朱震霞[1]2003年在《不同类型水仙亲缘关系的分子标记研究》文中研究指明本实验运用RAPD、ISSR对58份不同类型、不同来源的水仙材料进行亲缘关系研究，并将RAPD标记中法国水仙型的特异标记转化为重复性和稳定性好的SCAR标记，用于该类型材料的鉴定等研究工作中。 研究结果如下： 1．采用2％CTAB微量法提取水仙DNA，结果显示所得DNA浓度高于其它植物采用此方法甚至大量法得到的DNA浓度。表明水仙叶片组织柔嫩，纤维素等物质含量少，易获得高浓度DNA。水仙叶片中内含物对DNA提取影响很小，2％CTAB微量法不必添加其它辅助试剂即可获得高质量DNA。 2．对水仙RAPD反应体系中各组分，均设4个水平进行正交分析，得到的6个最佳反应体系表明影响RAPD扩增效果的并不是某个组分的特定浓度，而在于RAPD反应体系中各组分的浓度组合。由于RAPD使用的是随机引物，各引物碱基序列相差较远，因而在体系中与各组分的结合程度也不一致，形成各引物相异的最适反应体系。 3．RAPD分类结果总体上与英国皇家园艺学会分类系统相符。58份材料被划分为10个类群。丁香水仙型、大杯状副冠型、喇叭状副冠型、重瓣型各自结合成一类，其中丁香水仙型是进化中较原始类型，另外3者亲缘关系相近，平均遗传相似系数0.610。花色的改变显示了较高水平的变异。地理位置的影响在法国水仙型材料中产生不同程度的变异，相近的地理位置变异程度相近。法国水仙型与丁香水仙型、大杯状副冠型、喇叭状副冠型重瓣型亲缘关系较远，平均相似系数0.493，它们在水仙属中分属不同的种。野生型与以上各类型亲缘关系最远，平均相似系数0.229，为水仙属中另一种。且法国水仙型与野生型在树状图顶部聚类，可能是进化较晚的类型。水仙花器官的进化过程由简单到复杂，具体表现为副冠由小型、大型至瓣化发展。 4．对水仙ISSR反应体系中各组分各设4个水平进行正交分析，结果表明，ISSR扩增效果也由体系中各组分的浓度组合决定。4碱基重复引物尤其是(AGTG)_4和(GACA)_4扩增效率高。ISSR扩增程序中在扩增初始阶段采用较高退火温度，经循环后逐渐降低退火温度，有利于扩增结果清晰度和多态性的提高。 5．ISSR与RAPD分类结果基本一致。由于引物数量较少，ISSR分类结果较为粗略，但6个ISSR引物就可得出与RAPD 14个引物相近的结果，ISSR的高效性与多态性显得尤为突出。 6．在RAPD反应中，引物S488在17份法国水仙型的材料中扩增出特异带S488-631，测序后将该条带转化为SCAR标记，大幅度提高该标记的特异性和稳定性，更方便快捷地应用于法国水仙型的鉴定。
王小萍[2]2007年在《利用SSR标记对38份茶树种质资源亲缘关系与品种分子鉴定的研究》文中研究表明茶树(Camellia sinensis(L．)O．Kuntze)是我国重要的经济作物之一，不仅栽培历史悠久，而且分布广泛。已有研究表明，我国西南部是茶树的起源中心，孕育了丰富的茶树种质资源，其遗传多样性为世人瞩目。目前，我国已在浙江杭州、云南勐海建成两个国家级茶树种质资源圃，保存了3300多份茶树种质材料，如此丰富的资源为我们进行茶树品种选育提供了坚实的物质基础。SSR标记是近年来发展起来的一种新的分子标记，由于SSR标记呈共显性，具有丰富的多态性，结果可靠而被广泛应用。本研究利用SSR标记技术对四川现有栽培、选育的品种和引进的福建等地的共38个茶树品种的遗传亲缘关系进行分析。获得如下的实验结果：1、从16对SSR引物中筛选出6对多态性丰富的引物。利用该6对引物对38个茶树品种遗传亲缘关系进行分析，共获得61个基因位点，多态性达100％，平均每条引物扩增出10.1个基因位点，最多的为13个，最少的也有8个。遗传相似系数变异范围为：0.557—0.902，平均为0.7102、对38个茶树品种进行UPMGA聚类分析，在遗传相似系数0.693处将这些品种分为四个类群。类群Ⅰ包括：龙井43、茂绿和蒙山9号；类群Ⅱ包括龙井长叶、青峰、迎霜、安吉白茶、碧云、平阳特早、乌牛早、浙农117、福鼎、安溪水仙、元宵茶、政和、福鼎大毫、梅占、福选9号、锡茶11号、锡茶5号和凫早2号、东胡早、槠叶齐、名山213、名山白毫、南江4号、黔湄303、黔湄502和台湾大叶；类群Ⅲ包括：蜀永307、名山早、蒙山23号、蒙山11号、黔湄41 9、英红2号、海南大叶和黄叶水仙；类群Ⅳ则为福建水仙。3、本试验采用6对SSR引物形成的DNA指纹图谱，可以将其中的34个茶树品种区别开来，表明了SSR标记技术进行茶树品种分子鉴别的可行性。
段云裳[3]2009年在《利用SSR标记研究我国茶树无性系品种的遗传多样性和亲缘关系》文中进行了进一步梳理茶树是世界上重要的植物饮料之一,在世界上被广泛栽培种植。茶树属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)茶组(Sect.Thea (L.) Dyer)植物,原产于中国西南山区,经过长期的自然演化和人工选择,形成了丰富多彩的茶树种质资源,为人类选育出适宜大量种植和具有较高经济价值的茶树品种奠定了基础。在我国茶树被利用的历史有3000多年,这期间人们有意识或无意识的对野生的茶树进行驯化并按照一定的目的培育出了满足生产需求的茶树品种。这些品种往往具有高产、优质、早生、高抗等优点,是我国茶产业得以发展壮大的坚实基础。据统计,到2005年底,全国有国家级审(认、鉴)定茶树无性系品种80个,省级审(认)定茶树无性系品种110多个。我国茶园良种化比例也由1980年代的不足10%提高到2008年的34%,无性系品种的选育功不可没。因而,对我国茶树品种进行系统全面的研究,充分了解它们的遗传多样性和亲缘关系,是今后茶树品种选育的重要基础。同时,DNA分子标记的迅猛发展使我们能排除生态环境、植物发育、栽培措施等的干扰而直接从生命本质——-DNA层面对这些品种进行探讨。本研究应用SSR分子标记技术对我国现有主要茶树无性系品种(系)进行研究深入了解这些品种(系)的遗传多样性和亲缘关系,以求了解我国茶树品种的现状为今后的茶树育种工作提供参考。主要研究成果如下(1)利用40对SSR引物对我国现有乌龙茶品种(系)进行遗传多样性和亲缘关系分析,结果表明40对引物共获得179个等位位点,329个基因型,平均4.48个等位位点,8.23个基因型,平均多态性信息量(PIC)为0.52；我国乌龙茶品种(系)具有较高的遗传多样性水平(H=0.57),平均遗传距离为0.59。广东地区的乌龙茶品种(系)较福建、台湾两地的遗传变异大;杂交选育品种(系)的遗传多样性略低于利用其他方式选育的品种(系);同时,骨干亲本铁观音、黄楼及其衍生品种间遗传距离变幅较大,表现出较高的多样性;聚类分析和主成分分析中大多数供试品种按照地理来源和遗传背景进行了聚类。(2)利用39对SSR引物对我国现有红绿茶品种(系)进行遗传多样性和亲缘关系分析,结果表明39对引物共获得191个等位位点,440个基因型,平均每对引物可检测到4.90个等位位点和11.28个基因型,平均多态性信息量(PIC)为0.53。我国红绿茶品种(系)具有较高的遗传多样性水平(H=0.57)和较大的遗传距离(0.64),广东地区的红绿茶品种(系)较其他地区的遗传变异大;系统选育品种(系)的遗传多样性略高于于杂交选育的品种(系)和地方品种;福鼎大白茶与云南大叶茶杂交选育的品种同样表现出了较大变幅的遗传距离,多样性丰富,并依据选育地而进行聚类;聚类分析中大多数供试品种按照地理来源和遗传背景进行了聚类。(3)利用58对SSR引物对我国茶树主要的无性系品种进行了遗传多样性和遗传结构的分析,结果表明58对引物平均可检测出4.53个等位位点和10.43个基因型平均多态性信息量(PIC)为0.49。我国现有主要茶树品种遗传多样性丰富(H=0.54),红绿茶品种的基因多样性指数(H)、多态性信息量(PIC)均较乌龙茶品种高;将供试品种按照不同生物学特性分组,各类型间遗传多样性具体表现为小乔木型>灌木型>乔木型,大叶类品种>中小叶类品种,早生种>中生种>晚生种;遗传结构分析表明基于数学模型和基于遗传距离分析都将云南以及属于阿萨姆变种的茶树品种与其他大多数品种分开,这可能是由于它们是较原始的类型,也从侧面反映出我国西南地区是世界茶树的原产地。
袁菊红[4]2007年在《中国石蒜属（Lycoris Herb.）种间亲缘关系与居群分子标记研究》文中进行了进一步梳理石蒜属(Lycoris Herb.)是石蒜科中的一个重要的属,该属全世界约20种,中国种类最多,约15种,广泛分布华南、华中、华东各省区,华东地区为其多样性分布中心。该属植物具有很高的观赏价值,鳞茎富含生物碱,具有多种药理活性作用。石蒜属同种异名或异种同名的现象严重,种间易杂交、天然杂交种多,有些种内形态和染色体核型变异丰富,鉴别石蒜物种、确定属内种间亲缘关系和研究种内遗传多样性显得特别重要。石蒜(L.radiata(L'Hér.) Herb.)作为石蒜属中分布最广、资源最丰富、观赏性最强的种类之一,其系统研究尚未进行。因此,本研究利用ISSR分子标记、trn L-F序列分析、高效液相色谱(HPLC)技术以及基于形态特征的数量分类方法从不同角度、不同方面研究我国原产的石蒜属种间亲缘关系、物种的系统位置以及分类问题。同时运用多种分子标记技术和数量分类学方法对石蒜居群DNA和形态多样性进行研究,主要结果总结如下:1.利用基于形态特征的数量分类方法对中国石蒜属13种2变种的种间亲缘关系进行研究,以中国水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem.)为外类群。Q聚类结果显示石蒜属物种聚为两类,第一类包括安徽石蒜(L.anhuiensis Y.Hsu & G.J.Fan)、长筒石蒜(L.longituba Y.Hsu & G.J.Fan)、黄长筒石蒜(L.Jongituba var.flavo Y.Hsu & X.L.Huang)、中国石蒜(L.chinensis Traub.)、忽地笑(L.aurea(L'Hér.)Herb.)、乳白石蒜(L.albiflora Koidz.)、香石蒜(L.incarnata Comes cx C.Sprenger)、鹿葱(L.squamigero Maxim)和换锦花(L.sprengeri Comes ex Baker) 9个种;第二类由矮小石蒜(L.radiata(L' Hér.)Herb.var.pumila Grey)和石蒜(L.radiata(L' Hér.)Herb.)、玫瑰石蒜(L.rosea Traub & Moldenke)、稻草石蒜(L.straminea Lindl.)、江苏石蒜(L.houdyshelii Traub.)、红蓝石蒜(L.haywardii Traub.)组成,皆为秋出叶物种。中国水仙单独成一类。与经典分类结果基本相符。研究结果支持鹿葱、乳白石蒜、江苏石蒜、稻草石蒜、玫瑰石蒜和红蓝石蒜的杂交起源观点。但不支持安徽石蒜作为分类学意义上的种,认为将其作为长筒石蒜的变种或长筒石蒜与中国石蒜的杂交种更为合适。R聚类和主成分分析表明雄蕊与花被片的位置关系和鳞茎形状是划分人类群的重要指标。2.利用高效液相色谱(HPLC)对我国石蒜属13种1变种及其近缘植物中国水仙生物碱进行检测,根据生物碱成分的相似性采用Q聚类,石蒜属物种聚成两大类,该属大多数种的归类与基于形态特征的数量分类结果一致,但红蓝石蒜和忽地笑的聚类发生了变化。中国水仙的HPLC图谱与石蒜属植物明显有别,单独成一类。外形相似的中国石蒜与忽地笑,石蒜与矮小石蒜的HPLC图谱差异也较大。3.采用PCR产物直接测序法,测定了我国石蒜属13种2变种的叶绿体DNAtrnL-F序列,以中国水仙为外类群。结果表明:所测物种的序列全长在905～1036bp之间,经排序后两端切平,得到886bp的整齐序列,其中trnL(UAA)内含子长度为529bp,trnL(UAA)3'外显子至trnF(GAA)之间的基因间区长度为357bp。所测物种的变异位点14个,信息位点10个,占序列总长度1.13%,序列的G+C含量为32.9%。序列中出现4个碱基“ATAT”缺失/插入和7个碱基的置换(颠换6个,转换1个),用以区别石蒜属与其近缘植物水仙;trnL-F序列的177bp处和497bp处分别是香石蒜和矮小石蒜种特异性鉴别位点。基于trnL-F序列运用最大简约法获得供试样品的分子系统树:水仙属植物形成一个单系类群;石蒜属13种2变种可分为3类,多数种的归类与经典分类结果基本一致。结果还表明换锦花很可能作为红蓝石蒜、玫瑰石蒜的杂交母本;安徽石蒜可能是长筒石蒜的变种或以长筒石蒜为母本的杂交种。对石蒜13个居群和其变种矮小石蒜、近缘种玫瑰石蒜和红蓝石蒜的trnL-F序列也进行测定分析,结果表明:所测样品trnL-F序列存在一定变异,碱基突变以转换为主。石蒜种内不同居群(细叶型和宽叶型)trnL-F序列呈现一定差异,江苏江宁的石蒜居群trnL-F序列与玫瑰石蒜、红蓝石蒜的完全相同。4.采用简单重复序列间区(ISSR)分子标记,研究了中国原产的石蒜属13种1变种之间亲缘关系,以中国水仙为外类群。16个扩增清晰、多态性好的ISSR引物共扩增出253个位点,其中244个多态性位点,多态性位点百分率达96.44%。种间遗传距离以江苏石蒜与中国水仙的的最远,达0.8700,石蒜与矮小石蒜遗传距离最近,为0.2104。中国石蒜与忽地笑虽然花部性状极为相似,但DNA差异较大。UPGMA法将供试石蒜物种聚成2人类,除换锦花、鹿葱、香石蒜在人类土划分有所不同外,ISSR标记结果与传统形态分类、核型和RAPD标记结果基本相同;还与前文中基于形态特征的数量分类和HPLC聚类分析有较高相似处。5.将基于形态特征的数量分类、HPLC图谱聚类分析和ISSR分子标记中相同的一组供试样品的原始数据联合起来利用SPSS软件进行聚类分析,结果表明:(1)中国水仙与石蒜属植物亲缘关系远,在较高的聚合水平,中国水仙形成一个单系类群。(2)15份石蒜属植物被分成了两类,第一类除忽地笑和中国石蒜外,其它全为整齐花亚属物种;第二类是以石蒜和矮小石蒜为代表的石蒜亚属物种。(3)联合分析与单一分类方法获得的结果基本一致。即中国产石蒜属5个原种(长筒石蒜、中国石蒜、忽地笑、换锦花和矮小石蒜)的系统位置比较明确,玫瑰石蒜、鹿葱、红蓝石蒜和稻草石蒜等具有杂交起源的种其杂交种身份也得到证实,系统位置较为确定。然而,不支持安徽石蒜作为一个分类学意义上的种,它可能是长筒石蒜的变种或长筒石蒜与中国石蒜的杂交种。香石蒜和乳白石蒜的起源及系统位置还难以确定,有待进一步研究。6.用ISSR和RAPD标记分别对石蒜属4个种37份样品的基因组DNA的遗传多样性进行检测。16个ISSR和17个RAPD引物分别扩增出229和215条带,多态比率分别为85.59%和69.77%,ISSR检测出的多态性条带的能力优于RAPD;ISSR和RAPD标记检测同组样品的Nei's遗传相似系数范围分别为0.5459～0.9345(平均0.6836),0.6419～1.0000(平均0.7428)。两者相关系数r=0.8582,达极显着水平。ISSR和RAPD标记的分子聚类结果相近,两种标记均能准确地把不同来源的样品先按种聚类,石蒜种内的遗传多态性高于同一试验中忽地笑、中国石蒜、换锦花的种内多态性。种内不同采集地样品间存在一定的遗传差异。用POPGENE3.2分析的种间基因分化系数(Gst)与用AMOVA进行的遗传变异巢式方差分析所得结果基本一致。两种标记均可用于石蒜属植物居群的遗传多样性研究。7.石蒜有代表性的13个居群和其变种矮小石蒜、近缘种玫瑰石蒜和红蓝石蒜的数量分类研究结果与同一组植物样品基于trnL-F序列的聚类结果存在较高的相似性。石蒜居群之间外部形态、生长发育习性、次生代谢产物加兰他敏含量存在较大差异,这些差异与DNA差异之间有一定联系,石蒜具有较宽的遗传基础和丰富的遗传多样性。8.应用SRAP标记对中国13个省24个石蒜居群共89个样品进行检测,10对引物组合共获得218条带,其中173条为多态性条带,多态性百分比达79.36%。多态谱带比率以贵州3个居群的最高,达37.61%,其次是四川忠县居群(SC),为36.70%,多态谱带比率最低的是安徽广德居群(AH1),为25.69%。物种水平的总等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、基因多样性指数(h)、Shannon多样性指数(I)依次为1.7936、1.4131、0.2415和0.3664。AMOVA遗传变异巢式方差分析得出的居群间变异(96.05%)与物种水平遗传分化系数(Gst)0.9748、基因流(Nm)0.0129基本相符。居群间和样品间聚类结果皆显示,所有样品可分为两大类,第Ⅰ大类7居群中除连云港居群外,均来自西南或西北地区;第Ⅱ大类由分布华南、华中和华东地区的17个居群组成。SRAP遗传距离与经度、纬度、年均降雨量、年均温呈极显着正相关,相关系数依次为0.202~(**)0.248~(**)、0.194~(**)、0.171~(**)(r0.01=0.000～0.005,n=276):但与海拔没有显着相关。SRAP技术不仅能检测到石蒜种内、居群间丰富的遗传多态性,还能检测到居群内样品间的遗传差异。本研究采用多种方法对石蒜居群的遗传多样性进行了分析,其结果均揭示出石蒜种内存在较为丰富的遗传变异,根据多种研究结果我们将石蒜分为细叶型、宽叶型和中间类型3种类型。
郑卓[5]2005年在《新疆野生油菜的利用研究》文中研究说明新疆野生油菜具有许多优良性状,且在进化地位上属较原始类型。能否利用新疆野生油菜一直受到油菜育种工作者的关注。本文对新疆野生油菜和甘蓝型油菜属间杂交的亲和性、远缘杂种F_1的鉴定、杂种F_2的分离以及杂种后代选育出的两个不育株等进行了初步研究,试验结果如下: 1.采用蕾期授粉、混合花粉授粉、残桩法、延时授粉可以有效克服新疆野生油菜与甘蓝型油菜属间杂交不亲和性。在蕾期授粉中,以新疆野生油菜为母本的杂交亲和性高于其反交的杂交亲和性;亲本基因型对杂交亲和性有重要影响,采用混合花粉授粉法可以在一定程度上消除其对杂交亲和性的影响;亲本基因型不同还表现出不同的生殖隔离,湘油15主要表现为受精前障碍,而Parol表现为受精后杂种胚败育。 2.远缘杂种F_1育性不高,自交、回交均难以结实,是远缘杂种鉴定的主要依据。其它性状如叶片刺毛、叶腋紫斑、叶片和茎杆上的蜡粉、花朵大小等均介于双亲之间,利用这些性状也可对杂种的真实性进行鉴定。不同组合间,F_1花粉可染率、结角率有差异,但每角粒数差异不大,均为1粒左右。筛选结角率高的组合可以获得较多杂种后代。 3.从200条随机引物中筛选出的11条随机引物,对新疆野生油菜与甘蓝型油菜属间杂种进行了鉴定,结果表明这些杂种均为真杂种,说明采用蕾期授粉的方法可以克服新疆野生油菜与甘蓝型油菜属间杂交的不亲和性。 4.对远缘杂种F_1花粉母细胞减数分裂及小孢子发育过程观察表明,减数分裂中期Ⅰ形成1个叁价体,1个或5个环状染色体,其余均为单价体;减数分裂后期Ⅰ出现落后染色体和染色体桥;减数分裂后期Ⅱ染色体分布到细胞两极不均衡;四分体及小孢子发育也不正常,最终形成大量败育花粉。在减数分裂过程中,染色体分配不均衡是引起杂种高度不育的内在原因。 5.利用0.1%秋水仙碱在苗期处理F_1,可以使少量杂种单株的育性得到部分恢复,自交、回交均能结实,尤以自由授粉条件下结籽率最高。 6.自由授粉来源的F_2群体,育性很低,可育株少,半不育株多,有一定数量的不育株,大部分单株的性状介于双亲之间,F_2花粉可染率与结角率和每角粒数
吴菁华[6]2004年在《多花水仙若干品种类型亲缘关系的分子生物学研究》文中研究说明水仙属石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus)植物，具有很高的观赏价值。其中多花水仙是福建特产，主栽品种为花冠白色副冠橙黄色的中国水仙(N．tazetta var．chinensis Roem．)，此外零星种植的还有白色花、黄色花以及花冠白色副冠淡黄色等几种不同花色的品种类型。为了解它们的亲缘关系和起源，前人曾对这些品种类型进行了形态学和核型分析，本实验选用7个品种类型的多花水仙为实验材料，对其进行同工酶和RAPD分析，从分子水平推断出它们之间的亲缘关系；利用原位杂交技术探讨了叁倍体水仙基因组的来源；建立了水仙单染色体显微分离技术体系，并在此基础上进行了一个品种特有的中着丝粒染色体的体外扩增和文库构建。主要结果和结论如下： 1 过氧化物酶同工酶分析 通过对过氧化物同工酶酶谱进行分析，得出供试7个水仙品种聚成叁类的聚类图。其中Ⅲ-1(两色花，2n=30)和Ⅲ-2(两色花，2n=30)归为一类；Ⅱ-1(黄花，2n=20)和Ⅱ-2(黄花，2n=30)归为一类；Ⅰ-1(白花，2n=22)、Ⅰ-2(白花，2n=22)和Ⅲ-3(两色花，2n=32)归为一类。以同工酶作为水仙品种类型分析的依据比形态学分析当更为可靠。 2 RAPD分析 RAPD分析结果表明7个水仙品种可分为四组，Ⅰ-1和Ⅰ-2归为一组；Ⅱ-1和Ⅱ-2归为一组；Ⅲ-1和Ⅲ-2归为一组；Ⅲ-3单独为一组。它应比形态学、同工酶分析更为客观地反映水仙品种类型间的亲缘关系。 3 原位杂交分析 1) 用45S rDNA和5S rDNA为探针，分别与Ⅰ-1、Ⅱ-1和Ⅲ-3的中期染色体进行杂交，根据其结果对这叁个水仙品种类型间的关系进行了推断。 2) 分别以Ⅱ-1和Ⅰ-1的基因组DNA为探针，与Ⅲ-3的染色体进行原位杂交，结果证明Ⅲ-3包含了一套x=10和两套x=11的染色体组。 以上实验结果说明Ⅲ-3是起源于x=10和x=11杂交的同源异源叁倍体。 3) 以Ⅱ-2的基因组DNA为探针，与水仙Ⅲ-3进行原位杂交，和Ⅱ—1与Ⅲ-3的原位杂交一样，在32个染色体中也出现10个染色体有杂交信号，为福建农林大学硕士学位论文摘要水仙11一2是n一l的同源叁倍体提供了佐证。4，水仙单染色体微分离与微克隆 l)水仙I一1的根尖为材料，制备出用于微分离的染色体标本，利用显微操作系统，采用粘取法成功分离出I一1中一个特殊的中着丝粒的染色体。 2)利用LA一PCR方法成功地对该单染色体进行了体外扩增，获得了片段大小为500一2500bp的水仙中着丝粒染色体DNA库。 3)用pGEM一T Easy Vector克隆PCR产物，构建了单染色体的DNA质粒文库。随机分析部分重组子，发现文库的插入片段大小为600一2500之间。
黄建安[7]2004年在《茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究》文中认为茶树[Camellia sinensis(L.) O.Kuntze]原产于中国，目前已成为一种世界性的重要经济作物，也是21世纪最流行的健康饮料植物。关于茶树分子标记技术及遗传多样性在DNA分子水平上的研究，于20世纪90年代中期开始在国内外均作了一些开创性的工作，但与其他重要经济作物相比，仍存在有较大的差距。相对应用较多的只有RAPD标记，其他如RFLP、SSR和AFLP遗传标记的研究资料屈指可数；由于茶树是一种高度异质性的多年生异花授粉植物，也使茶树遗传图谱的构建十分困难；特异PCR标记技术如PCR-RFLP需建立在已知核苷酸序列信息的基础上，而有关茶树的核苷酸序列信息相对较少，故限制了其在茶树遗传研究中的应用。从常规的分子标记技术过渡到直接对DNA碱基序列的多态性进行研究，是现代分子群体遗传学发展的必然趋势，但到目前为止，用于基因突变检测和SNP分析的新技术，大多局限于医学上的应用，而在农业上的应用研究还鲜见报道。 本研究首先从建立适用于茶树基因组DNA多态性分析的AFLP、ISSR、PCR-SSCP标记方法着手，并用这些标记技术研究优异茶树种质资源的遗传亲缘关系；同时借鉴多年生果树及林木分子图谱构建时采用的“双假测交理论”(double pseudotestcross format)，利用在国内十分难得的茶树杂交F_1代群体(祁门4号×潮安大乌叶)构建茶树的分子标记连锁遗传图谱。本研究在第二部分对茶树多酚氧化酶(PPO)基因的SNP进行研究，以已克隆茶树PPO基因的部分序列为模板，采用PCR-SSCP分析与对部分个体进行DNA测序相结合的方法，对不同茶树品种(株系)的PPO基因作SNP搜寻，并对酶切位点变异作进一步的PCR-RFLP分析，以探讨SNP与茶树品种适制性及遗传背景的关联性。本文主要研究结果如下： 1、对植物DNA提取的4种方法(CTAB常规法、CTAB区室法、SDS常规法、SDS区室法)进行改良后，经对比研究发现：4种方法均能提取高质量的DNA，其OD_(260)／OD_(280)都在1.80～1.92之间、分子量均大于21Kb、都能完全被EcoR Ⅰ酶切消化、也能获得清晰的PCR扩增图谱。并以鲜叶为对照，研究在-20℃、一70℃保存及硅胶脱水干燥法保存鲜叶样品对DNA提取质量的影响，结果表明:用鲜叶和该几种方法保存的样品提取基因组DNA的效果完全相同，硅胶脱水干燥法是一种较好的鲜叶保存方法，解决了茶树分子生物学研究远距离采样时样品保存的难题。 2、采用银染法代替同位素标记法，建立了分辨率高、重复性好的茶树AFLP一银染显色技术体系。根据所建立的AFLP一银染技术体系，对不同茶树品种的指纹图谱进行了初步研究，结果发现，同一引物对不同品种扩增及不同引物对同一品种扩增都呈现出十分丰富的多态性。因此，AFLP分析技术是一种揭示茶树遗传变异的十分高效可靠的方法，非常适合于构建不同茶树品种的指纹图谱，为茶树品种保护、种质鉴别、种子与苗木的纯度检测及真假辨别提供科学依据。 3、研究分子标记在作图群体中的分离状况是构建遗传图谱的基础。本研究借鉴“双假测交理论”，以祁门4号X潮安大乌叶的F:代群体为材料，对AFLP、RAPD与ISSR标记在F:代群体的分离方式及分离比例进行研究，结果表明，3种标记在该F:代群体中呈现孟德尔分离、偏孟德尔分离及异常分离3种分离方式。在厂0.01水平上，AFLP标记的3种分离方式出现的频率分别为93.37%、6.18%、0.52%，其中孟德尔分离位点占分离位点总数的73.40%;在孟德尔分离位点中发生1:1分离的位点为69.41%，发生3:1分离的位点为30.59%。IsSR标记的孟德尔分离与偏孟德尔分离方式出现的频率分别为78.57%和21.43%，无异常分离。RAPD标记的3种分离方式出现的频率分别为82.93%、14.63%和2.44%。 4、采用M叩maker3.o软件对22对AFLP引物扩增所得的有效标记位点进行连锁分析，分别构建了祁门4号与潮安大乌叶的AFLP分子标记连锁图谱，其中母本图谱包括由208个标记组成17个连锁群，总图距为24577 cM，平均图距为11 .9cM。父本图谱包括由200个标记组成的16个连锁群，总图距为2545.3 cM，平均图距为1 2.8 cM。本研究结果证实，AFLP标记是目前为止可用于茶树遗传图谱构建的最高效的分子标记;所选用的F:代群体是非常适合于构建遗传图谱的分离群体; “双假测交理论”对茶树分子遗传图谱的构建具有十分重要的推动作用。 5、通过对IsSR与RAPD标记位点进行连锁分析，构建了综合RAPD与IsSR标记的茶树分子图谱。母、父本分别包含9个连锁群，总图距分别为577.1 cM和550.3 cM，平均图距分别为19.9 cM与18.3 cM，所包含的标记数分别为30个与31个。6、整合AFLP、ISSR、RAPD3种标记数据并对其进行连锁分析，构建了国内外第一张综合AFLP、RAPD与ISSR3种标记的茶树分子图谱。母、父本分别有17个连锁群，总图距分别为2728.5 cM和2916.5 cM，平均图距分别为122 cM与13.0cM，所包含的标记数分别为224个与225个。这也是至今总图距最长，包含标记数最多的茶树分子连锁图谱。 7、采用AFLP一银染显色分子标记技术对40个茶树品种(株系)的遗传亲源关系进行研究。以3对引物组合扩增，共获得226条清晰可辨的AFLP条带，其中多态性带207条，多态性程度达91.5
祁世明[8]2014年在《基于水仙BAC末端序列的SSR标记开发与应用》文中认为水仙(Narcissus tazetta L.)为水仙属多年生球根花卉,现约近上万个园艺品种,其花色、花姿十分丰富,已成为世界各国广泛栽培的着名观赏花卉。但中国水仙品种稀少,花色单一新品种选育困难,制约了该花卉的生产和发展。本文利用部分水仙BAC末端序列自主开发新的SSR标记技术,并将其在水仙近缘属物种间转移使用,旨在为水仙种质鉴定、种间亲缘关系分析及遗传多样性分析等领域提供有效的技术支持,并为水仙的新品种选育工作奠定基础。其取得的主要研究结果如下：1.从已有的1149条水仙BAC末端序列中检索得到148个SSR位点信息,出现频率为12.88%,其中二核苷酸基序占主导地位,占89.19%,叁核苷酸基序次之,其中二核苷酸基序中(AT)。和(TA)。基序出现频率最高,占总数的32.43%,(AG)n=(TC)n基序次之。此外,二核苷酸基序和叁核苷酸基序长度变化范围较大,二核苷酸基序长度最长为76bp,叁核苷酸基序长度最长为27bp,二核苷酸基序较叁核苷酸基序平均长度高0.26,综合表明水仙基因组中SSR位点信息十分丰富,为开发水仙SSR标记奠定了基础。2.利用检索的部分SSR位点信息设计102对水仙BES-SSR标记引物,最终自主开发获得29对谱带清晰、重复性好、多态性高的水仙BES-SSR标记引物,成功筛选率高达28.43%。并对SSR-PCR反应体系中的各因素进行了优化分析,建立了最优的水仙SSR-PCR反应体系,且随机选取开发的SSR引物进行重复性检测及测序验证分析,综合表明本研究开发的水仙SSR标记引物重复性好,稳定性强,为可靠有效的分子标记引物。3.将水仙BES-SSR标记成功应用于水仙亲缘关系、种质鉴定及遗传多样性的研究中。采用上述开发的15对水仙BES-SSR标记引物对36份水仙材料进行分析,共得到506条扩增谱带,多态性谱带448条,多态位点百分率达88.54%,平均扩增多态性谱带29.87个,各引物Shannon氏多态信息指数I在0.3 005-0.4 861之间；各水仙材料间遗传相似系数在0.53557-0.96 640之间,经UPMGA法聚类表明与前人的研究一致,不同引物对同一材料表现出不同的特异性扩增谱带,表现水仙品种及SSR标记的特异性,表明开发的SSR标记可以将其应用于水仙种质鉴定、亲缘关系分析和遗传多样性分析等领域。4.探讨了水仙BES-SSR标记在水仙近缘属君子兰属植物上的通用性。利用上述29对水仙BES-SSR标记对21个君子兰品种进行检测分析,结果表明,其中11对引物表现出扩增谱带清晰、重复性好、多态性高且稳定的特点,通用性比率高达28.20%,获得扩增谱带329条,多态性谱带242条,平均多态位点百分率73.56%；且各君子兰品种间的遗传相似系数在0.54 711-0.81763之间,品种间差异较大,鉴定效果明显,表明本研究开发的水仙BES-SSR标记具有很好的通用性,丰富了君子兰属植物SSR标记的数量,为君子兰种质鉴定及遗传多样性方面奠定基础。
王江波[9]2012年在《中国水仙LTR反转录转座子研究及IRAP、REMAP分子标记的开发》文中研究说明中国水仙（Narcissus tazetta L.var. chinensis Roem）为叁倍体植物，基因组约为15G~22.5G，只开花，不结种子，不能进行有性繁殖，因此主要依靠鳞茎栽培进行无性繁殖。也造成了中国水仙在中国虽然有上千年的栽培历史，却品种稀少，花色单调的现象。新品种的培育工作只能从千万个栽培植株中发现个别变异的个体，但是基因的微小突变形成的新的品种通过传统的分子标记很难区分。本研究首次构建了水仙部分BAC文库，并将文库应用于BAC末端测序；利用BAC末端测序得到的序列信息，自主开发了水仙逆转录酶保守区引物，首次分离了水仙反转录转座子逆转录酶基因序列；利用BAC末端测序得到的序列信息，开发了水仙反转录转座子IRAP、REMAP标记；运用开发的标记将供试的中国多花水仙品种区分鉴定出来。主要研究结果如下：1、水仙BAC文库构建的研究本试验探索了水仙高分子量DNA的提取条件，创立了水仙高分子量DNA的提取方法，得到高质量的高分子量DNA。优化了BAC文库的构建条件，创建了水仙BAC文库构建体系，构建了第一个水仙部分BAC文库。构建的水仙BAC文库包含69120个克隆，平均插入片段约87kb，未发现空载体，经Southern杂交试验证明没有细胞器DNA的污染，能适用于水仙反转录转座子的研究。2、水仙反转录转座子RT基因的研究基于构建的BAC文库，进行末端测序，根据得到的水仙反转录转座子序列信息，自主开发设计逆转录酶保守区简并引物，从中国‘漳州水仙’、‘南日岛水仙’和荷兰‘Ziva’、‘Tahiti’等4个水仙品种基因组中分离出了43条独立的反转录转座子RT基因序列。得到的序列与NCBI己上传的反转录转座子RT序列同源，这43条氨基酸序列同源性在64%~95%之间，其中19个RT序列具有连续读码框，很可能具有潜在的转录活性。基于这43条氨基酸序列，用MEGA5分析软件进行分析，得到了Neighbor-Jioning遗传进化树，将它们分为7组，Family4中的RT序列全部来自3倍体品种，聚为一类；Family5中只有2个，且全来自荷兰品种‘Tahiti’、‘Ziva’品种，单独聚为一类；Family2、Family3、Family5叁组都不能翻译成氨基酸序列，没有转录活性；而Family7中的五条都可以完整的翻译，可能具有转录活性。3、水仙反转录转座子IRAP和REMAP标记的研究开发根据得到的反转录转座子3′-LTR序列，运用Primer5.0软件，开发了11条特异的IRAP正反向引物，将11条IRAP引物进行单引物PCR扩增，发现IRAP4、IRAP7、 IRAP8、 IRAP9、IRAP11等5条引物的多态性很好。引物运用GRAMENE Ssrtool设置3碱基重复，在3′-LTR序列开发设计16条SSR引物，与11条IRAP引物共有176个引物组合，随机选取引物对进行PCR扩增，具有很好的多态性。4、水仙反转录转座子IRAP和REMAP标记的应用随机选取部分RAPD、ISSR引物，结合开发的IRAP和REMAP标记引物，对中国漳州单瓣水仙‘金盏银台’、漳州复瓣水仙‘玉玲珑’和野生型‘南日岛水仙’、‘平潭水仙’以及新选育品种‘金叁角’、‘云香水仙’等6个中国多花水仙品种进行PCR对比试验，发现RAPD和ISSR很难将‘金盏银台’、‘玉玲珑’、‘南日岛水仙’、‘平潭水仙’、‘金叁角’5个品种区分开来，而IRAP和REMAP都可以很好的将中国水仙6个多花品种鉴别出来，形成自己特有的遗传图谱。
李润芳[10]2007年在《叁叶草的细胞学、分子标记及多倍体诱导研究》文中进行了进一步梳理叁叶草是豆科蝶形花亚科叁叶草属植物，其中白叁叶、杂叁叶是优质牧草，红叁叶既是优质牧草又是药用植物，其提取物具有植物雌激素样作用和抗癌作用，是目前国际上公认的治疗更年期综合征疗效确切的植物药。以上叁种叁叶草在我国有着广泛的分布，经长期的自然选择和人工选择，叁叶草种内产生了明显的分化，形成了丰富的种质资源。本研究运用常规的细胞学方法和近年来新发展起来的SRAP分子标记技术对8种叁叶草的种质资源进行了遗传多样性的研究，以期为叁叶草的品种选育及叁叶草种间亲缘关系的研究提供细胞学和遗传学依据。此外，本文还对实验中意外发现的一种白叁叶材料中的B染色体进行了研究，并进一步探索了巴东红叁叶草多倍体的诱导方法。其主要结果如下：1．细胞学研究不同品种的白叁叶草染色体数目相同均为2n=32，不同品种的红叁叶草染色体数目为2n=14，杂叁叶2n=16。其中有一种白叁叶草除具有正常的32条染色体外，还发现有B染色体存在。白叁叶草中具有叶型变异的植株与叶型正常植株的染色体数目相同，均为2n=32。核型分析结果表明：不同品种白叁叶草的核型公式、染色体相对长度组成和核型类型均存在较大差异；与已报道的白叁叶草虽然在染色体数目上相同，但核型公式、染色体相对长度组成和核型类型等方面存在差异。不同品种红叁叶草之间的核型公式、染色体相对长度组成和核型类型也有较大差异。说明不同品种的白叁叶草和不同品种的红叁叶草在细胞水平上均存在遗传多样性。2．SRAP分子标记经过PCR反应体系和扩增体系的优化，共筛选出40对SRAP引物对4份白叁叶草、3份红叁叶草、1份杂叁叶草及其10份叶型变异材料进行扩增。共扩增出792条带，其中多态性条带426，每个引物组合的多态性条带数为3—38不等，平均每个引物组合产生个多态性条带10.8，说明SRAP分子标记完全可以应用于叁叶草的遗传学研究。本试验中优化的SRAP分子标记体系也为今后其应用打基础。在相似系数为0.568时，可以将供试材分为3大类，一类为杂叁叶草；一类为红叁叶草；另一类为白叁叶草。杂叁叶与红叁叶的亲缘关系相对较近，相似系数为0.559，与白叁叶的亲缘关系相对较远，相似系数0.504。在白叁叶草中，相似系数为0.879时，可分为六类：叁种白叁叶草的亲缘关系最近为一类，武汉野生白叁叶草一类，叶型变异的白叁叶草分为四类。在DNA分子水平上，与白叁叶草相比，红叁叶草种内存在更为丰富的遗传多样性，特别是巴东红叁叶草与另外两种红叁叶草的亲缘关系相对较远，平均遗传相似系数仅为0.482。说明红叁叶草种内资源能为优良品种的选育提供好的基础。从SRAP标记聚类分析得到有叶型变异植株和正常植株并没有聚为一类，其相似系数低于白叁叶草种内相似系数，说明叶型变异植株和正常植株在DNA序列上有差异。3．白叁叶草B染色体研究本研究发现在白叁叶草的一个品种中有B染色体存在，其它几个品种中并未发现。前人对白叁叶草的染色体数目及减数分裂过程中的染色体行为及核型分析已有研究，但都没有关于发现B染色体的报道。对具有B和不具有B的核型比较观察，二者没有明显差异。B染色体形态上比A染色体小，通常小于1μm。在同一根尖的细胞中，所含的B染色体数目不同，在0～3之间变化。通过有丝分裂和减数分裂观察表明，B染色体是额外的，全部异染色质化，分离不规则。05年、06年B染色体在群体中的频率变化不大，差异不显着。4．巴东红叁叶草的多倍体诱导以巴东红叁叶草为材料，用秋水仙素直接处理萌动的种子和组织培养，进行了多倍体诱导方法的研究。结果表明：在秋水仙素3个浓度梯度和4个时间梯度的诱导中，浓度为0.1％和时间为16h效果较好。取根尖进行染色体制片观察显示有四倍体和嵌合体。在组织培养诱导中，以叶片、叶柄、子叶和下胚轴为外植体愈伤组织的诱导率都在90％以上，但从愈伤的长势和质量看，下胚轴是最理想的诱导材料。在培养基中添加0.1mg／L秋水仙素溶液处理15d效果最佳，再生植株的诱导率最高为46.7％，离体间接诱导法总体上要比活体诱导法效果好，可获得较多的纯合四倍体。
参考文献：
[1]. 不同类型水仙亲缘关系的分子标记研究[D]. 朱震霞. 南京农业大学. 2003
[2]. 利用SSR标记对38份茶树种质资源亲缘关系与品种分子鉴定的研究[D]. 王小萍. 四川农业大学. 2007
[3]. 利用SSR标记研究我国茶树无性系品种的遗传多样性和亲缘关系[D]. 段云裳. 南京农业大学. 2009
[4]. 中国石蒜属（Lycoris Herb.）种间亲缘关系与居群分子标记研究[D]. 袁菊红. 南京农业大学. 2007
[5]. 新疆野生油菜的利用研究[D]. 郑卓. 湖南农业大学. 2005
[6]. 多花水仙若干品种类型亲缘关系的分子生物学研究[D]. 吴菁华. 福建农林大学. 2004
[7]. 茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究[D]. 黄建安. 湖南农业大学. 2004
[8]. 基于水仙BAC末端序列的SSR标记开发与应用[D]. 祁世明. 福建农林大学. 2014
[9]. 中国水仙LTR反转录转座子研究及IRAP、REMAP分子标记的开发[D]. 王江波. 福建农林大学. 2012
[10]. 叁叶草的细胞学、分子标记及多倍体诱导研究[D]. 李润芳. 华中农业大学. 2007
标签：园艺论文; 水仙论文; 分子标记论文; 引物设计论文; 遗传多样性论文; 基因多态性论文; 基因位点论文; southern杂交论文; 石蒜论文; 多态论文; ssr标记论文;