杨震1 姚顺1 曾海涛2 苏晨1 陶军1（通讯作者）
（1中山大学附属第一医院高血压血管病科 广东广州 510080）
（2中山大学附属第六医院生殖中心 广东广州 510080）
【摘要】背景：目前对糖尿病的绝经前期女性内皮功能的改变尚不明确。目的：探讨糖尿病对绝经前期女性内皮功能的影响。方法：选择40例年龄 43.9±6.2岁的人群作为研究对象，分为两组: 血压正常的绝经前女性（22例） 、患糖尿病血压正常的绝经前女性（21例），使用高分辨率超声技术评估血管舒张功能；利用流式细胞仪测定两组 CD34和KDR双标阳性循环EPCs水平，使用ac-LDL及 lectin 荧光标记方法评估体外培养EPCs数量；检测EPC迁移能力和增殖能力；并探讨血管舒张功能与EPC功能的关系。结果及结论：使用超声技术检测血管扩张功能显示，合并糖尿病的血压正常绝经前女性FMD明显低于非糖尿病的血压正常绝经前女性（P<0.05）。两组受试者GMD均没有明显差异（P>0.05）。流式细胞仪显示循环EPCs水平及荧光标记证实培养的EPCs数量在正常血压的绝经前女性中明显差异高于合并糖尿病的血压正常绝经前女性（P>0.05）。同样，循环EPCs的迁移和增殖功能在血压正常的绝经前女性明显高于合并有糖尿病的绝经前女性（P<0.05）。通过流式细胞仪分析及细胞培养试验，可以发现FMD分别与循环EPCs水平（r=0.41， P<0.05）及培养的EPCs数量（r=0.74,P<0.05）呈明显线性相关。同样，EPC的迁移能力和增殖能力也分别与血浆FMD呈线性相关（r=0.64，P<0.05；r=0.56，P<0.05）。这些结果说明合并糖尿病的绝经前期女性的内皮功能下降，包括内皮依赖性血管舒张功能下降以及体内EPC数量减少和功能下降，提示维持内源性血管损伤修复能力及改善内皮功能可能是合并糖尿病的绝经前女性血管保护的重要机制之一。
【关键词】干细胞；内皮祖细胞；绝经前期；糖尿病
【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）05-0104-02
糖尿病是一个以代谢紊乱为特征，增加患病率和死亡率的代谢性疾病。相比较非糖尿病患者，糖尿病患者发生心脑血管事件并发症的风险很高，这与内皮损伤和内皮功能障碍有关[1]。
大量研究发现来源于骨髓、外周血和脐血中的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）是参与再内皮化，修复内皮损伤以及改善内皮功能的一类干细胞亚群[7-10]。在心血管危险因素影响下，如糖尿病，肥胖或吸烟，EPCs的数量和活性则会下降，这可能导致内皮损伤的发生与发展。然而，在绝经前期女性中，心血管疾病风险的发生几率要较绝经期后女性要低。绝经前女性维持高水平的EPCs的数量和功能可能与血浆雌激素水平有关[2]，而绝经期后女性心血管疾病风险增加可能与内皮损伤及功能受损部分相关[3]。
我们前期研究表明，循环EPCs的数量和活性在绝经前期女性中维持较高水平，这也说明了保持正常的内皮修复能力可能有利于绝经前期女性的血管保护作用[12]。然而，合并糖尿病的绝经前期女性中EPCs保护血管的有利效应是否存在仍不清楚，所以本研究探讨糖尿病对绝经前女性内皮功能的影响，旨在阐明合并糖尿病的绝经前女性血管保护的可能机制，并为合并糖尿病相关血管损伤修复寻找新的干预靶点。
1.材料与方法
1.1 材料与试剂
CD34流式细胞荧光抗体购于BD公司，EGM-2培养基购于Clonetics公司，纤维连接蛋白购于Hematologic Technologies公司, ac-LDL购于Molecular Probes公司，Lectin购于Sigma公司，二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自Fluka公司。
1.2 对象
我们招募了40例年龄 44.5±5.2岁志愿者，分为两组：绝经前健康女性（22例）、和合并糖尿病的正常血压绝经前女性（21例）。依据美国糖尿病协会专家委员会报告指南，对新近诊断且未进行药物治疗的绝经前期合并2型糖尿病的女性进行诊断[20]。并且排除了心血管疾病、恶性肿瘤、感染或炎症性疾病，以避免对循环EPCs数量和功能产生影响；孕妇、哺乳期妇女、子宫切除及吸烟者也不纳入本研究。所有志愿者通过询问病史、详细的体格检查和实验室检查。
1.3 流式细胞仪测定循环EPCs水平
取200?L外周血与FLK-1流式细胞荧光抗体一抗孵育20 min，再加入FLK-1二抗孵育20min，之后加入CD34流式细胞荧光抗体孵育20min。最后将红细胞溶解，剩余细胞用20g/L多聚甲醛固定，以流式细胞仪进行检测，CD34和KDR双阳性细胞为循环EPCs。
1.4 荧光标记方法评估培养EPCs数量
取各组外周血约20ml置于肝素管中，并以PBS稀释。加入Ficoll-Pague分离液后离心，小心提取血清和Ficoll分离液交界处的单个核细胞层，置于以纤维连接蛋白预衬的EGM-2培养基中。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆将上述含有外周血单个核细胞的培养基置于含有体积分数5%CO2、37℃孵箱中培养，在倒置荧光显微镜下动态观察细胞形态学变化。细胞培养2周后取一部分贴壁细胞在一定浓度乙酰化低密度脂蛋白溶液中孵育1h，之后20g/L多聚甲醛固定，以一定浓度凝集素抗体溶液孵育1h，并置于荧光显微镜下观察拍片，红色和绿色双染色细胞为EPCs。
1.5 EPC迁移能力检测
将含 50ng/ml VEGF 的DMEM 培养液加入改良 Boyden 小室的下室，用2.5g/L 胰酶消化贴壁细胞，悬浮于DMEM 培养液中。将含50ng/ml悬浮在500ul DMEM培养液注入上室，培养24h后，轻轻刮去滤膜上面的未迁移细胞，用甲醇固定，Giemsa溶液染色，计数迁移的细胞。
1.6 EPC能力增殖检测
EPC培养7d后，如上述用0.25%胰酶消化贴壁细胞，悬浮于DMEM培养液中。将相同数量的EPC接种到包被有人纤维连接蛋白96孔培养板，每孔加10μL MTT(5g/L)，培养4h后，弃去上清液，再加入二甲基亚砜(150μL/孔)充分振荡10min后，在酶标仪下于波长490nm处测A值。
1.7 血管舒张功能检测
通过高分辨率超声，使用5～12MHz的线性探头，基于HDI5000系统（Wshington，USA），使用5～12兆赫频率探头的线性阵列传感器对肱动脉的血流介导的血管舒张功能（FMD）进行测量。受试者仰卧位休息15分钟后，对其肘窝附近20～100mm的肱动脉进行测量。用血压计对受试者前臂上端施加250mmHg的压力，持续5分钟，对血压计进行放气，之后在反应性充血55到65秒后通过对平均舒张期管径增加百分比对FMD进行测定。15分钟后，给予受试者450μg硝酸甘油舌下含服，5分钟后再对硝酸甘油介导的血管舒张（GMD）管径进行测定。
1.8 主要观察指标
观察两组循环EPCs的数量，检测EPCs的迁移和增殖能力，检测FMD及GMD。
1.9 统计学分析
采用SPSS 11.0统计学软件进行数据分析，图表结果以均数±标准差表示；组间差异采用方差分析及两两比较,FMD和EPCs数量或功能增加水平之间关系采用单因素直线相关分析，P＜0.05为差异有显著性意义。
2.结果
2.1 两组FMD与GMD比较
使用超声技术检测血管扩张功能显示，非糖尿病血压正常的绝经前女性FMD较合并糖尿病的正常血压绝经前期女性明显要高（P＜0.05）。两组患者GMD没有明显差异（P＞0.05）。
2.2 两组循环EPCs数量比较
流式细胞仪测定显示循环EPCs水平显示，非糖尿病的正常血压绝经前女性明显高于合并糖尿病的绝经前期女性（P＜0.05）。同样的，荧光标记方法测定体外培养EPCs数量显示，合并有糖尿病的正常血压绝经前期女性的培养EPCs数量明显低于非糖尿病的血压正常绝经前女性受试者（P＜0.05）。
2.3 两组循环EPCs功能比较
实验结果显示，与非糖尿病血压正常的绝经前期女性相比，合并糖尿病的血压正常的绝经前期女性的EPCs的迁移和增殖功能则明显要低（P＜0.05）。
2.4 两组FMD与循环EPCs数量或功能的关系
通过流式细胞仪分析可以发现FMD分别与循环EPCs水平呈正相关（r=0.41，P＜0.05），同时，FMD也与培养的EPCs数量呈明显线性正相关（r=0.74，P＜0.05）。同样地，EPC迁移能力和增殖能力也分别与血浆FMD呈线性相关（r=0.64，P＜0.05； r=0.56，P＜0.05）。
3.讨论
EPCs是一类来源于骨髓并能分化增殖为成熟内皮细胞的一群干/祖细胞，在血管损伤时，EPCs从骨髓动员到外周血，迁移、黏附到损伤区域，增殖、分化为成熟内皮细胞，促进损伤血管再内皮化，维持内皮完整性，继而起到修复损伤血管的作用，其对预防心血管疾病的发生发展具有决定性的作用[2]。
我们前期研究表明，绝经前期女性体内雌激素及EPC介导的血管保护可能是改善内皮损伤的原因[2]。糖尿病是心血管事件发展过程中的风险因素，与心血管疾病的患病率及死亡率密切相关[4]，研究发现，糖尿病病人体内循环EPCs数量和功能均有不同程度下降的表现。然而，目前对糖尿病绝经前女性循环EPCs的数量和活性的影响并不清楚。因此，本研究是首次探讨合并糖尿病的绝经前期女性的血管内皮功能的改变。
内皮依赖性血流介导的血管舒张功能（FMD）是一项通过高分辨率超声技术实现的检测内皮功能受损的精确度高、可行性及可重复性高的检测指标，可以识别新的心血管危险因素及检测粥样硬化发展进程，本文的研究结果表明合并糖尿病的绝经前期女性比非糖尿病的绝经前女性的FMD降低，体内EPCs数量下降、迁移及增殖功能降低，同时，FMD分别与循环EPCs水平及迁移和增殖功能呈明显线性相关，说明了在糖尿病影响下，原本保持正常水平的绝经前女性的内皮功能将会下降，这可能与循环EPCs的数量下降和功能受损有关，而EPCs数量和功能下降的同时影响内皮修复能力，最终导致了内皮功能下降。
总之，对于合并糖尿病的绝经前女性，定期进行血管舒张功能检测以及改善内皮功能和血管修复能力的干预治疗均是十分重要的，而提高循环EPCs数量和改善其功能可能作为合并糖尿病的绝经前期女性预防及治疗血管内皮损伤的新靶点。
【参考文献】
[1]Blonde L,Pencek R,MacConell L.Association among weight change,glycemic control,and markers of cardiovascular risk with exenatide once weekly: a pooled analysis of patients with type 2 diabetes.Cardiovasc Diabetol.2015; 14: 12.
[2]蒋艳萍，曾高峰，任姿，曾海涛，杨震.高血压前期循环内皮祖细胞数量和功能的性别差异[J].中国组织工程，2015，19（1）：3061-3066.
[3]Denton KM,Hilliard LM,Tare M.Sex-related differences in hypertension: seek and ye shall find. Hypertension. 2013; 62: 674-7.
[4]Fox CS.Cardiovascular disease risk factors,type 2 diabetes mellitus,and the Framingham Heart Study.Trends Cardiovasc Med. 2010; 20: 90-5.
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31270992,30800215），广东省自然科学基金(2014A030313086)，广东省科技计划项目项目（2013B021800275,2015A020212013），广州市科技计划珠江新星项目（2013J2200019），高校基本科研业务费中山大学青年教师培育项目(13ykpy20)
作者简介：杨震，男，1978年5月生，湖南省衡阳市人，博士，副主任医师，硕士生导师，从事心血管内科专业.
通讯作者：陶 军，教授，博士生导师，从事心血管内科专业.
论文作者:杨震1,姚顺1,曾海涛2,苏晨1,陶军1（通讯作者
论文发表刊物:《心理医生》2016年5期
论文发表时间:2016/8/3
标签：内皮论文; 糖尿病论文; 女性论文; 功能论文; 细胞论文; 血管论文; 数量论文; 《心理医生》2016年5期论文;