摘要：近年来，蛋白质芯片因其具有平行性、高通量、灵敏度高、样品用量少及检测速度快等优点而引起人们的高度关注。对蛋白质芯片技术及其目前的研究进展进行了简要综述，并在此基础上初步探讨了其在食品安全检测中的应用。
关键词：蛋白质芯片；高通量；食品安全检测；应用；
生物芯片是21世纪一项革命性的技术，包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室3个领域[1]，其中蛋白质芯片是一种高通量、高灵敏度、高特异性且微型化的蛋白质分析技术[2]。有关试验表明，该技术对多种疾病的早期诊断均有一定的作用[3]。它是继基因芯片后发展起来的一项高新技术，近年来又与色谱、质谱、凝胶电泳等联用，为阐明疾病的发生、发展机制及疾病的诊断和药物筛选提供前所未有的新信息，具有广泛应用前景和强烈社会需求[4]。国内外投入大量人力、物力进行蛋白质芯片的研发。瑞典的SPR（Surfaceplasrrlon resonance），美国的SELDI（Surface Enhanced Laser Desporption Ionization）及我国的光学代表作芯片技术已经获得实际应用[5，6]。但目前蛋白质芯片技术还不如基因芯片成熟，在制备工艺和检测方面还需进一步优化。随着该技术的不断完善，对生物学、医学、环境监测、食品检测等将产生巨大的影响。本文就蛋白质芯片技术及其在食品检测中的应用作简要介绍。
1 蛋白质芯片技术概论
1.1 蛋白质芯片技术的基本概念和原理
蛋白质芯片技术是指把制备好的已知蛋白质样品（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等）固定于经化学修饰的玻璃片、硅片等载体上，蛋白质与载体表面结合，同时仍保留蛋白质的物理和化学性质。根据这些分子的特性，通过蛋白质芯片技术可以高效大规模俘获能与之特异性结合的待测蛋白质，经洗涤、纯化后，再进行确认和生化分析。蛋白质芯片分析本质上就是利用蛋白质之间的相互作用，对样本中存在的特定蛋白质进行检测。其原理是将位置和序列已知的蛋白以预先设计的方式固定在尼龙膜、玻璃、硅片等载体上，组成密集的分子排列，当荧光、免疫金等标记物的靶分子与芯片上的探针分子结合后，通过激光共聚焦扫描或光耦合元件（CCD）对标记信号的强度进行检测，从而判断样本中靶分子的数量以达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的[7]。
1.2 蛋白芯片及其制作方式的分类
蛋白芯片可分为无活性和有活性两种形式[8]。无活性芯片是将已合成好的蛋白质点在芯片上，有活性芯片则是在芯片上点生物体（如细菌），在芯片上原位表达蛋白质。活性芯片可以提供模拟的机体内环境，对于蛋白质功能分析更有利。目前主要分为两种类型生物蛋白芯片：一种为在固相支持物表面高密集排列的探针蛋白质点阵；一种为微型化凝胶电泳板，即样品的待测蛋白在电场作用下通过芯片上的微孔道进行分离，然后经喷射进入质谱仪中来检测待测蛋白质的分子量及种类。蛋白芯片还可按其密度分为高、中、低密度芯片。低密度芯片一般是指一块芯片上放置400个以上的生物信息。密度的高低将决定芯片的技术难易、价格高低、应用范围及商业化普及的程度等。
1.3 蛋白芯片的制备过程
①载体的制备：一般分两类，一类是膜载体，一类是载玻片载体。膜载体主要指PVDF（polyvinylidenedifluoride）膜，载玻片载体是指经过特殊化学修饰或加工的载玻片。目前，玻璃、多孔硅胶、云母、硅片等都是常用的载体材料[9]。②蛋白质的预处理：制作过程中保持蛋白质的生物活性，成为蛋白质芯片发展的瓶颈技术。通常点样前必须选择合适的缓冲液将蛋白质溶解，以防止溶液蒸发使蛋白质载芯片的整个制作过程中保持水合状态，防止蛋白质变性。③芯片的点印：目前利用机械带动的点样头进行，点样头为不锈钢针头。为防止芯片表面蒸发，点样应处于密闭且保持一定湿度的空间进行，有时还需加甘油到蛋白质溶液中[10]。④蛋白质的固定：蛋白质芯片是在一定的孵育条件下利用探针俘获配体，以达到固定蛋白的目的[11]。芯片固定时放入湿盒中，37℃ 恒温 1 h 即可。⑤芯片的封阻：以防止待测样品中的蛋白质与之结合，形成假阳性。
1.4 蛋白质芯片的识别系统
由蛋白芯片、蛋白芯片识别仪、专用软件三部分组成。其最大特点在于将光、机、电、磁和生物技术紧密结合，具有自动判读并给出定性和定量检测结果、仪器自校功能、报表输出等功能和快速、重复性好、准确性高、光线均一、适用范围广泛等特点。
2 蛋白质芯片技术在食品安全检测中的应用
蛋白质芯片技术诞生以来，已在医学基础研究、临床诊断、药物筛选、测试与新药研发等方面得到广泛应用，但在食品安全检测中的应用鲜有报道。
2.1 食品中病原微生物的检测
病原微生物是食品生物性污染的最主要因素，也是引发人体食源性疾病的主要原因。传统的检测方法是培养分离法，整个过程耗时费力，已不能满足目前食品质量与安全控制体系的要求。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆Howell（2003）等[13]采用俗称软蚀刻的微接触印刷技术（Microcontact printing，μCP）对抗体进行修饰以保持其生物活性，再将其物理吸附于硅烷化修饰的玻片上，通过高分辨率的扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscopy，SPM）进行分析，制作了一种可用于检测大肠杆菌E.coli O157∶H7和鲑肾杆菌（Renibacterium salmoninarum）的抗体微阵列。实验结果显示，该芯片与其他病原菌的交叉反应少，检出浓度为7×107cfu/m L，检测时间为40 min。由此说明蛋白质微阵列是一种很有效的微生物检测方法。
2.2 食品中真菌毒素的检测
真菌毒素是真菌在适合的条件下产生的有毒次生代谢产物，常会导致家畜和人发生食物中毒，甚至可能造成致畸、致突变和致癌等严重危害。它们非常稳定，仅通过加热等处理很难将其去除。因此加强对真菌的检测，防止毒素超标的食品进入人类食物链就显得非常重要。目前真菌毒素的检测一般采用高效液相色谱法（HPLC）或酶联免疫吸附法（ELISA）。前者检测灵敏度高，但样品前处理烦琐、操作复杂、时间长；后者操作简便、快速，但在灵敏度上仍有待进一步提高。Tudos（2003）等[14]将酪蛋白与脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）共轭连接制成人工抗原，固定在芯片上，再加入含有DON抗体的待检测溶液，通过SPR技术检测反应信号，从而构建了一种用于对小麦中DON进行定量分析的免疫芯片。该芯片用盐酸胍处理可反复使用500次，最佳检测范围为2.5~30 ng/m L，检测结果与使用气质联用（GC/MS）检测一致。
2.3 食品中抗生素残留的检测
抗生素是指微生物在代谢过程中产生的、在低浓度下就能抑制其他微生物的生长和活动、甚至杀死其他微生物的化学物质。在食品（特别是动物性食品及制品）中，抗生素残留是否对人体健康有影响仍处于争议之中。现已普遍接受的观点主要是其对人体造成的过敏和变态反应、细菌耐药性和菌群失调。以往的检测方法主要有微生物检验方法、仪器分析方法和免疫学检测方法，但它们都有其各自的缺点。Knecht（2004）等[15]报道了一种可快速、自动、平行检测牛奶中10种抗生素残留的蛋白质微阵列，该阵列采用间接竞争ELISA模式，通过灵敏的CCD照相记录反应过程中产生的化学发光信号，单个组分检测所用时间不到5 min，10种组分的检测限在0.12~32μg/L之间，均符合检测要求，这表明蛋白质微阵列将有可能用于更多抗生素的平行检测，从而对乳品质量进行监控。Zuo（2006）等[16]构建了一种可同时检测食品中3种兽药残留的小分子微阵列（Small Molecule Microarrays，SMMs），检测时间不超过2 h，待测样品检测与加标回收实验结果表明所构建的微阵列具有良好的可靠性。
2.4 食品中农药残留的检测
农药残留是农药使用后残存于食品中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。食品中高农药残留不仅是化学性食物中毒的主要因素，而且能造成对人体的潜在慢性危害。预防这种危害的最有效方法就是加强对食品中农药残留检测的力度，因此检测食品中的农药残留同样具有重要意义。目前研究较多的检测技术主要有活体检测法、化学检测法、酶抑制法和仪器分析法等，但它们无法在时间和成本上同时满足实际应用的需要。Belleville（2003、2004）等[17，18]以小分子的农药敌草腈的代谢物2，6-二氯苯甲酰胺和阿特拉津为对象，以IC50值为指标，研究了在定量分析检测时影响竞争免疫微阵列灵敏度的各种因素，包括抗体的荧光标记方式和点样缓冲液等，以获得制备微阵列的最佳条件；再将所构建的微阵列用于水样中两种农药的定量检测，其最低检测限分别为1 ng/L和3 ng/L，实验结果明显优于ELISA和GC/MS检测方法。
3综上所述，蛋白质芯片技术的优点主要体现在：（1）快速、定量分析大量蛋白质；（2）使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标本即可进行分析和检测；（3）采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好。（4）所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强。其不足在于稳定性及操作复杂等因素限制。尽管如此，蛋白质作为生命活动的执行者，有巨大潜在研究和应用价值。随着研究的深入及蛋白质芯片各项技术的进步与成熟，可以预见这一高新技术将应用于更广的领域，是继基因芯片后对人类健康有巨大应用价值的芯片技术。它正成为食品安全快速检测中主要发展方向和非常重要的检测手段之一。
参考文献：
[1]周新，涂植光.临床生物化学和生物化学检验[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2003.21.
[2]Uetz P，Giot L，Cagney G，et al.A comprehensive analy-sis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.Nature，2000，403：623-627
[3]Zhu H，Bilgin M，BanghamR et al.Global analysis ofprotein activities using proteome chips.Science，2001，293：2101-2105
[4]Predki P F.Functional protein microarrays：ripe for discov-ery.Current Opinion in Chemical Biology，2004，（8）：8-13
论文作者:许宏虹
论文发表刊物:《基层建设》2019年第19期
论文发表时间:2019/9/21
标签：蛋白质论文; 芯片论文; 技术论文; 阵列论文; 蛋白论文; 食品论文; 农药论文; 《基层建设》2019年第19期论文;