贾建萍[1]2003年在《生物合成谷胱甘肽及其发酵动力学模型的构建》文中研究说明利用碘量法、可见分光光度法和紫外分光光度法这3种方法对谷胱甘肽的分析方法进行了研究，结果表明紫外分光光度法效果最好，该方法的平均相对误差均在3％以下，具有平行性好、稳定和灵敏的特点，适合于性状不稳定的谷胱甘肽含量的测定。 以编号为346的酿酒酵母为出发菌株，通过紫外线和~(60)Coγ射线诱变处理，运用推理育种技术，选育到一株抗氯化锌和抗乙硫氨酸的突变株0.5Eth400-5。该菌株经摇瓶发酵谷胱甘肽产量为165.96mg／L，较出发株提高3.5倍，每克干细胞含谷胱甘肽19.76mg，较出发株提高3.2倍。菌株经10次传代培养，谷胱甘肽产量下降10.7％，是一株性状较稳定可深入开发研究的优良菌株。 应用Plackett-Burman实验设计和响应面分析方法对突变株0.5Eth400-5积累谷胱甘肽的培养条件进行了系统研究和优化，得到了优化的培养条件：葡萄糖1.95％，糖蜜1.95％，蛋白胨3％，Cys·HCl 0.097598％，MgSO_4·7H_2O 0.5％，甲硫氨酸0.048％，生物素2.4×10~(-6)％，肌醇7.5×10~(-3)％，酵母膏0.05％，麦芽汁3％，NH_4H_2PO_4 0.055％,VB_1 8×10~(-4)％，(NH_4)_2SO_4 1.24％，K_2HPO_4 0.3％，FeSO_4 3ppm,ZnSO_4 3ppm,CuSO_4 0.5ppm，250mL叁角瓶装30mL培养基，接种量为10％，28℃，培养3d，摇床转速为200r／min。采用此优化工艺，谷胱甘肽产量达235.7mg／L，比优化前提高45.4％。 在优化的培养工艺基础上，在5升发酵罐中，通过分批补料的方式流加培养基，研究了谷胱甘肽的发酵规律，得出发酵36h谷胱甘肽产量达最大值638.91mg／l。 对酿酒酵母0.5Eth400-5发酵生产谷胱甘肽的动力学特性进行研究，建立发酵过程菌体生长、谷胱甘肽形成和基质消耗动力学模型。通过数据回归分析，Logistic方程、Luedeking-Piret方程及与Luedeking-Piret方程相似的基质消耗方程能很好的分别描述菌体生长、谷胱甘肽合成及葡萄糖的消耗过程，菌体生长动力学模型为：C_x(t)=(0.2272e~(0.27255t))／(0.9927+0.007329e~(0.27255t))谷胱甘肽合成动力学模型为：C，(t)= 1 .1 128‘027255‘0 .9927+o.007329eo27255‘+74.9794hi(0.9927+0.00732矢”·27255‘)一1.1128葡萄糖消耗动力学模型为:c，(t)=32.52359-0 .02359eo2，255‘0 .9927+0.007329eo27255‘o.1797ln(0.9927+o.oo7329e”.2，2，，‘)，叁个模型的线性相关系数R值均在0.9790以上，正确地反映了谷肤甘肤的发酵过程及其动力学机制。
田军[2]2004年在《酿酒酵母流加发酵同时生产S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽的研究》文中研究指明SAM和GSH是细胞内具有重要生理功能的小分子。由于SAM和GSH在酿酒酵母细胞内的代谢途径密切相关，我们设计了一种在酿酒酵母细胞内同时生产这两种胞内小分子的策略。 本论文的主要目标是提高SAM和GSH的生产能力。首先，为了精确控制发酵液中葡萄糖的浓度，构建了一个基于进料物总质量的流加控制系统；接着，为提高SAM和GSH的生产效率，开发出了一个两阶段流加策略。指数流加阶段主要用于减少发酵过程中乙醇的生成，提高细胞的密度。为此，对初始培养基进行了优化。采用优化后的培养基，细胞密度、SAM和GSH的产量分别达到了8.77g／L，0.81g／L和105g／L。然而，由于转化阶段部分葡萄糖以发酵途径代谢生成大量乙醇，使得SAM和GSH对葡萄糖的得率相对较低，分别为0.039和0.0035。为减少转化阶段乙醇的生成和提高SAM和GSH对葡萄糖的得率，转化阶段采用恒速流加策略以提供SAM和GSH合成所必须的能源和前体物质。采用恒速流加策略减少了乙醇的生成，SAM和GSH对葡萄糖的得率分别达到了0.048和0.0038。 在此基础上，为进一步提高SAM和GSH的生产效率，尝试了重复流加的操作方式。在单批流加发酵结束后，反应器中细胞的比生长速率约维持在0.08h~(-1)左右。在5.0L的反应器中，单批流加发酵结束后，放掉部分发酵液使反应器内剩余发酵液2.0L，以24.7g／h的速率恒速流加葡萄糖，使细胞密度提高了3倍，使SAM和GSH的生产效率分别提高了5倍。 另外，还构建了一个室模型来描述酿酒酵母流加发酵生产SAM和GSH过程。模型的模拟结果与实验数据吻合良好。
张炜[3]2011年在《2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌的筛选、发酵工艺优化及其动力学研究》文中研究说明本文从土壤中分离得到一株2-酮基-D-葡萄糖酸(2-KDG)产生菌,综合16S rDNA序列和系统进化分析确定该菌属于沙雷氏菌属(Serratia),命名为Serratia sp. BK-98。采用Plackett-Burman (PB)试验设计,从影响2-KDG生物合成条件的14个因素中筛选出具有显着效应的3个因子：装液量、发酵时间和初始pH值。在此基础上通过中心组合设计实验(central composite design, CCD)和响应面分析(response surface methodology, RSM)确定了装液量、发酵时间和初始pH的最适值分别为6.6 mL、57.9 h和5.0。在优化条件下,2-KDG的100 mL摇瓶发酵产量达到了187.8 g/L,100 L发酵罐产量达到了192.2 g/L,分别较优化前提高了142.6%和148.3%,这两个实验结果均与模型的预测值191.4 g/L非常接近。在对筛选的产2-KDG的沙雷氏菌Serratia sp. BK-98摇瓶培养条件优化的基础上,进一步在100 L发酵罐中进行了2-KDG分批发酵实验,对影响2-KDG生物合成的溶氧(Dissolved Oxygen, DO)和pH两个因素进行了优化,并确定了DO和pH的最适值分别为30%和6.0。在此最优条件下,2-KDG的100 L发酵罐产量达到了211.2 g/L。同时根据此优化条件下的发酵实验结果,分别采用Logistic方程、Leudeking-Piret方程和类似Luedeking-Piret方程,建立了描述分批发酵过程中菌体生长、产物生成和底物消耗的动力学模型。运用Origin 8.0软件对模型的预测值和实验数据进行非线性拟合,结果表明模型预测值和实验值吻合较好,说明此动力学模型对2-KDG的发酵生产具有指导意义。
许庆龙[4]2008年在《丙酮酸发酵光滑球拟酵母过程功能的强化》文中研究说明在利用微生物细胞过量合成生物基化学品的过程中,需要考虑的问题是:如何优化或强化微生物细胞的过程性能,以提高目标代谢产物的生产效率。本文以一株能在胞外大量积累丙酮酸的光滑球拟酵母营养缺陷型菌株(Torulopsis glabrata CCTCC M202019)为研究菌株。以动力学模型和过程控制为技术手段,围绕如何调控光滑球拟酵母的营养环境条件以强化T. glabrata的过程功能开展研究。主要研究结果如下:1不同初始维生素浓度下,细胞生长和丙酮酸合成具有显着差异:较高的初始维生素浓度(14 ml/L)可提高最终细胞浓度(20.03 g/L)和细胞生长持续时间,但降低了丙酮酸对葡萄糖得率(0.41 g/g);较低的初始维生素浓度(6 ml/L)能提高丙酮酸的得率(0.82 g/L)但使细胞生长微弱(6.71 g/L);通过指数流加维生素可将比生长速率控制在设定值附近,但控制较高比生长速率(μset为0.05 h-1)时最终碳流较多流向细胞生长,控制较低比生长速率(μset为0.01 h-1)可以获得较高的最终丙酮酸浓度(81.3 g/L)和得率(0.67 g/g),但丙酮酸生产强度较低(0.91 g/(L h))。在上述分析基础上,提出了基于维生素指数流加的比生长速率分步控制策略:在16-34 h时将μset定为0.05 h-1,在34 h和64 h分别切换到0.02 h-1和0.01 h-1,使最终丙酮酸浓度、产率和和生产强度比分批发酵分别提高了34.5%、22.9%和6.9%;2对不同葡萄糖浓度下光滑球拟酵母分批发酵生产丙酮酸的动力学模型分析发现,葡萄糖浓度是影响光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸过程功能的关键因素之一。在发酵初始阶段,低浓度葡萄糖可维持较高的菌体比生长速率;对数生长中前期,葡萄糖快速进料使菌体浓度达到最大值,并实现碳流从菌体生长转向丙酮酸积累;对数生长后期葡萄糖浓度控制在33.4 g/L以维持高丙酮酸对葡萄糖产率系数(0.71 g/g)。采用奇异控制的葡萄糖流加方式,在7L发酵罐上控制不同发酵阶段葡萄糖浓度处于最佳水平以强化光滑球拟酵母过程功能,丙酮酸产量(83.1 g/L)、产率(0.621 g/g)、生产强度(1.00 g/(L h))与分批发酵对比,分别提高了21.3%、21.6%和29.9%;3 T. glabrata CCTCC M202019分批发酵生产丙酮酸过程中,较高的发酵温度加速T. glabrata积累丙酮酸;而较低的温度则可减轻高浓度丙酮酸对细胞生长和产酸的抑制,提高细胞后续产酸能力。运用考虑产物抑制的Logistic方程等对发酵过程进行模拟,得到不同温度下发酵动力学参数,然后运用不同的方程对动力学参数进行拟合,进而得到丙酮酸分批发酵的最佳温度控制策略:在发酵初始阶段(0-8 h)发酵温度控制在34 oC以维持较高的菌体生长速率和丙酮酸合成速率;发酵中期(9-42 h),逐步将发酵温度降到27oC以获得代谢流强化和细胞衰亡之间的最佳平衡;然后维持27 oC至发酵结束。采用这一最佳温度控制轨迹,最终发酵周期缩短12 h,丙酮酸产量(80.4 g/L)、对葡萄糖产率(0.70 g/g)和生产强度(1.32 g/(L h))则分别提高了12.9%、6.9%和32.8%,而发酵副产物甘油和α-酮戊二酸产量则比30 oC恒温发酵分别下降了59.2%和44.7%。
聂敏[5]2010年在《发酵法生产谷胱甘肽及其高产策略研究》文中提出谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合形成的叁肽化合物,广泛分布于自然界的生物体中,在活细胞内具有清除自由基、抗氧化、解毒等生理功能。近年来,随着研究的不断深入,GSH在临床医药、食品加工、化妆品以及畜牧生产中都将具有良好的应用前景。微生物发酵法是目前GSH工业化生产最具竞争力的方法之一。本论文以GSH积累株Candida utilis SZU 07-01为出发菌株,以实现GSH发酵的高产量、高得率及高生产强度为目标,首先研究了培养基中碳氮比对GSH生物合成的影响,之后在5 L发酵罐中比较了恒速补料和指数补料方式对GSH发酵生产的影响。在此基础上模拟了多项式补料方式,并将其运用于GSH的高密度发酵生产。为了进一步提高GSH的总产量,研究了氨基酸的添加策略。本论文的主要研究内容如下:(1)摇瓶发酵条件下考查了氮源及碳氮比对细胞生长及GSH合成的影响,选择了分别对细胞生长和GSH合成具有明显优势的氮源,即尿素和硫酸铵。进而,分别以两者为单一氮源考查了相应发酵条件下的最佳碳氮比。以硫酸铵为氮源时,最佳C/N比为8.3 mol/mol;而以尿素为氮源时,最佳C/N比却为5.6 mol/mol。(2)分析了氮源的利用率与GSH生物合成的关系,发现在单一氮源和混合氮源条件下,氮源利用率均在30%左右最佳。两种单一氮源条件下的分批培养实验结果表明,尿素在促进细胞生长和GSH合成方面均有优势,并采用发酵动力学模型对GSH分批发酵结果进行了定量分析与解释。(3)通过分批培养确定了发酵初始葡萄糖浓度为26.0 g/L,进而考查了恒速流加和指数流加补料方式对GSH生物合成的影响。在此基础之上,模拟了多项式流加策略,并在总糖浓度为200 g/L的前提下将其应用于细胞的高密度发酵过程。最终细胞干重和GSH产量分别达到91.20 g/L和825.0 mg/L,大大提高了细胞和GSH的产量和生产强度。(4)摇瓶发酵条件下,考查了L-蛋氨酸添加对GSH合成的影响,发现L-蛋氨酸添加浓度为60 mmol/L时,GSH产量和胞内GSH含量均有最明显提高。由于GSH是胞内产物,所以除了要获得较高的细胞密度之外,胞内GSH含量的积累也很重要。为此,在高密度发酵基础上,考查了添加L-半胱氨酸对GSH合成的影响,结果表明,在细胞生长停止之后,一次性添加30 mmol/L的L-半胱氨酸效果最好,GSH最高产量为1104.3 mg/L,胞内GSH含量最高达到2.10%。(5)据此,采用前期添加60 mmol/L的L-蛋氨酸,细胞停止生长之后一次性添加30 mmol/L的L-半胱氨酸的氨基酸添加策略,使得最终GSH产量有了进一步提高,为1247.1 mg/L,胞内含量亦达到2.41%,GSH生产强度达到26.0 mg/(L·h)。
王玉磊[6]2013年在《基于能量代谢分析的S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产研究》文中进行了进一步梳理S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是生物体内两种重要的含硫生物活性小分子化合物。SAM在临床上常用于肝病、关节炎和抑郁症的治疗。GSH作为生物体内最重要的活性巯基化合物，具有提高机体免疫力和抗氧化等功能。SAM和GSH分别在医药、食品、化妆品和保健品等领域有着广泛的应用。酵母发酵法被认为是SAM和GSH生物合成的最有潜力的方法。SAM与GSH的合成均需要能量的参与，在SAM与GSH生物合成过程中，能量代谢与物质代谢一样，在其发酵过程中占有重要地位。其中，ATP作为限制性底物和能量物质，其含量的高低更是决定着底物的转化效率以及SAM和GSH能否高效合成。本论文以Candida utilis CCTCC M209298生物合成SAM和GSH过程中胞内能量代谢规律为指导，以实现SAM和GSH联合高产为目标，从胞内ATP的有效利用和外源性能量辅助物质添加以增加胞内ATP的供给等两个方面入手，对SAM和GSH的发酵联产情况进行研究，主要结果如下：（1）研究了与SAM和GSH合成密切相关的10种氨基酸对C. utilis CCTCC M209298细胞生长和产物合成的影响，发现L-蛋氨酸和L-半胱氨酸对SAM和GSH的合成影响最为显着。分批培养结果表明，L-蛋氨酸和L-半胱氨酸最适添加浓度分别为6g/L和6mmol/L。分析了分批培养时C. utilis CCTCC M209298胞内ATP代谢规律，提出以胞内ATP代谢规律为指导的两阶段氨基酸添加策略，即在发酵0h一次性添加6g/L L-蛋氨酸，发酵21h一次性添加6mmol/L L-半胱氨酸，实现了对发酵中后期胞内ATP的充分利用，最终SAM和GSH联产总量达669.3mg/L，比对照提高了124.6%。（2）在摇瓶发酵条件下考察了柠檬酸钠对SAM和GSH合成的影响，发现柠檬酸钠对SAM和GSH的合成均有一定的促进作用，且低浓度柠檬酸钠（如2g/L）有利于GSH的合成，而高浓度柠檬酸钠（如10g/L）对SAM的促进作用更为明显。采用响应面分析法对柠檬酸钠添加浓度及其添加时间进行优化，模型预测和验证实验结果均表明在联产发酵6h时一次性添加10g/L柠檬酸钠的效果最佳。考虑到柠檬酸钠的碱化作用，进一步在发酵罐中考察了柠檬酸钠对SAM和GSH联产的影响，结果表明在发酵15h时一次性添加2g/L柠檬酸钠的添加方式最佳，在此添加方式下，SAM和GSH联产总量达663.9mg/L，比对照提高了27.5%。通过对SAM和GSH分批发酵过程进行分析，发现在发酵后期柠檬酸钠的添加显着提高了胞内NADH和ATP的水平（与对照相比），同时柠檬酸钠能够提高S-腺苷蛋氨酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，抑制己糖激酶的活性。（3）利用恒化培养手段对SAM和GSH生物合成的培养条件进行优化，获得了细胞生长期有利于SAM和GSH高效合成的环境条件，即28℃、pH4.5和400r/min。据此，提出了分批培养两阶段环境条件控制策略，结果SAM与GSH联产总量达607.0mg/L，比对照提高了13.3%。将此策略与L-半胱氨酸添加策略、柠檬酸钠添加策略相结合，使得SAM和GSH的联产总量有了进一步提高，为751.3mg/L，GSH胞内含量达3.09%，SAM胞内含量亦达到2.75%。
都雯玥[7]2016年在《重离子辐照并筛选截短侧耳素高产菌株的研究》文中研究说明截短侧耳素是由斜盖菇属真菌Clitopilus pinsitus深层发酵产生的抗生素,可以与细菌核糖体50S亚基结合,抑制细菌的蛋白质合成。其衍生物类抗生素泰妙菌素、沃尼妙林对葡萄球菌、链球菌和克雷帕氏菌具有很好的抑菌作用,可用于治疗猪痢疾和地方性肺炎等猪疾病,而且具有生物利用率高、毒性低和残留少的优势。目前,存在的主要问题是截短侧耳素产生菌株效价低,发酵周期长,发酵技术不成熟,因此,本研究以截短侧耳素产生菌株为材料,优化原生质体制备条件,筛选通过重离子辐照的再生菌株,以期选育出截短侧耳素产生菌高产菌株。本论文首先采用原生质体诱变技术对斜盖菇属真菌原生质体进行诱变处理,实验通过单因素实验和正交实验研究了菌龄、破壁酶种类和浓度、稳渗剂种类和浓度、酶解时间和温度等条件对截短侧耳素产生菌Clitopilus pinsitus原生质体的得率和再生率的影响;并优化了原生质体制备条件。最终确定其最佳制备及再生条件为:5d菌龄,1.5%蜗牛酶+1.5%纤维素酶复合酶,0.4mol/L甘露醇,25℃酶解1.5h。该条件下原生质体制备量为5.9╳107个/mL,其再生率为1.20‰。然后,实验选用不同吸收剂量的~(12)C~(6+)离子束辐照斜盖菇属真菌原生质体,以期选育出截短侧耳素高产变异株。结果显示:~(12)C~(6+)离子束吸收剂量为1.5 Gy的条件下,斜盖菇属真菌原生质体变异率为43.62%。随后,实验利用金色葡萄球菌对截短侧耳素有较高敏感性的特点建立了一种琼脂柱高通量筛选法,实验结果表明:截短侧耳素的产量与抑菌圈直径为显着正相关,其皮尔森相关系数为0.956(P<0.01),即通过观察抑菌圈直径的大小,可以初步筛选出截短侧耳素产量较高的菌株。最终选育出C.pin15I5E和C.pin15II6B两株正变异株,其产量较出发菌株分别提高16.17%和15.47%。最后,实验采用Logistics方程和Luedeking-Piret方程建立截短侧耳素高产突变株发酵的菌体生长、产物形成和底物消耗的发酵动力学模型,更好地认识截短侧耳素发酵过程中菌体生长和产物形成的机制,达到提高产物发酵指标的目的。本实验结果表明,重离子束辐照原生质体是行之有效的工业微生物诱变育种方法。
杨利博[8]2015年在《Yarrowia lipolytica高渗发酵生产赤藓糖醇及高渗响应机制研究》文中指出赤藓糖醇(Erythritol),学名1,2,3,4-丁四醇,是一种新型甜味剂和食品添加剂,具有吸湿性小,热稳定性好,抗龋齿等优点。目前,发酵生产赤藓糖醇主要以蔗糖、葡萄糖、粮食类淀粉质为主要原料,原料成本较高且易导致粮食安全问题。甘油作为一种非粮碳源已被广泛应用于多种高附加值产品的发酵生产。但甘油具有较高的渗透压,高渗抑制细胞生长并导致赤藓糖醇生产强度较低,该问题严重制约以甘油为底物发酵生产赤藓糖醇。本研究以一株以葡萄糖为底物的非传统酵母Yarrowia lipolytica为出发菌株,通过高效的可视化诱变选育方法筛选出耐甘油高渗菌株,对甘油高渗培养基进行系统优化并建立了赤藓糖醇高渗发酵动力学模型,进而提出一种两阶段渗透压控制补料分批发酵高产赤藓糖醇策略,并对Y.lipolytica高渗响应机制进行了蛋白组学及转录水平研究。主要研究结果如下:(1)耐甘油高渗高产赤藓糖醇菌株诱变选育对一株以葡萄糖为碳源的Y.lipolytica CICC 1675进行ARTP和DES复合诱变处理,并结合高效的可视化TTC高渗筛选方案,从500株初筛菌株中筛选得到一株耐甘油高渗高产赤藓糖醇突变株Y-07,菌体量为12.8 g·L–1,赤藓糖醇产量为43.5 g·L–1,得率Yp/s为0.36 g·g–1,分别比出发菌株提高了91.0%,217.5%,71.4%,且遗传性状稳定。初步确定了突变株Y-07的最适发酵条件:甘油200 g·L–1,尿素1.68 g·L–1,酵母膏0.5 g·L–1,玉米浆0.5 g·L–1,CaCl2·2H2O 500 mg·L–1,ZnSO4·7H2O 100 mg·L–1,MnSO4·4H2O 10mg·L–1,FeSO4·7H2O 100 mg·L–1,MgSO4·7H2O 500 mg·L–1,KH2PO4 0.2 g·L–1,pH 3.0,种龄24 h,接种量10%(v·v–1),装液量20/250 mL。最终赤藓糖醇产量为69.4 g·L–1,Yp/s为0.37 g·g–1,生产强度P为0.41 g·L–1·h–1,分别比出发菌株提高263.4%,60.9%,272.7%。(2)Y.lipolytica发酵甘油产赤藓糖醇培养成分优化及高渗发酵动力学建立利用Plackett-Burman实验设计确定甘油、尿素、NaCl为赤藓糖醇产量的显着影响因素,利用3因素5水平的中心组合实验(CCD),构建了响应面(RSM)及人工神经网络(ANN)模型以预测最优显着因素组成,并比较了两模型预测精确性。结果表明ANN具有更精确的模型预测能力。利用遗传算法(GA)寻求ANN模型最优解,结果发现当甘油232.39 g·L–1,尿素1.57 g·L–1,NaCl 31.03 g·L–1时,赤藓糖醇最大预测产量为110.7g·L–1,实验验证产量为109.2 g·L–1。根据赤藓糖醇发酵不同阶段的发酵特性,利用Logistic和Luedeking-Piret方程结合Andrews及Bajpai模型构建了多阶段赤藓糖醇分批发酵动力学模型,该模型对菌体生长(X),底物甘油消耗(S)和赤藓糖醇生成(P)具有良好的预测和拟合能力,模型拟合值与实验值相关系数分别为0.981,0.994和0.992。为高渗环境下赤藓糖醇发酵过程提供了可视化的理论依据,为渗透压控制补料发酵策略建立提供动力学理论基础。(3)两阶段渗透压控制补料分批发酵生产赤藓糖醇研究渗透压显着影响菌体生长及多元醇合成模式。总糖醇得率及rE/M随体系渗透压的升高而增加,且赤藓糖醇产量随渗透压提升更为显着,NaCl可抑制甘露糖醇生成,最大菌体量随渗透压的提升而降低。赤藓糖醇发酵最适渗透压为4.17 osmol·kg–1。高渗显着促进赤藓糖还原酶(ER)的比酶活,而甘露糖醇-1-磷酸脱氢酶(M-1-PDH)被严重抑制。为进一步提升赤藓糖醇产量及生产强度,一种两阶段渗透压控制补料分批发酵策略被成功运用,甘油不仅作为底物还作为渗透压调节剂被利用。菌体生长阶段维持体系渗透压为4.25 osmol·kg–1,132 h以后控制体系渗透压为4.94 osmol·kg–1以维持全程高产物生成速率dpery/dt。最终赤藓糖醇产量为194.3 g·L–1,生产强度为0.95 g·L–1·h–1,分别比单一阶段渗透压控制补料发酵策略提高了25.7%和2.2%。为目前报道的以甘油发酵生产赤藓糖醇的最高产量。有效达到了高渗发酵赤藓糖醇高产量、高得率、高生产强度的统一。(4)蛋白组学及中心代谢基因转录水平研究Y.lipolytica高渗响应机制蛋白组学研究发现44种表达水平受渗透压显着影响的差异蛋白,主要分布于pI 3-10,Mw 14.4-97.4 kDa,主要涉及能量代谢、新陈代谢、细胞自救及胁迫响应途径等。在蛋白表达水平揭示高渗促进赤藓糖醇合成原因是与多元醇合成相关蛋白被显着诱导,如TKL、TPI、AKRs等。高渗还可诱导其它胁迫响应途径蛋白,如热激响应蛋白HSPs,氧化胁迫响应蛋白CAT、SOD等。并可通过抑制与蛋白及核酸合成相关酶的表达,如60S核糖体蛋白L2/L4、翻译延长因子、磷酸核糖转移酶,从而抑制菌体生长。此外,RT-PCR研究发现,高渗可抑制EMP途径基因TDH1、PGI1、PFK1、PYK1的转录水平;对糖异生途径基因GUT1,FBP1及TCA循环基因CIT1,KGD1转录水平有诱导作用,以强化高渗下的底物利用效率及能量供给。高渗可诱导HMP途径赤藓糖醇合成关键基因TKL1、ER1的转录水平,并使氧化应激响应蛋白基因SOD1,CAT1转录水平大幅上调,从而促进赤藓糖醇作为相容性溶质大量合成。本研究从蛋白表达及基因转录水平证实高渗促进赤藓糖醇合成的可能原因是EMP向HMP的代谢途径偏转。(5)渗透压保护剂及抗氧化剂提升赤藓糖醇生产强度不同初始渗透压可改变胞内游离氨基酸的组成及含量,渗透压提升会促进胞内游离氨基酸总量的增加。甘氨酸和脯氨酸是良好的渗透压保护剂。Y.lipolytica会将外源添加甘氨酸和脯氨酸转运至胞内并大量积累,以提升耐高渗胁迫能力。高渗可提升氧化应激响应关键酶SOD、CAT的酶活水平。添加抗氧化剂Asc、Cys可适当降低氧化胁迫对酵母细胞的破坏。渗透压保护剂及抗氧化剂添加可提升赤藓糖醇生产强度。利用两阶段渗透压控制补料发酵策略,加入30 mg·L–1甘氨酸、40 mg·L–1脯氨酸、30 mmol·L–1 Asc和3.0 mmol·L–1 Cys,发酵时间减少为174 h,甘油消耗速率为2.41 g·L–1·h–1,生产强度P为1.13 g·L–1·h–1,分别比未添加时增加了-14.7%、23.6%和18.9%,进一步提升了高渗发酵赤藓糖醇的生产强度,但对赤藓糖醇终浓度及得率未见显着影响。
周亮[9]2013年在《产黄青霉基因工程菌的生理代谢特性研究》文中研究表明本课题针对产黄青霉基因工程菌合成青霉素的生理代谢特性展开了相关研究。通过研究菌种制备工艺,确定了米孢子制作工艺和种子培养工艺。在摇瓶水平利用响应面分析方法对原始培养基配方进行了优化,优化后的培养基发酵效价达到了17101U/ml,比优化前提高了36.8%,且降低了杂质组分的含量。通过添加不同种类氨基酸发现Cys和Met对青霉素合成有抑制作用,Arg和Orn有促进作用。对不同工业用氮源的氨基酸组成进行了分析,发现生物氮素的氨基酸组分适合青霉素发酵,在相同含氮量条件下产量优于其它氮源,达到了13211U/ml。通过金属离子和维生素添加实验表明：FeSO4·7H2O浓度为0.44g/L、MnSO4·H2O浓度为0.141g/L、CuSO4·5H2O浓度为0.0035g/L青霉素效价分别比对照组提高6%、16.8%和17.2%。生物素浓度为30μg/L、VB1浓度为50μg/L、叶酸浓度为30μg/L时效价分别提高7.4%、5.8%和9.2%。在50L小试中对青霉素发酵工艺进行了初步研究,发现二级发酵比叁级发酵更适合此菌株生产青霉素,优化后的工艺中接种量为30%,接种菌龄为种子培养54h；在过程补料调控中应控制氨氮浓度为0.3-0.4g/L、PAA浓度为0.3-0.5g/L,发酵过程中硫酸根浓度不得低于20000ppm,并发现75h后补糖速率降为原来的95%对发酵影响不大。通过对菌丝形态和青霉素合成速率的相关性研究分析发现异化菌丝是降低青霉素合成速率的主要因素；最后构建了青霉素发酵动力学模型,使我们对菌种的生理特性有了更深层次的认识；利用主成分分析法发现PMV、残糖浓度、氨氮浓度、pH等几个参数可以作为青霉素发酵过程好坏的评价指标。
田玉庭[10]2010年在《辅酶Q_（10）高产菌株选育及发酵过程优化研究》文中认为辅酶Q_(10)是一种重要的生化药剂,临床上被广泛应用于心血管疾病的治疗。此外,辅酶Q_(10)因具备抗氧化性和消除自由基的功能,而今已扩展到食品和化妆品领域。当前,辅酶Q_(10)制备方法主要有化学法、动植物组织提取法和微生物发酵法。与前两种制备方法相比,微生物发酵合成辅酶Q_(10)具有成本低、无光学异构体及生物学活性高等特点,因而被认为是最具前途的生产方式。本研究以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为出发菌株,诱变育种结合定向筛选,成功获得一株高产辅酶Q_(10)突变株,后通过发酵过程优化控制,最大限度的发挥该突变株代谢合成辅酶Q_(10)的特性。主要研究内容和结果如下:(1)系统考察超声波破碎法、反复冻融法、研磨法、酸热法对根癌土壤杆菌细胞破碎和辅酶Q_(10)提取效果的影响。结果表明,酸热破碎法提取辅酶Q_(10)效果最好;其中,以盐酸破壁提取效果最佳,乳酸和硫酸次之。酸热破壁提取工艺的关键因子为:料液比、破壁温度和处理时间。中心组合设计和响应面分析结果显示,在3 mol/L盐酸处理条件下,酸热破壁提取最佳工艺参数为:料液比10.8 mL/g、破壁温度84.2°C、处理时间35.3 min。在最佳破壁工艺下,辅酶Q_(10)提取量能达到1.518 mg/g。(2)以根癌土壤杆菌1.2554为出发菌株,经高静水压诱变处理,筛选获得一株呼吸链抑制剂NaN3抗性突变株PN07。菌株PN07后经过紫外线和硫酸二乙酯复合诱变,获得一株酪氨酸缺陷型突变株MT18。菌株MT18后经高静水压、紫外线和硫酸二乙酯交替诱变,采用抗结构类似物(乙基硫氨酸、柔红霉素、维生素K_3)的抗性平板初筛,经摇瓶发酵复筛,最终获得一株辅酶Q_(10)高产菌株PK38,其胞内辅酶Q_(10)含量达2.30 mg/g干菌,较出发菌株提高51.51%。菌株PK38后经10次传代培养,辅酶Q_(10)含量无明显下降,表明PK38是一株遗传性状稳定的优良菌株。(3)采用单因素试验并结合Plackett-Burman试验设计,筛选出影响PK38细胞生长和辅酶Q_(10)产量的重要因子为:蔗糖、玉米浆干粉、硫酸铵、硫酸镁、生物素和茄尼醇。结合Box-Behnken设计和响应面分析,得到生产辅酶Q_(10)的最佳发酵培养基配方为:蔗糖37.2 g/L、玉米浆干粉37.1 g/L、硫酸铵7.0 g/L、硫酸镁0.4 g/L、生物素82.9μg/L、茄尼醇0.2 g/L、CaCl_2 140 mg/L、FeSO_4·7H_2O 0.2 mg/L、ZnSO_4·7H_2O 8 mg/L、烟酸8 mg/L。在最佳发酵培养基下摇瓶发酵72 h,生物量和辅酶Q_(10)产量分别可达到9.25 g/L和28.44 mg/L。(4)采用摇瓶发酵试验,利用单因素试验考察了初始pH值、发酵温度、接种量和发酵时间对PK38细胞生长和发酵生产辅酶Q_(10)的影响。结果表明,辅酶Q_(10)发酵最佳初始pH值、发酵温度、接种量和发酵时间分别为:7.2、30°C、8%和72 h。后利用5 L发酵罐,研究转速和溶氧浓度对辅酶Q_(10)发酵的影响。结果表明,较高转速和溶氧浓度有利于细胞生长,但不利于PK38胞内辅酶Q_(10)的代谢合成。后经采用分段控制溶氧工艺(0-36 h为90-100%,36-72 h为30%),最终辅酶Q_(10)产量为56.46 mg/L,比最优恒定转速下提高11.71%。(5)基于Logistic方程、Leudeking-Piret方程以及Luedeking-Piret-like方程得到了描述辅酶Q_(10)分批发酵过程的动力学模型和模型参数。经模型检验,结果表明,在蔗糖浓度为30 ~ 40 g/L范围内,该组模型适应性良好,能较好地拟合发酵过程,可反映菌株PK38分批发酵过程的动力学特征。(6)基于分批发酵动力学模型,以蔗糖为单一流加底物,分别考察了分批补料培养、恒速流加培养(高速、低速)和指数流加培养3种培养模式下,菌株PK38发酵生产辅酶Q_(10)的代谢特征。结果表明,指数流加培养策略为菌株PK38发酵生产辅酶Q_(10)最佳培养模式。该培养模式下,PK38最终生物量和辅酶Q_(10)产量分别达32.37 g/L和120.01 mg/L,与分批发酵相比,分别提高了126.11%和173.12%。
参考文献：
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[2]. 酿酒酵母流加发酵同时生产S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽的研究[D]. 田军. 浙江大学. 2004
[3]. 2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌的筛选、发酵工艺优化及其动力学研究[D]. 张炜. 浙江大学. 2011
[4]. 丙酮酸发酵光滑球拟酵母过程功能的强化[D]. 许庆龙. 江南大学. 2008
[5]. 发酵法生产谷胱甘肽及其高产策略研究[D]. 聂敏. 苏州大学. 2010
[6]. 基于能量代谢分析的S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产研究[D]. 王玉磊. 苏州大学. 2013
[7]. 重离子辐照并筛选截短侧耳素高产菌株的研究[D]. 都雯玥. 兰州理工大学. 2016
[8]. Yarrowia lipolytica高渗发酵生产赤藓糖醇及高渗响应机制研究[D]. 杨利博. 江南大学. 2015
[9]. 产黄青霉基因工程菌的生理代谢特性研究[D]. 周亮. 华东理工大学. 2013
[10]. 辅酶Q_（10）高产菌株选育及发酵过程优化研究[D]. 田玉庭. 西北农林科技大学. 2010