范雪莉[1]1996年在《HIV-1感染的PCR定量方法研究及HIV核心蛋白基因的结构分析和克隆》文中研究表明艾滋病的致病机理仍有许多问题尚待进一步研究，基因组的高度变异，耐药毒株的出现，给该病的治疗带来极大困难。截止目前为止，所有治疗手段的效果均不能令人满意。为客观地评价药物的治疗反应，探讨其致病机理，本研究应用分子克隆和PCR技术等现代分子生物学手段，以gag基因为靶序列，对艾滋病的致病因子-人类免疫缺陷病毒(HIV)进行了定量方法学和分子流行病学的研究。 首先采用重组PCR技术合成用于定量PCR反应的HIV-1 gag基因的内参照标准片段，使其内部形成缺失50bp的突变，然后将其与阳性对照片段纯化后克隆入质粒载体PCR Ⅱ中，获得高质量的竞争模板，将一定量的阳性对照与浓度梯度稀释的竞争模板在同一反应体系中进行PCR扩增，建立稳定的定量竞争PCR(QC-PCR)方法。采集8例艾滋病患者(或HIV感染者)外周血单个核细胞(PBMC)标本、用尿素-SDS裂解细胞后，经酚：氯仿抽提，提取细胞总DNA，用QC-PCR方法对这些DNA标本进行验证，结果证实该方法非常适合于典型的临床标本，本研究用QC-PCR方法可检测到10个拷贝的前病毒DNA。同时我们还采用差别PCR(D-PCR)方法对该8例标本进行检测，用单拷贝顺序基因β-珠蛋白(β-Globin)与HIV-1 gag基因共同扩增，结果表明这种D-PCR方法较为简便，与QC-PCR具有较好的一致性。 为快速简便地检测HIV-1感染者，本研究对滤纸干血斑标本(DBS)进行了PCR检测方法的探讨，对DBS进行两步法处理标本及二次PCR扩增，得到非常强的阳性信号，提示用这种方法采集标本是可行的。通过对主要来自云南地区的26份经ELISA和WB证实的双阳性血清标本进行cDNA扩增后，经单链构象多态性分析和异源双链分析，我们筛选出当地流行的HIV-1主要单链构象多态性类型，将该毒株的gag基因片段用PCR法克隆入载体pUC19中，获得含HIV-1 gag基因片段的重组质粒，并对重组质粒的鉴定进行了方法学上的探讨，为以后序列测定打下良好基础。
王一新[2]2016年在《两株携带v-fps和v-src肿瘤基因的复制缺陷型急性致瘤病毒的鉴定及其感染性克隆的致肿瘤作用》文中认为近几年来,我国鸡群中J亚群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)诱发的髓样细胞瘤/血管瘤广泛流行的同时,在一些蛋鸡鸡群及“817”肉杂鸡鸡群中,出现了一定比例的体表纤维肉瘤。人工造病试验表明,接种了肉瘤研磨液的鸡在10-14d可发生相同类型的肉瘤,证明这些肉瘤为急性肿瘤(王鑫等,2012;刘绍琼等,2012;李传龙等,2012;李德庆等,2013)。本实验室前期工作中,以“817”肉杂鸡肉瘤组织DNA为模板,扩增到五种携带不完整v-fps肿瘤基因的缺陷型病毒基因组(Chen et al.,2012)。在此基础上,本研究将“817”肉杂鸡颈部皮下肉瘤和海兰褐蛋鸡肠系膜纤维肉瘤的研磨液接种鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF),鉴定了两株急性致瘤性ALV所携带的v-fps和v-src肿瘤基因;构建了辅助ALV和分别带有v-fps和v-src肿瘤基因的缺陷型病毒感染性克隆质粒,通过动物实验分析拯救病毒的致瘤性;将“817”肉杂鸡肉瘤研磨液接种SPF鸡,研究了该病毒的致病性和致瘤性;通过鸡急性肿瘤的动物模型,研究了核苷类抗HIV药物拉米夫定对ALV-J复制的抑制作用。本研究利用反向遗传学技术首次证明了携带完整v-fps肿瘤基因的缺陷性ALV可在ALV-J辅助病毒存在的条件下在鸡体内复制并诱发急性纤维肉瘤。同时,该研究也是急性纤维肉瘤天然病例中,携带v-src肿瘤基因的ALV-J相关复制缺陷型病毒的首次分离报道。1.“817”肉杂鸡急性肉瘤中急性致瘤性病毒的分离及其v-fps肿瘤基因的鉴定将“817”肉杂鸡肉瘤研磨液接种1日龄SPF鸡,在鸡体上传代。以第五代肿瘤组织DNA和感染了肿瘤研磨液的CEF DNA为模板,通过PCR扩增,拼接获得了缺陷型病毒Fu-J株的前病毒基因组序列。序列分析表明,Fu-J是一株携带完整v-fps肿瘤基因的复制缺陷型病毒,它以复制型ALV-J SDAU1005为辅助病毒完成自我复制,故将该病毒悬液命名为Fu-J(SDAU1005)。Fu-J编码137 kDa的P137gag-fps融合蛋白。使用大肠杆菌表达系统获得Fps原核蛋白和p19gag原核蛋白,以其制备鼠抗Fps单因子血清和鼠抗p19gag单因子血清。对感染了Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF做IFA和Western blot检测,结果表明,感染了Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF可以同时对ALV-J单克隆抗体、鸡抗ALV-J单因子血清和鼠抗Fps单因子血清呈现阳性反应。本研究完成了Fu-J株病毒的全基因组序列测定,为研究该病毒致瘤的分子机制奠定了基础。2.rfu-js感染性克隆的构建、病毒拯救和拯救病毒的致瘤性分析通过pcr扩增、酶切连接等方法,构建了辅助alv感染性克隆质粒pmd-sdau1005和六种携带不同长度v-fps肿瘤基因的缺陷型病毒感染性克隆质粒pmd-fu-j,pmd-fu-j1,pmd-fu-j2,pmd-fu-j3,pmd-fu-j4和pmd-fu-j5。将pmd-sdau1005和六种pmd-fu-js质粒分别按一定比例共转染cef,获得拯救病毒rfu-j(rsdau1005)、rfu-j1(rsdau1005)、rfu-j2(rsdau1005)、rfu-j3(rsdau1005)、rfu-j4(rsdau1005)和rfu-j5(rsdau1005)。将6种拯救病毒分别翅下接种1日龄spf鸡,发现仅接种rfu-j(rsdau1005)的鸡出现了肿瘤(2/10)。将2只鸡的肿瘤在1日龄spf鸡上持续传代。在传代过程中,肿瘤的生长速度逐渐加快。当传至第4代时,肿瘤生长速度与野毒诱发肿瘤生长速度基本一致。ifa和免疫组织化学方法证实该肿瘤组织对alv-j及fps抗体呈阳性反应。该研究表明,携带完整v-fps肿瘤基因的缺陷型alv确实可诱发急性肿瘤。3.海兰褐蛋鸡腹腔急性肉瘤中急性致瘤性病毒的分离及其v-src肿瘤基因的鉴定以海兰褐蛋鸡原代肿瘤组织dna和感染了肿瘤研磨液的cefdna为模板,pcr扩增获得了复制缺陷型病毒sj-1、sj-2、sj-3、sj-4、sj-5及辅助病毒sdau1102的前病毒全基因组序列。该毒株被命名为sj-1(sdau1102)、sj-2(sdau1102)、sj-3(sdau1102)、sj-4(sdau1102)和sj-5(sdau1102)。序列分析表明,辅助病毒sdau1102为j亚群alv,其gp85基因与中国蛋鸡分离株js09gy6同源性最高。sj-1~5均携带v-src肿瘤基因,它们具有相同的3’端src-env衔接位点,但5’端衔接位点差异很大。使用大肠杆菌表达系统获得p60v-src原核蛋白,以其制备鼠抗p60v-src单因子血清。以该血清为一抗,westernblot和免疫组化实验显示,感染了病毒悬液的cef及肿瘤组织中,均存在p60v-src蛋白过表达。构建了五种缺陷型病毒的感染性克隆质粒。将其转染cef,发现仅sj-1和sj-2感染性克隆质粒可表达p60v-src蛋白。sj-1~5(sdau1005)的分离及鉴定为为进一步研究alv与原癌基因重组和v-src基因致瘤机制奠定了基础。4.fu-j(sdau1005)病毒悬液对spf鸡的致病性和致瘤性研究本研究首先建立了分别针对alv-jgp85基因和v-fps基因的sybrgreeni实时荧光定量pcr方法,两个方法特异性好、灵敏度高,为研究fu-j(sdau1005)的复制动态及其致病性提供了可靠的检测方法。分别采用颈部皮下、腹腔和静脉注射三种方式,将fu-j(sdau1005)病毒悬液接种1日龄spf鸡,观察病毒的致病性和致瘤性。结果表明,三种接种方式均可诱发鸡的急性肿瘤,且所有肿瘤均为纤维肉瘤;颈部皮下接种组的鸡体内没有肿瘤生长,表明该急性肿瘤的转移性不强;所有接触传播组的鸡均未发现肿瘤生长,表明该急性致瘤性ALV不容易通过横向接触方式传播。从上述结果,可以推测疫苗免疫时重复使用污染的针头,可能是某些鸡场内病毒从一只患病鸡传给其他个体并发生急性肿瘤的原因。病毒的抗原定位实验表明:在发病鸡体内肿瘤组织中辅助病毒和缺陷型病毒拷贝数最高;缺陷型病毒的拷贝数与辅助病毒拷贝数存在相关关系。5.感染了Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF转录组研究为探讨Fu-J株病毒诱发细胞转化的机制,本研究采用基因芯片技术对感染了Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF转录组进行了分析。与单独感染SDAU1005的CEF相比,感染Fu-J(SDAU1005)病毒悬液的CEF中有1253个转录子发生了4倍及以上的差异表达。这些差异基因主要涉及细胞过程、代谢加工、生物学调节、定位和发育过程等反应。细胞信号通路分析法发现,这些差异基因主要参与了神经活性因子-受体相互作用、紧密连接、代谢信号通路、GnRH信号通路、VEGF信号通路、Wnt信号通路等。本研究获得的差异转录组数据为深入研究v-fps肿瘤基因的急性致瘤机制奠定了基础。6.拉米夫定抑制ALV-J复制和肿瘤生长的研究为研究核苷类抗HIV药物拉米夫定对ALV-J复制的抑制作用,首先将Fu-J(SDAU1005)病毒悬液接种体外培养的CEF,研究其对ALV-J复制的影响。结果表明,在1-4μg/ml的浓度范围内,拉米夫定可有效抑制辅助ALV和缺陷型病毒的复制。荧光定量PCR结果表明,拉米夫定可以抑制ALV反转录酶的活性。通过鸡颈部皮下肿瘤和腹腔肿瘤两种动物模型,研究了拉米夫定在鸡体内对ALV-J复制的抑制作用。结果表明,拉米夫定可以抑制辅助ALV和缺陷型病毒在鸡体内的复制、降低病毒载量,从而减缓鸡颈部皮下肿瘤的生长,延长腹腔攻毒鸡的生存时间并降低其死亡率。本研究为ALV的防控提供了新思路,但拉米夫定能否在鸡群中推广使用尚需进一步研究和论证。
孙薏[3]2006年在《HIV-1病毒Tat蛋白影响细胞辐射敏感性及作用机制研究》文中指出HIV感染导致人类免疫缺陷综合症(AIDS)有可能引起更多肿瘤的发生，研究表明卡波氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma，KS)和非何杰金淋巴瘤的发病率在艾滋病人要比普通人群高出20倍。腺癌、何杰金氏淋巴瘤和平滑肌肉瘤在儿童发病的风险较普通人群高出5—20倍。对于HIV感染的肿瘤病人，手术治疗有高风险性，放射治疗是主要的治疗方式。近年来临床研究发现，艾滋病合并肿瘤患者放疗后产生的正常组织和皮肤毒性反应明显高于普通肿瘤患者。实验室研究也进一步支持临床观察，AIDS合并非何杰金淋巴瘤的病人对辐射反应敏感，来源于HIV感染的卡波氏肉瘤病人皮肤活组织的成纤维细胞，对辐射较非HIV感染的细胞敏感。人类免疫缺陷病病毒(HIV)表达的Tat蛋白是HIV感染早期所合成的小分子调节蛋白，能促进HIV基因表达，增加HIV病毒的复制和感染性。此外，在HIV感染过程中，Tat蛋白能分泌到细胞外，作用于未受HIV感染的CD4+细胞和单核-巨噬细胞，使其更易受HIV的感染。因此Tat作为一个胞外蛋白和细胞基因表达的激活因子在AIDS发生及相关病变过程中起重要作用。目前研究显示，Tat蛋白与机体交互作用会影响细胞辐射敏感性，但对于AIDS合并肿瘤的病人辐射敏感性发生改变的机制仍不清楚。 本研究使用转染HIV-1 tat基因的人横纹肌肉瘤细胞系模型，探讨Tat蛋白对细胞辐射敏感性的影响以及相关机制，获得如下主要结果： (1) 使用重叠PCR技术，从我国河南省驻马店地区的一名HIV-1感染者外周血标本中扩增出完整的tat基因序列。将该基因编码产物与其它HIV-1病毒株Tat蛋白进行多序列对比分析发现：第一外显子编码产物的三个保守区域的氨基酸组成大致是相同的，只有少数氨基酸存在差异，tat基因的克隆为研究其功能并以其为靶点设计和筛选抗艾滋病的药物奠定基础。 (2) 成功构建了表达Tat蛋白的稳定细胞模型，使用报告质粒KB／SP1LTR检测发现，90％以上的TE671-tat细胞具有Tat蛋白的转录激活功能，为进一步研究Tat蛋白的功能奠定了基础。 (3) 利用两个表达Tat蛋白的细胞系TT2和TE671-Tat进行对比研究发现：Tat蛋白能促进细胞增殖，表达Tat蛋白的细胞其增殖速度加快；细胞活存分析证明，表
孟祥平[4]2009年在《重组人TRIM5α基因嵌合体的构建、表达纯化及其体外抑制HIV-1的研究》文中研究指明艾滋病是由人类免疫缺陷病毒感染所导致的以全身免疫系统的严重损害为特征的,以患者易于发生机会性感染以及肿瘤为特征的临床综合征。全球约95%以上的艾滋病感染是由HIV-1造成的。自1981年美国报道首例艾滋病患者以来,全球已有超过2500万人死于艾滋病。近年来,科学家希望从细胞内天然的抗HIV分子的方向上为解决艾滋病的问题提供重要的途径。已有的研究表明,HIV-1病毒可以感染包括人类在内的许多哺乳类细胞,但却不能感染某些猴。2004年,Sodroski研究小组对这一事实进行研究,在灵长类细胞中发现了一种可以抗HIV-1的蛋白质,研究证明属于三结构域蛋白(tripartite motif,TRIM)家族的一个成员,定义为TRIM5α。新近发现猿猴细胞中的TRIM5α具有抗HIV-1的作用。从而使TRIM5α的研究引起广泛关注。但到目前为止,人们对于TRIM5α限制HIV-1复制的作用机制尚不完全清楚,许多问题还没有解决,大多停留在推测的水平。比如,TRIM5α的不同类型对不同物种病毒感染的抑制偏向原因是什么?它是否直接与HIV-1的核衣壳蛋白结合?TRIM5α还可能与其他什么蛋白结合?虽然人的TRIM5α也具有同样功能,但不如恒河猴的有效。然而,当有个别氨基酸改变时,人源的TRIM5α将具有和恒河猴TRIM5α相似水平的抗HIV-1功能。早期的临床试验证明异种蛋白应用于人体后,可引起机体免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应,重复使用时甚至可导致病人严重的过敏性休克。此外,由于人抗异种动物的免疫应答反应的存在,异种蛋白在人体内往往被快速清除,其半衰期也较短。因此本实验室选择人源的TRIM5α(改构体)进行研究。以往关于TRIM5α的绝大多数研究,主要围绕在基因水平上进行的,例如,通过脂质体、病毒载体等结构将TRIM5α基因转运进入细胞使之大量表达,从而改变细胞的表型。但在实际操作过程中,往往存在这样那样的问题,如可操作性差,转运效率低,稳定性不好,生物毒性作用,而且并非所有细胞均能被转染等,这些均限制了其实际应用。使得目前关于TRIM5α的研究只能局限在细胞的水平上,严重阻碍了这一重要基因向临床治疗中的发展。如果能够体外得到大量的有生物学活性的TRIM5α蛋白,而且该蛋白又能穿过细胞膜,在细胞内发挥其本来的生物学活性,那么TRIM5α的应用范围将大大拓展。近年来,人们发现了一种蛋白质功能域,它们能够引领其所承载的生物大分子通过浆膜,并在细胞内积累,所以把它们称为蛋白质转导域(protein transductiondomain,PTD)。被PTD带入细胞的分子都还具有它们本来的活性。PTD的出现,使大分子蛋白质或多肽自由通透细胞膜成为了可能,疾病的一个新治疗平台——蛋白质治疗技术也成为了现实,加速了蛋白质工程技术的发展和临床上蛋白类药物的开发和利用。目前,已有数十种蛋白质被成功转导进入不同的细胞中,并被表现其相应的生物活性,还有部分蛋白被转导进入动物体内。随着其作用机理的阐明和这一技术的日益成熟,将被越来越广泛地应用到疾病治疗方法的研究以及未知蛋白功能的研究中。但体外获得的重组蛋白PTD-TRIM5α能否顺利穿过细胞膜进入到细胞内,外源性TRIM5α蛋白是否具有抑制HIV-1的作用?这些问题都值得我们去研究。并且目前国内外还未见报道。Matthew Stremlau等的研究表明,突变的TRIM5αH(R328-332)[即I→M(328)、G→Q(330)、R→P(332)]基因用逆转录病毒载体转染细胞后,具有较好的抑制HIV-1的作用。考虑到逆转录病毒载体的生物毒性作用(如致白血病等肿瘤),操作复杂,难于调控等诸多不足。本实验室构建了该改构体(嵌合体)PTD融合的原核表达载体,并对该蛋白的表达、纯化和功能进行了初步的研究。目的:克隆人TRIM5α基因并对其编码序列进行分析。构建TRIM5α改构体TRIM5αH(R328-332)的原核表达载体pET28α。并通过表达获得重组的TRIM5α及TRIM5αH(R328-332)蛋白。并探讨重组蛋白体外抑制HIV-1的作用。方法:利用RT-PCR方法克隆人TRIM5α基因;通过与基因组序列对比分析基因组结构;用BioEdit,Genedoc和MEGA 4.1进行蛋白序列联配和进化分析。构建PTD-TRIM5α及其嵌合体PTD-TRIM5αH(R328-332)的原核表达载体(pET-28a)。转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达获得重组融合蛋白。重组蛋白再经过纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot分析重组蛋白。用免疫共沉淀和ELISA等方法探讨重组蛋白结合HIV-1Gag的能力,利用荧光显微镜证实PTD-TRlM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)具有高效的穿膜能力,从而为进一步研究重组蛋白细胞内功能奠定了基础。将HIV-1_(ⅢB)和Molt 4靶细胞混合培养,然后与不同浓度的药物作用后,用合胞体形成抑制实验检测药物对HIV-1_(ⅢB)的直接灭活作用;用HIV-1p24抗原检测试剂盒检测药物作用后细胞培养上清的p24抗原水平变化,以测定其体外抑制HIV-1的作用。结果:扩增了一个长1482bp的基因片断,序列分析表明其覆盖了完整编码框,编码由493个氨基酸组成的人TRIM5α基因。人TRIM5a蛋白和黑猩猩、大猩猩、猩猩、猕猴(恒河猴)TRIM5α蛋白的相似度分别为98.2%、96.8%、93.7%和87.6%。采用PCR和测序方法证实目的基因已正确地插入pET28a载体。用Western blot证实含有目的基因的重组PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)成功实现了表达,采用镍柱亲和层析得到了纯度约90%的目的蛋白。PTD-TRIM5α和PTD-TRIM5αH(R328-332)经稀释和透析等处理后实现了复性。体外实验证实PTD—TRIM5α及PTD—TRIM5αH(R328-332)蛋白具有和HIV-1Gag结合的能力,利用荧光显微镜证实PTD-TRIM5αH(R328-332)具有高效的穿膜能力。测定二种蛋白能够抑制HIV-1_(ⅢB)介导的细胞融合的EC50分别为81.47μg/mL、7.55μg/mL;抑制p24抗原产生的EC50分别为62.04μg/mL、4.74μg/mL。结论:成功克隆人TRIM5α基因,成功构建了PTD-TRIM5α/pET28a及PTD-TRIM5αH(R328-332)/pET28a的大肠杆菌表达系统,并且表达、分离纯化出具有生物活性的PTD-TRIM5α及PTD-TRIM5αH(R328-332)蛋白。PTD—TRIM5α及PTD—TRIM5αH(R328-332)蛋白具有高效的穿膜能力,从而为进一步研究重组蛋白细胞内功能奠定了基础。PTD-TRIM5αH(R328-332)具有更好的抑制HIV-1的活性,PTD-TRIM5αH(R328-332)抑制HIV-1_(ⅢB)的效率比PTD-TRIM5α高10倍以上。PTD—TRIM5α及PTD—TRIM5αH(R328-332)蛋白和HIV-1Gag结合的能力和其抑制HIV-1的活性相关。
黄杰[5]2007年在《HIV-1 RNA双重实时荧光RT-PCR测定方法及其质控物和标准物质的系列研究》文中进行了进一步梳理目的建立新型的采用病毒样颗粒作为内质控的HIV-RNA双重实时荧光RT-PCR测定方法。制备无生物传染危险性且耐RNase的HIV-IRNA检测血清质控物和标准物质，用于临床实验室的室内质量控制和室间质量评价工作。方法一、HIV-RNA双重实时荧光RT-PCR测定方法1．从美国Los Alamos国家实验室网站和NCBI网站下载所有已知HIV—1序列，采用DNAMAN和BioEdit软件进行比对，获取HIV-1序列的保守区域序列。再利用软件Primer Express(美国应用生物系统公司)进行实时荧光PCR引物和探针设计，并初步建立实时荧光PCR检测体系。2．在上述的HIV-1 RNA实时荧光PCR检测体系中，加入上面设计的不同的探针和引物，检测本室构建表达的内含HIV-1 RNA的病毒样颗粒和HIV-1感染患者样本，筛选合适的引物和探针。初步确定了双引物双探针的检测体系。根据双引物双探针体系构建重组质粒表达内含HIV-1 RNA内标的病毒样颗粒，确定内标病毒样颗粒在反应体系中的最适浓度。通过不同添加剂的加入和不同酶混合物的调整优化RT-PCR反应体系。3．采用两条不同的荧光探针和两组引物进行国际标准血清盘和HIV-1感染者血清标本的HIV-1RNA检测，并利用上述构建表达的病毒样颗粒作为内标以进行假阴性质控，考察了所建立方法的检测灵敏度和特异性。比较了单探针和双探针检测方法在亚型检测能力、检测灵敏度和临床样本的检测适用性。二、MS2包膜蛋白的原核表达、纯化以及抗MS2蛋白多克隆抗体的制备及其与RNA的体外相互作用1．构建表达包膜蛋白的pET_(42)-COAT、pGEX-4t-1-COAT原核表达质粒和pcDNA3.1-COAT真核表达质粒。原核表达重组MS2包膜蛋白。将重组蛋白利用亲和柱进行纯化，纯化后的包膜蛋白进行尿素梯度透析。2．分别采用原核表达重组蛋白免疫1号和3号两只家兔、采用真核质粒DNA免疫2号和4号两只家兔，制备抗MS2蛋白的多克隆抗体。3．配制体外包装缓冲液，加入包膜蛋白与体外转录的RNA分子，加入适量RNA酶抑制剂。4℃过夜，电泳观察迁移率变动情况。三、无生物传染危险性HIV-1 RNA测定质控物和标准物质的制备和室间质量评价应用的研究1．无生物传染性的HIV-1 RNA测定质控物和标准物质大量原核表达，采用两次超速离心进行纯化，获得大量HIV-1病毒样颗粒。2．研究HIV-1 RNA测定质控物和标准物质在37℃、室温、4℃、-20℃以及-70℃至室温反复冻融5次的样本稳定性。同时研究质控物和标准物质的均匀性，并采用匹基公司HIV-1核酸检测试剂盒和COBAS AmpiCOt HIV-11.5 Monitor试剂与HIV-1 RNA国际标准物质进行比对定值。3．调查开展HIV-1 RNA检测的实验室，每个实验室发放20份样本同时附带相同的操作说明及结果报表，开展临床实验室室间质量评价。结果一、HIV-1双重实时荧光RT-PCR测定方法通过比对设计了对引物探针，经过筛选建立了双引物双探针体系。采用1000拷贝／ml的病毒样颗粒作为内部假阴性质控，建立的双特异探针检测HIV-1实时荧光RT-PCR方法的灵敏度为125IU／ml，和单探针方法比较不存在大的差别；在检测HIV-1阴性样本时具有100％的特异性。和单探针方法比较，双特异探针检测HIV-1实时荧光RT-PCR方法在HIV-1亚型检测中能检测到M族的所有亚型以及O族：双特异探针检测HIV-1实时荧光RT-PCR检测体系检测中国药品生物制品检定所提供的9株国内流行株B、C、CRF01-AE、CRF07-BC、CRF08-BC的分型血清时均能检出；在对60份临床样本的检测中，单探针方法只能检出39份，而双探针方法能检出50份(10份检测阴性的样本用COBAS检测证明为阴性)。二、MS2包膜蛋白的基因工程表达纯化、抗MS2蛋白多克隆抗体的制备及其与RNA的体外相互作用完成了MS2包膜蛋白的原核表达和纯化。通过质粒免疫和重组蛋白免疫的方法获得了抗MS2包膜蛋白的多克隆抗体，1和3两只家兔血清在稀释1280000倍后仍然可以与重组MS2包膜蛋白反应，而2和4两只家兔血清只能在8000倍左右稀释后呈现阳性反应。从RNA迁移率改变实验证明了包膜蛋白可以和包装位点具有特异性相互作用，但经过RNaseA的消化后RNA条带消失，说明了RNA和包膜蛋白的在体外发生了作用但未能形成完整的病毒样颗粒。三、无生物传染危险性HIV-1 RNA测定质控物和标准物质的制备和室间质量评价应用的研究无生物传染危险性的HIV-1 RNA测定质控物和标准物质在37℃、室温、-20℃以及2-8℃保存情况下其性能并无明显改变。在室温条件下能稳定3周；在37℃条件下能稳定10天；-20℃以及2-8℃保存情况下能稳定4周以上；反复冻融5次对无生物传染危险性的HIV-1核酸检测参考品没有明显影响；无生物传染危险性的HIV-1 RNA测定质控物和标准物质均匀性良好，适合临床使用和开展临床实验室室间质量评价，从而保证临床检测质量。病原体核酸检测的主要问题在于低浓度样本的检测。病原体核酸检测质量保证还需要进一步做好室内质控和参加室间质量评价来进行保证。结论建立的双引物双特异探针检测HIV-1实时荧光RT-PCR方法具有很高的检测灵敏度以及HIV-1亚型的检测能力。在对临床样本的检测中证明具有很好的临床适用性。因此，该方法具有良好的应用前景。无生物传染危险性的HIV-1 RNA测定质控物和标准物质稳定性和均匀性良好，适合临床HIV-1 RNA RT-PCR检测的质量保证，对临床实验室的HIV-1 RNA RT-PCR检测室间质量评价具有重要的应用价值。
冯福民[6]2003年在《我国艾滋病病毒B'、B/C亚型流行株的表型分析、全基因组克隆及gp41主要抗原表位研究》文中研究表明艾滋病病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)是导致人获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)的病原体。截止至2002年年底，全球存活的HIV感染者已经达到4200万人。我国HIV／AIDS流行呈快速上升趋势，估计HIV感染者已经达到100万人。HIV分为HIV-1和HIV-2型，HIV-1的M群至少包含11个亚型，其中B’和B／C重组亚型是我国的主要流行株。对我国的HIV流行株进行系统的表型分析、基因组研究和表位鉴定是研究我国HIV疫苗、诊断方法和致病机理的基础，我国至今对B’和B／C重组亚型毒株缺乏这样系统的研究。本文对我国HIV-1B’和B／C亚型毒株进行了表型分析、全基因组克隆及及序列测定。对B’亚型毒株gp41的主要抗原表位进行了研究。 1．我国艾滋病病毒B’、B／C亚型流行株的表型分析 HIV为单股正链RNA病毒，具有高度变异性，其突变频率比DNA病毒高100万倍。高突变性导致HIV复杂的表型特征，HIV-1表型决定感染宿主细胞时使用辅助受体的类型，分为M嗜性、T嗜性和双嗜性。HIV-1感染的早期多为M嗜性，晚期转变成T嗜性或双嗜性，而决定病毒细胞嗜性的区域位于HIV-1gp120，其中V3环起主要作用。我们从来自河南的一份有偿献血者血液中成功分离到一株HIV-1B’亚型毒株(CNHN24)，对病毒基因突变与细胞嗜性的关系进行了研究，主要结果如下： A．将HIV-1感染者的PBMC与健康人PBMC混合共培养，分离出HIV-1 CNHN24株，证明这是一株嗜巨噬细胞，呈快／高型复制的病毒，分析了V3环基因序列突变与细胞嗜性变化的关系； B．将感染HIV-1 CNHN24株的PBMC与MT4细胞共培养，使毒株由嗜巨噬细胞，使用CCR5辅助受体转变为嗜T细胞，使用CXCR4辅助受体； C．HIV-1 CNHN24株已经在人传代T淋巴细胞株MT4细胞中稳定传16代，TCID_(50)维持在10~8的高滴度；博士学位论文中文摘要D.序列分析表明，在细胞嗜性改变的同时，H工v一1 CNHN24株的V3环序列发生 了明显的变化，核普酸序列的突变率达到17%;E.经PBMC和MT4细胞培养后，培养上清中的病毒基因与细胞基因组中前病毒 DNA的V3环序列完全一致;F.分析了病毒由M嗜性转变为T嗜性的V3环氨基酸突变特征，突变率为9%。 突变位点位于V3环的第4、11、13、14、24、27、32位，其中第11、14、 27和32位氨基酸电荷变化明显。2.我国艾滋病病毒B’、B/C亚型流行株全基因组克隆 我国H工V流行株全基因组序列的报道较少，尚未见在国内实验室完成Hlv全基因组克隆的报道。我们利用RACE法确定了病毒mRNA的3’端和5’端序列，设计了两条特异性引物，以CNHN24病毒感染细胞的前病毒基因组为PCR扩增的模板，主要完成了以下工作:A.建立了扩增H工v一1全基因组技术平台;B.首次在国内实验室构建了H工V一IB’亚型CNHN24株的全基因组克隆;C.全基因组克隆测序提交GenBank，登录号为:AY180905;D.通过V3环序列分析确定CNHN24克隆为H工V一IB’亚型，氨基酸序列比对发 现在九个位点发生氨基酸替换;E.Gag、Pol、Vpr和Vsf基因与RL42株的一致率达到95.42%~97.08%，但gpzZo 的氨基酸一致率只有64.6%;F，进化分析显示CNHN24株与国内RL42株的遗传距离最近。 扩增低拷贝基因的长片段链是长链PCR技术面临的一个难点，融合PCR方法是解决这一困难的重要手段之一。根据我国HIV一IB/C亚型序列的保守区设计引物，首先将02CNHN01株病毒全长基因分成6段相互部分重叠的片段进行PCR扩增，然后再以融合PCR方法依次将相邻两个片段融合在一起。主要结果如下:A.建立了H脚一IB/C亚型全长基因组DNA分子的融合PCR方法;B.利用融合PCR方法成功克隆了H工V一IB/C亚型(OZCNHN01株)全基因组;C.CZ一V3区序列与H工V一IC亚型国际参考株一致率为97.14%，与国内HIV一1 B/C亚型株的一致率为95.41%~96.33%;D．系统发育分析显示，该毒株的序列与国内 HIVl 北亚型98CN009株聚在一 起，而98CN009株序列则与93IN101株聚在一起。E．序列分析发现部分位点有HIV－IB亚型重组，确定 02CNHN01株为mV－IB／C 重组型。3．我国艾滋病病毒B’亚型流行株PP41主要抗原表位研究 噬菌体展示技术已被证明为研究蛋白质与其配体相互关系很有效的工具。本实验中，我们通过人抗HIV－IB’亚型PP41多克隆抗体，筛选噬菌体展示随机12肽库，将得到的表位及两个表位的串联体与噬菌体厂＊蛋白的I～11结构域在PoE30载体中表达，用纯化的表达蛋白检测HIV感染者血清中的特异性抗体，证实了表位抗原和串联表位抗原用于＊ 抗体检测的可行性。主要结果如下：A．制备了N工＊1＊＊1表达抗原亲和层析柱：B．从我国HIV＋’亚型感染者血清中纯化了抗PP41多克隆抗体；C．从噬菌体展示随机12肽库中筛选到位于gP41免疫优势区588～597aa的3 个表位 ph32PI、ph33PI和 Dh39PI；D．将Ph39PI与文献报道的一个HIV－lgP41表位串联连接；E．将 4个表位分别插入到噬菌体厂 11蛋白的 I～11结构域中，在 PQE30载体 中实现表达；F．纯化的表达蛋白可用于检测HIV－1感染者血清中的抗体
赵海全[7]2006年在《HSV-2感染ECV304细胞的生物学效应研究》文中指出单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)是世界范围内人类生殖器疱疹(Genital herpes，G H)的病毒病原。流行病学调查研究显示，过去20年中，世界大多数国家HSV的血清患病率显著增加。该病易反复发作，给患者造成巨大的身心痛苦。同时GH还消耗大量公共卫生资源，给个人和社会带来沉重经济负担。孕妇GH尚会影响优生优育，可引起胎儿、新生儿的严重感染，导致严重不良后果。在HIV／AIDS流行地区，GH还增加了感染HIV的危险性。目前尚无安全有效的疫苗和药物能预防、治愈HSV感染。HSV感染引发的疾病包括原发和继发的粘膜感染(如龈口炎、唇疱炎和生殖器疱疹)、角膜炎、新生儿HSV感染、内脏HSV感染、HSV脑炎、水痘样出疹和多形红斑，并与宫颈癌和动脉粥样硬化(AS)的发生有关。 动脉粥样硬化(AS)严重威胁人类健康，虽然大量的流行病学资料显示传统的危险因子是动脉粥样硬化的主要危险因素，但动脉粥样硬化仍然有许多潜在的病因亟待探索。研究表明，病原微生物感染可能参与了动脉粥样硬化的发生发展，感染后的炎症反应在动脉粥样硬化的发生过程中发挥重要作用。有关病毒感染与AS的关系逐渐受到人们重视，血清流行病学和分子生物学的研究资料表明，HSV及其DNA序列存在于AS的病灶组织，主要见于血管平滑肌细胞(SMC)和内皮细胞(EC)，且AS患者血清HSV的抗体阳性率明显增高，提示HSV的感染在AS的形成和发生发展过程中可能起重要作用。迄今为止，对于HSV如何参与AS的发病机制尚缺乏深入的了解，病毒对体外靶细胞的作用可以反映病毒对体内细胞的直接作用，研究体外情况下HSV感染血管内皮细胞的生物学效应，对阐明HSV的致病机制具有非常重要的意义。目前研究发现，HSV可通过内皮毒性作用、损害内皮依赖的舒张功能及影响内皮粘附功能等方式造成内皮结构和功能损伤，但其潜在的基因水平的机制尚不清楚。传统的RNA方法学如Northern斑点杂交分析一次只能研究一种基因，成本高，效率低，
姚新生[8]2006年在《监测人TCRαβT细胞CDR3谱系漂移、TCR基因重排方法的建立和初步应用》文中研究表明背景：近年来，病毒感染、肿瘤、自身免疫病、移植等病理状态下T细胞的应答与耐受取得较大发展，对这些疾病状态下特异T细胞产生机制、监测方法、在个性化治疗中的应用、相应抗原表位疫苗的开发研究有着重大理论和潜在临床应用价值。目前，“ELISpot技术”、“FCM检测细胞内细胞因子”、“四聚体技术”等可检测密切相关(已知抗原)特异T细胞的功能和频数，但是不能提供特异T细胞的分子特征和整个样本中T细胞的组成信息。因每个T细胞有着自己独特的TCR CDR3分子，不同T细胞克隆具有不同序列的CDR3基因组成(不同长度)，从而形成多样性的CDR3基因谱型，CDR3区的序列决定其结构，从而决定TCR的特异性，或者说，CDR3相当于T细胞的“指纹”，监测CDR3序列的多态性和长度分布以及不同病理状态下的频率变化(谱系漂移)，可以反映特定T细胞克隆扩增的程度，从而反映T细胞功能状态。经典的克隆选择理论认为这些特异T细胞来源于T细胞受体库中已有的T细胞“优势增生”，但随着外周B细胞BCR“二次重排”的研究进展，已证实外周T细胞同样存在TCR的“二次重排(编辑／修正)，即T细胞能以一种部分或全新的V(D)J重排的新受体取代原有的受体，从而能清除自身反应性细胞，或者是改变针对自身抗原的反应性，亦或更好的作用于微生物。对不同病理状态下特异T细胞TCR分子特征的鉴定和动态变化监测，探讨其和TCR“二次重排”的相关性，建立相应的研究技术和模型受到广泛的关注。 目的 (1)建立监测人TCR αβ T细胞CDR3谱系漂移的免疫扫描谱型分析技术(immunoscope spectratyping technique)，分析正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中TCR αβ T细胞CDR3谱系的多态性和长度分布；监测活动性慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)、急性T淋巴细胞白血病(T-lineage acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)、外周造血干细胞(peripheral blood stem cells，PBSC)移植前后患者PBMC中TCR αβ T细胞CDR3谱系漂移情况，并鉴定T细胞株Jurkat的TCR分子特征。为感染、肿瘤、移植等疾病的细胞免疫应答机制、诊断、治疗研究提供新的思路与方法；为TCR二次重排(second rearrangement)研究提供监测TCR动态变化的技术； (2)建立监测人TCR αβ T细胞TCR基因重排的连接介导PCR方法(Ligation-
李臻[9]2007年在《HIV多表位核酸疫苗免疫实验及鸡痘病毒转移载体的构建研究》文中研究说明本研究利用已经设计并人工合成的多表位基因,以HIV-1巨分子颗粒p24为支架,连入安全的真核表达载体质粒pVAX1,构建了新型HIV多表位重组DNA疫苗(pVAX1-MEGN-p24),细胞转染结果表明,pVAX1-MEGN-p24成功地表达了MEGNp24抗原蛋白。将该重组质粒免疫小鼠,实验结果显示,该重组质粒能够诱导免疫小鼠产生针对HIV细胞免疫和体液免疫,并且以细胞免疫为主。佐剂重组核酸疫苗组具有稳定的特异性CTL反应作用。本研究还构建了新型鸡痘病毒转移载体,并利用该载体获得了一株含HIV多表位基因的重组鸡痘病毒株,运用RT-PCR和IFA方法检测了外源基因重组及鸡痘病毒在鸡胚成纤维细胞中的表达状况。实验结果显示,外源基因已正确重组入鸡痘病毒基因组,且可在鸡胚成纤维细胞中进行有效表达。
种辉辉[10]2008年在《人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）假病毒检测体系的建立与应用》文中进行了进一步梳理HIV-1具有基因多变性以及ENV结构的复杂性,不同HIV疫苗所诱导的中和抗体的中和特性往往不同,因此,建立一个统一有效的中和抗体检测方法是非常必要的。本课题成功获得31株可以与骨架质粒pSG3△ENV共转染293T细胞形成功能性假病毒的pcDNA3.1-ENV阳性克隆。我们对这31株克隆进行基因分型,其中有19株BC亚型、8株B亚型、4株AE亚型,除了4株假病毒的ENV基因来源于已有质粒外,其他27株中ENV基因均来源于中国HIV-1感染者的阳性血清样本。分析克隆中gp160核苷酸序列可以看出克隆之间存在遗传多样性,31株假病毒的可变区V1、V2、V4和V5中氨基酸数目都有明显差异,但V3区的氨基酸数目没有差异,这可能与假病毒进入细胞的机制有关。不同克隆中N-糖基化位点(PNLG)是有差异的,PNLG的位点数较少,暴露中和位点较多从而表现出较为敏感的中和反应。假病毒可以感染TZM-bl细胞,诱导细胞内的荧光素酶的表达,根据检测发光值的变化来判定中和活性的强弱。用四种已知的具有中和活性的单克隆抗体(4E10、2F5、2G12和IgG1b12)来分析假病毒的中和活性,结果显示假病毒株中单克隆抗体识别中和表位的氨基酸变化会影响其中和活性。当缺少N-糖基化位点295或392时,假病毒株都表现为对2G12不敏感,因此认为N-糖基化位点295或392是2G12中和活性所必需的识别位点。2F5识别位点包含氨基酸序列ELDKWA,从实验结果可以看出赖氨酸(K)是2F5识别位点所必需的。4E10识别位点紧邻2F5识别位点,包含氨基酸序列NWFDIT,序列中N被S取代,D被S/N取代,T被S取代均不影响假病毒对4E10的敏感性。用假病毒检测体系检测43份血清样本,结果显示19株BC亚型的假病毒与BC亚型血清样本有明显的、广泛的中和活性,而与B、AE亚型血清样本反应时仅个别反应表现出中和活性,但抑制率都偏低。同样8株B亚型假病毒与同亚型血清样本反应表现出较高的中和活性,4株AE亚型假病毒与同亚型血清样本反应表现出相对较高的中和活性,各亚型间没有明显的交叉活性。从检测血清样本的结果可以看出,假病毒检测体系应用于血清样本的检测是可行的,而且假病毒检测体系容易标准化,其结果重复性较好。假病毒检测体系成功的应用于药物AZT、3TC、d4T和ddI检测,检测药物的实验结果与已报道的结果相一致,可以看出假病毒检测体系可应用于抗HIV药物检测。假病毒检测体系既可以定性得到半数有效浓度EC50又可以定量得到半数有效剂量ED50,并且相对于活病毒法具有重复性好、灵敏、精确、易操作的优点。因此,假病毒法在检测抗HIV-1药物的研究中具有很好的发展前景。
参考文献：
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