基因治疗骨缺损奠定实验基础。
周建设, 李明, 陈其新, 张驰, 石晓卫[6]2011年在《猪BMP4基因原核表达及优化》文中指出构建猪BMP4基因pET32a-BMP4原核表达质粒,在E.coli中表达并分离纯化目的蛋白。采用PCR技术以pMD18-T-BMP4重组质粒为模板扩增获得BMP4基因编码成熟肽片段,并插入到原核表达载体pET32a中,构建原核表达重组质粒pET32a-BMP4。将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,在不同的温度、IPTG浓度和时间下进行诱导表达,SDS-PAGE分析鉴定。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,表达宿主菌经IPTG诱导表达分子量约为31 ku的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30%以上。成功构建了pET32a-BMP4原核表达质粒,并经纯化得到BMP4目的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。
姚少华[7]2005年在《重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达、复性与纯化》文中研究表明本文采用大肠杆菌(E.coli-BL-21-DE3)为宿主细胞,pGEX4T-2质粒为载体来表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2),分别研究了目的蛋白的表达、复性、纯化及活性鉴定。本研究包括以下叁个部分的工作: (1)表达 研究了单独表达目的蛋白和融合有GST的情况下,在19℃、IPTG浓度为0.05和0.1mM的时,目的蛋白的表达情况;发现几乎不存在目的蛋白的可溶性表达,目的蛋白大都以包含体形式存在。接着,我们优化了IPTG的诱导浓度以提高目的蛋白表达量,结果示:当IPTG的浓度约为0.2～0.4时,目的蛋白表达量最大。 (2)稀释和透析复性 分别采用分步稀释和分步透析两种方法,以尿素作为助溶剂,对目的蛋白进行复性,结果表明:稀释复性法目的蛋白的收率不足5%,透析复性法收率不足1%。 (3)羟基磷灰石色谱复性基于天然BMP-2能够与羟基磷灰石(HA)结合和色谱复性的理论基础,我们提出了利用HA色谱复性法来复性rhBMP-2的策略;通过优选填料,摸索上样、洗脱及氧化等条件,较为系统地研究了该复性方法的基本操作条件。实验发现变性剂能够降低HA吸附蛋白质的载量,而不加用变性剂或用量很少又会导致变性蛋白在柱子中的沉淀;HA可以吸附常用氧化剂还原型和氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG),降低其氧化效果。据此,本文提出了色谱复性时,在进样前后加用少量变性剂的策略,并优化了上样时变性剂的用量及变性蛋白的浓度,有效地改善了目的蛋白的吸附情况、提高了目的蛋白复性率;本文提出了柱后氧化的策略,并设计实验,以溶菌酶为研究对象观察了柱后氧化与柱中氧化的差异,证明了柱后氧化的优越性。接着,研究了目的蛋白柱后氧化的条件,初步分析了pH值、温度、蛋白浓度和GSSG、GSH的比例对目的蛋
高思红[8]2006年在《重组人骨形成蛋白-4在大肠杆菌中高效表达的研究》文中进行了进一步梳理目的 通过基因工程技术在大肠杆菌中高效表达rhBMP-4，并经变性、复性后，获得具有生物活性的rhBMP-4，以期广泛应用于科研及临床研究。 方法 为获得目的蛋白在大肠杆菌中的高效表达，在不改变氨基酸序列的前提下，以全基因合成的方式对人BMP-4成熟肽基因全长进行定点突变，然后重组入pET-3c表达载体并转化至大肠杆菌DH5α中。经过PCR和双酶切鉴定后，将阳性转化子转化入BL21(DE)plysS中，随机筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达，然后选择表达量高的转化子送测序鉴定。将测序正确且表达量相对最高的重组转化子命名为大肠杆菌GSH菌株。随后对GSH菌株的发酵条件进行优化探讨，以获得适合该菌株生长与生产目的蛋白的最适条件。GSH菌株经IPTG诱导表达重组人骨形成蛋白-4和包涵体复性后，利用HPLC C_8反相色谱柱对比rhBMP-4与hBMP-4标准品，然后利用western blotting、C2C12细胞横向成骨细胞分化实验以及小鼠肌袋异位骨形成实验检测其活性。 结果 成功构建了高效表达rhBMP-4的工程菌株，rhBMP-4的表达量最高可达细胞总蛋白的33.8％，表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在，经初步纯化及复性后，复性效率为32.8％，并经体外与体内的活性检测表明rhBMP-4有良好的诱骨生成活性。 结论 该方案能够实现rhBMP-4在大肠杆菌中的高效表达，为进一步研究奠定了基础。
李雯[9]2017年在《鱼类来源的抗菌肽在毕赤酵母中的表达》文中提出鱼类栖息的水域环境易遭遇各种病原微生物的侵染,它们的机体拥有比其他生物更强的免疫系统来抵御这种复杂的生存环境。这种超强的免疫系统得益于它们的机体中有许多天然的抗菌肽(antimicrobial peptides,简称AMPs)——溶菌酶和防御素。溶菌酶(lysozyme,EC 3.2.1.17)是一类能水解肽聚糖的酶的总称,是机体重要的先天性免疫物质,参与水解细菌的细胞壁,具有抑制外源微生物生长的作用。防御素(defensin)是一类对抗外源病原体入侵的肽类物质,是动物自身免疫防御系统的重要组成部分。本研究聚焦于鱼类来源的溶菌酶和β-防御素。目前,在水产养殖和加工领域需要使用大量的抗生素和防腐剂。若能利用天然抗菌肽取代部分抗生素和防腐剂的使用,对于改善水产品的质量以及提高水产品的经济效益是非常有意义的。由于天然抗菌肽在生物体内的含量低,并且体外抑菌效果有限。因此以鱼类来源的天然抗菌肽为基础,设计杂合抗菌肽,来增强其效果;并通过DNA重组技术在体外大量生产,符合目前水产品养殖和加工产业的需求。本研究主要开展了鲤鱼(Cyprinus carpio)g型溶菌酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的重组DNA表达的研究以及斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)c型溶菌酶与斑马鱼(Danio rerio)β-防御素杂合肽在毕赤酵母中的重组DNA表达的研究。g型溶菌酶是参与鱼体先天性免疫的重要蛋白质。本研究从鲤鱼鳃中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG)。该基因的全长cDNA为558bp,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(Glu73,Pro86和Asp97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征。根据鲤鱼与其他生物之间g型溶菌酶氨基酸序列的比对结果,表明鲤鱼鳃中发现的g型溶菌酶和头肾中发现的g型溶菌酶的同源性最高。通过PCR方法在CLYG的5'和3'端分别引入XhoI和XbaI酶切位点。扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG。通过菌落PCR、双酶切鉴定和DNA测序证明重组表达载体pPICZαA-CLYG被成功构建。将已成功构建的pPICZαA-CLYG经SacI线性化后,电转至毕赤酵母X-33,Zeocin筛选得到的阳性转化子。经酵母基因组PCR鉴定,表明目的基因成功整合到X-33酵母基因组中。在1.0%(v/v)甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导表达72 h,获得重组体CLYG。SDS-PAGE和Western blot分析显示,在毕赤酵母中成功表达了重组体CLYG。斑马鱼β-防御素是有6个保守的半胱氨酸残基组成分子内二硫键的阳离子小分子抗菌肽。斑点叉尾鮰c型溶菌酶有2个催化位点(Glu50和Asp67),8个高度保守的半胱氨酸残基形成4对分子内二硫键。两者有协同作用,适合融合表达。在本研究中,通过SOE-PCR将密码子优化后的斑点叉尾鮰c型溶菌酶成熟肽基因(lyc)与斑马鱼β-防御素成熟肽基因(defbl3)进行串联,以期在毕赤酵母中表达一种新型的杂合抗菌肽(LD)。4个甘氨酸柔性连接位点和肠激酶酶切位点序列被设计用于连接defbl3和lyc。利用Xho I和XbaI酶切位点,将扩增到的串联基因片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-LD。再通过同尾酶Bgl II和BamHI反复的酶切连接,构建包含二拷贝和四拷贝表达盒的重组表达载体pPICZαA-LDn(n=2或4),并且用Bgl II和BamHI双酶切鉴定。载体用Bgl II线性化后,电转至感受态毕赤酵母X-33,筛选得到多拷贝转化子。转化子的拷贝数通过实时定量PCR确定,表明构建多拷贝表达盒的确可以增加目的基因整合到酵母基因组的拷贝数。0.75%(v/v)甲醇诱导表达120h后,用亲和层析纯化发酵上清得到重组体杂合抗菌肽LD。蛋白质电泳和Western blot验证了重组体LD在毕赤酵母中的表达。各拷贝转化子进行诱导表达,结果说明酵母转化子的目的基因拷贝数与表达量存在正相关关系。X-33/pPICZαA-LD4的表达量最高,是X-33/pPICZαA-LD的1.67倍。该结果证明了体外构建多拷贝表达盒重组表达载体来增加目的蛋白表达量的策略是有效的。通过监测酵母细胞的生长状况,发现该杂合抗菌肽LD比defbl3更适合在毕赤酵母中表达。抑菌实验表明重组体LD对革兰氏阳性菌单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)有抑菌活性。本研究成功地在毕赤酵母表达系统中用甲醇诱导表达重组鲤鱼g型溶菌酶和重组体杂合抗菌肽LD。为进一步了解鱼类溶菌酶和β-防御素的蛋白性质及功能奠定了基础,也为其开发应用创造了条件。
参考文献：
[1]. 人骨形态发生蛋白4成熟肽DNA序列的克隆与表达[D]. 吴伊丽. 天津医科大学. 2003
[2]. 黄淮山羊骨形态发生蛋白-4（BMP-4）基因的克隆与表达[D]. 石晓卫. 甘肃农业大学. 2008
[3]. 牛骨形态发生蛋白BMP-4 cDNA的克隆及序列分析[D]. 刘永斌. 内蒙古农业大学. 2005
[4]. 人骨形态发生蛋白4(2b)成熟区cDNA的克隆和序列分析[J]. 王欣璐, 李华, 杨广夫, 王全颍, 杨广笑. 中华骨科杂志. 2000
[5]. 重组BMP-4/7融合基因及其表达蛋白对骨髓基质干细胞生物学行为的影响[D]. 袁绍辉. 吉林大学. 2005
[6]. 猪BMP4基因原核表达及优化[J]. 周建设, 李明, 陈其新, 张驰, 石晓卫. 西北农业学报. 2011
[7]. 重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达、复性与纯化[D]. 姚少华. 四川大学. 2005
[8]. 重组人骨形成蛋白-4在大肠杆菌中高效表达的研究[D]. 高思红. 暨南大学. 2006
[9]. 鱼类来源的抗菌肽在毕赤酵母中的表达[D]. 李雯. 上海海洋大学. 2017
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