摘要 目的：优选柴金解郁颗粒剂的提取工艺。方法：对药材浸泡时间进行单因素考察，利用L9（34）正交试验以出膏率、浸出物、总生物碱含量、金丝桃苷含量为考查指标，筛选最佳提取工艺。以挥发油得率为指标对柴胡和石菖蒲进行挥发油提取。结果：贯叶金丝桃、黄连、酸枣仁、龙骨四味药材浸泡100min，分别加8倍、6倍、4倍量的水，分别提取1.5h、1h、0.5h。柴胡、石菖蒲两位药材浸泡50min，加8倍量水提取6h。结论：通过提取验证，发现所选提取工艺条件可行性较高、稳定性较好。
关键词：正交试验；柴金解郁颗粒剂：提取工艺：挥发油提取
Optimization of Extraction Technology of Chaijin Jieyu Granules by Orthogonal Design
Abstract: Objective To optimize the extraction technology of Chai Jin Jie Yu granules. Methods Single factor investigation was carried out on the time of medicinal materials soaking, and the optimum extraction process was selected by using L9 (34) orthogonal test to determine the ointment rate, extract, total alkaloid content and Hyperoside content. Volatile oil was extracted from Bupleurum and Acorus calamus by using the yield of volatile oil as an index. Results The four herbs of Hypericum Hypericum, Rhizoma Coptidis, Zizyphus jujube kernel and dragon bone were soaked for 100min, and 1.5h, 1H and 0.5h were extracted respectively with 8, 6 and 4 times respectively. Two herbs of Bupleurum and Acorus calamus were soaked in 50min, and 6h was extracted by 8 times water. Conclusion Through the extraction and verification, it is found that the selected extraction conditions are feasible and stable.
Key words: Orthogonal test; Chai Jin Jie Yu granules: Extraction Technology: volatile oil extraction
柴金解郁颗粒剂是黑龙江中医药大学附属第一医院的临床经验方，主要用于抑郁症患者。处方由柴胡、贯叶金丝桃、酸枣仁、黄连、石菖蒲、龙骨6味中药组成。但因其在临床上仍然以朴素的汤剂为主要剂型使用，依从性差、服药量大、生物利用度低、起效慢等缺点，严重限制了其在抑郁症的临床应用及疗效发挥。为将此处方制成，所以对其提取工艺进行考察，为制成颗粒剂做出铺垫。影响提取的主要因素有：药材的浸泡时间、提取时间、加水量、提取次数等。药材的浸泡时间一般对其他因素影响不大，相互交互作用较小，所以进行单因素考察，其余因素进行L9(34)正交试验，以出膏率、浸出物、总生物碱含量、金丝桃苷含量为考察指标，优选出适宜工业化生产的最佳提取工艺。
1.仪器与试剂
1.1仪器
电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器仪器厂）、DT系列电子天平（江苏省常熟市意欧仪器仪表有限公司）、电子分析天平（上海卓精电子科技有限公司）、KQ-300V型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、紫外可见分光光度仪（日本岛津 uv-1601pc）、DZTW调温电热套（北京市永光明医疗仪器仪器厂）、高效液相色谱仪（UltiMate300，美国Thermo scientific）
1.2试剂
柴胡、贯叶金丝桃、酸枣仁、黄连、石菖蒲、龙骨（六味药材均购于哈尔滨三棵树药材批发市场）、三氯甲烷、乙醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、甲醇、溴甲酚绿、氢氧化钠、磷酸（均购于天津市永大化学试剂有限公司）、甲醇、乙腈（色谱醇）、盐酸小檗碱对照品、金丝桃苷对照品（标准品均购于中国科学院成都生物研究所）
2方法与结果
2.1药材鉴别
按照2015年版《中国药典》一部有关处方中六种药材项下的各项规定检查。结果显示所用药材均符合规定。
2.2浸泡时间考察
称取处方药材(不含石菖蒲、柴胡)7份，各加200ml水，没过药材，封口膜密封，室温放置，分别于15 min，30 min，45 min，60 min，75 min，90 min，105 min，120min各取一份，用八层砂布过滤，淋干，测定剩余水的体积，吸水率分别为71.43%、80.95%、85.71%、95.24%、104.76%、119.05%、119.05%、119.05%。药材在浸泡90 min后，吸水量接近达到饱和状态，此时药材吸水率为119.05%，故最终确定药材的浸泡时间为105min。
2.3提取工艺正交试验考察[1~3]
影响提取的主要因素有加水量、提取时间、提取次数三个因素，采用正交试验法，根据生产实际，选取三个水平，采取梯度设计，在平行操作条件下，按L9(34)表正交试验，以出膏率、浸出物、总生物碱含量、金丝桃苷含量为考查指标，优选最适宜的提取工艺条件。
2.3.1正交试验因素水平
2.3.2试验方法
在平行操作条件下，根据表1，采用L9(34)试验法，拟定9次试验。称取一个处方量的药材，浸泡105min，按正交设计表添加相应倍量水，回流提取，过滤，浓缩至200ml容量瓶，备用。测定出膏率、浸出物、总生物碱含量、金丝桃苷含量。
2.3.3出膏率测定方法
精密量取2.3.2项下9份提取液，各100ml，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，放干燥器中冷却0.5h精密称定，计算出膏率。出膏率=干膏重÷100×200/投药量×100％。结果见表2。
2.3.4浸出物测定方法
取2.3.3项下9份干膏，分别研成细粉，各取2 g，精密称取，置100 ml的锥形瓶中，精密加入95%醇50 ml，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用95%醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 ml，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算9份干膏浸出物的百分比。结果见表2。
2.3.5总生物碱含量测定方法[4~6]
2.3.5.1供试品溶液的制备 精密量取2.3.2项下9份提取液，各5ml至蒸发皿中，水浴蒸干。加入PH=4的柠檬酸-磷酸氢二钠15ml使溶解，转移至分液漏斗中，加入溴甲酚绿5ml，用三氯甲烷萃取三次，每次8ml，合并三氯甲烷溶液，过滤，将滤液用三氯甲烷定容至25ml容量瓶中，即得供试品溶液。
2.3.5.2对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品0.0103g，至于50ml容量瓶中，甲醇超声使溶解并用甲醇稀释至刻度，制成盐酸小檗碱对照品溶液(0.206µg/ml) ，备用。
2.3.5.3空白溶液的制备 取PH=4的柠檬酸-磷酸氢二钠15ml，加入溴甲酚绿5ml，用三氯甲烷萃取三次，每次8ml，合并三氯甲烷溶液，过滤，将滤液用三氯甲烷定容至25ml容量瓶中，即得空白溶液。
2.3.5.4最佳吸收波长的确定 照2015年版《中国药典》附录VA紫外-可见分光光度法项下方法操作，取2.3.5.2项下对照品在200～700nm范围内进行波长扫描，光谱图见图1，选择最佳吸收波长。由光谱图可知对照品在354nm处有最大吸收，经多次实验表明此峰灵敏度高、重现性好，且无干扰，选择354nm进行测定。
2.3.5.5标准曲线的制备 分别精密称取盐酸小檗碱对照品溶液（2.3.5.2项下）0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml至蒸发皿中，水浴蒸干。加入PH=4的柠檬酸-磷酸氢二钠15ml使溶解，转移至分液漏斗中，加入溴甲酚绿5ml，用三氯甲烷萃取三次，每次8ml，合并三氯甲烷溶液，用三氯甲烷定容至25ml容量瓶中，在354nm波长处测定吸光度。以吸收度A为纵坐标，盐酸小檗碱浓度C为横坐标作标准曲线，求算线性回归方程，得回归方程为：A=49.445C+0.0699,R=0.9991。表明盐酸小檗碱在0.0041～0.0410μg/mL之间与吸光度成良好的线性关系。 2.3.5.6含量测定及结果 取2.3.5.1项下供试品溶液，照紫外分光光度法（中国药典2015版一部附录ⅤA），于波长354nm处测定吸收度，计算总生物碱含量。结果见表2。
2.3.6金丝桃苷含量测定方法[7~10]
2.3.6.1色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱 (250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸（20∶80）；检测波长：360nm；柱温：室温；流速：1mL/min。理论塔板数按金丝桃苷峰计算应不低于3000。
4.4.6.2对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷对照品0.0006g，至于50ml容量瓶中，加甲醇密封，超声使溶解并用甲醇稀释至刻度，制成金丝桃苷对照品溶液(0.012mg/ml) ，备用。
4.4.6.3供试品溶液的制备 精密量取2.3.2项下9份提取液，每份15ml至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
4.4.6.4测定方法 精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。实验结果见表2。
2.3.7正交实验结果
表2水提正交试验方案及结果(Table 2 orthogonal test scheme and result of water extraction)
从出膏率的方差分析结果可知：B因素对结果有显著性影响。极差比较可得B>D>A，故影响试验结果的因素顺序为B>D>A，即提取次数对出膏率的影响最大，提取时间次之，而加水量对出膏率的影响最小。进行直观分析：A因素中A3>A2>A1，B因素中B3>B2>B1，D因素中D3>D2>D1
从浸出物的方差分析结果可知：B因素对结果有显著性影响。极差比较B>D>A，故影响试验结果的因素顺序为B>D>A，即提取次数对浸出物的影响最大，加水量次之，而加水量对浸出物的影响最小。进行直观分析：A因素中A2>A1>A3，B因素中B3>B2>B1，D因素中D2>D3>D1。
从总生物碱的方差分析结果来看：B因素对结果有显著性影响。极差比较可得B>A>D，故影响试验结果的因素顺序为B>A>D，即提取次数对总生物碱的影响最大，加水量次之，而提取时间对总生物碱的影响最小。进行直观分析：A因素中A3>A2>A1，B因素中B3>B2>B1，D因素中D3>D2>D1。
从金丝桃苷的方差分析结果来看：B因素对结果有显著性影响。极差比较可得B>A>D，故影响试验结果的因素顺序为B>A>D，即提取次数对金丝桃苷的影响最大，加水量次之，而提取时间对金丝桃苷的影响最小。进行直观分析：A因素中A3>A2>A1， B因素中B3>B2>B1，D因素中D3>D2>D1。
2.3.8正交实验结果分析
综合表3、4、5、6方差分析结果，因素B虽然对出膏率有显著性影响，但出膏率可作为颗粒剂成型过程中辅料添加量，及患者服用量含量的参考指标，而不能全面代表有效成份的提取率。但浸出物、总生物碱、金丝桃苷含量是指标性成分，对有效成分的提取率极具参考价值。通过极差分析比较，提取次数对有效成分含量影响较大，因此我们选择B3因素，即提取三次。在实际生产中也要考虑提取效率，能耗，生产成本等多因素，需对提取工艺进行综合评价，最终确定，A2B3D2为最佳提取工艺条件即提取三次，每次分别加8倍、6倍、4倍量的水，分别提取1.5h、1h、0.5h。
2.4挥发油提取工艺[11~15]
影响挥发油提取主要考虑提取时间，以所提挥发油的体积来选取合适的提取时间，提取时间总共需要考察10个小时，在此期间需要每半个小时观察挥发油的量。将挥发油用乙醇收集，并用无水乙醇少量多次冲洗挥发油提取器，冲洗液也作为挥发油收集液，密封存储，备用。将所得水提取液，八层纱布过滤，之后与其他4味药的提取液合并进行浓缩处理，制备成清膏。
2.4.1浸泡时间考察
称取处方量药材2份（只包括石菖蒲和柴胡），加水150ml，封口膜密封，室温放置，分别于20min、30min、40min、50min、60min各取一份淋干，八层纱布滤干，测定剩余水的体积，吸水率分别为138.89%、161.11%、172.22%、172.22%、172.22。药材（石菖蒲、柴胡）在40min时吸水量已经稳定，吸水率为172.22%，已经达到了药材重量的2倍，由此可知药材的吸水率已经达到饱和。所以最终确定药材的浸泡时间为50min。
2.4.2挥发油体积观测方法
称取十倍处方量的柴胡和石菖蒲，将药材加八倍量水浸泡50min，开始进行挥发油提取试验，在药物沸腾时开始计时，分别在每半个小时观察一次，并查看挥发油提取器中挥发油的体积，观察时间总计为10h，结构见表7。
2.4.3挥发油体积观测结果
经查阅文献得知，石菖蒲中既含有即含有轻油又含有重油，所以随着提取时间增加，石菖蒲的重油就会下落到提取器的下端，并流入圆底烧瓶，然后再被重新提取出来，由数据可以看出这是一个重复的过程，从提取四个小时之后，大概每2h循环一次。柴胡中挥发油含量较少。提取0.5h时，可以观察到提取器中出现少量油滴，随着时间增加，在3h、3.5h、4h、4.5h、5h体积明显增加，在6h时挥发油体积达到最大，之后6h-10h开始循环过程，未看出有再次增加的迹象。所以将挥发油的提取时间确定为6h。
3讨论
本处方临床用于抑郁症患者，通过现代药理研究以及查阅大量文献发现石菖蒲挥发油有抗抑郁作用，做本课题将提取工艺分为两部分。因为本实验所涉及处方为临床经验方，服用方法为水煎煮的汤剂，所以将贯叶金丝桃、黄连、酸枣仁、龙骨采用水提方法，石菖蒲、柴胡采用水蒸气蒸馏法进行挥发油提取，将二者水提液混合进行浓缩干燥处理，挥发油喷洒于成型制剂。
按上述方法进行了三次小试提取验证，在最佳提取工艺的条件下，验证试验三批所测出膏率、醇浸出物、总生物碱含量、金丝桃苷含量波动小。表明所选提取工艺条件可行性较高、稳定性较好。
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作者简介：曲毅（1985-）女，在读硕士，研究方向为中药新药研究与开发。
Tel：13613619114. E-mail:szsyjk56@126.com
通信作者：邹伟（1965-）男，主任医师，教授，中西医结合临床学科
Tel：13351980999. E-mail:kuangzou2003@163.com
本课题为黑龙江中医药大学科研基金，项目编号2014xy03
论文作者:曲毅1,贾永囡2，邹伟3#，孙晓伟3，田明2,
论文发表刊物:《世界复合医学》2018年第08期
论文发表时间:2018/10/30
标签：挥发油论文; 金丝论文; 石菖蒲论文; 因素论文; 药材论文; 正交论文; 溶液论文; 《世界复合医学》2018年第08期论文;