饶贤才[1]2002年在《人肽抗生素hPAB-β的基因克隆、表达及活性研究》文中研究说明传统的抗生素是由霉菌或放线菌产生的，霉菌或放线菌是人类寻找抗生素的传统领域。肽抗生素(peptide antibiotics)或称为抗微生物肽(antimicrobial peptide)则是近年来发现的由动物、植物、昆虫等生物体基因编码的具有抗生素样活性的肽类物质。它是机体免疫系统的重要组成部分，因其在作为抗感染制剂、食品防腐剂等方面具有广阔的应用前景而成为近年来国内外研究的热点之一。 迄今已从动物、植物、昆虫等生物体内分离到肽抗生素300多种，新的肽抗生素还在不断被发现，有的类别还发现存在多种突变体。不同种类、不同突变体的肽抗生素活性有不同程度差异。为了获得结构简单、活性更强的肽抗生素，研究者们常常在克隆到肽抗生素分子后，通过构建其突变体库，从中筛选更理想的目的分子。这种筛选工作量大、盲目性强、成本高，目前在高活性肽抗生素分子的设计方面可借鉴的数据也不多。 基于以上认识，我们进行了：①人源肽抗生素hPAB-β的基因克隆，成熟肽的化学合成及活性初步鉴定。②hPAB-β重组杆状病毒的构建及原核高效、稳定表达工程菌的建立。③hPAB-β突变体的设计及其高效表达工程菌的构建。④融合蛋白的纯化、目的蛋白分离及复性、抗菌活性测定及突变体筛选。其实验内容和实验结果主要包括以下几个方面： 1．人源肽抗生素hPAB-β的基因克隆：①对动物23种β型肽抗生素的氨基酸序列进行对比，选择部分相似性较高的序列，分析其成熟肽的结构特点，抽提β型肽抗生素的一级结构特征，并以此为基础设计简并引物。②应用SMART PCR试剂盒和简并引物从人皮肤角质形成细胞cDNA中扩增到长分别为24obp和1 3obp左右的2种片段，将它们插入pMD 18一T载体，用酶切法初步筛选阳性重组子pM.hRABL和pM一hRABS，对阳性重组子进一步作测序鉴定。③对测序获得的DNA序列进行ORF分析，发现2个大于100bp的ORF，一个192bp，另一个147bp，第二个ORF与第一个的3’一端完全重迭，可能为假基因。真正的基因可能为第一个O即。经BLASTn检索，在GenBank中发现第一个ORF与动物p一肤抗生素高度相似，与人肤抗生素hBD一1、hBD一2、hBD一3分别有4 1 .14%、76.56%、55.21%的碱基相同，在氨基酸水平分别有36.51%、79.37%、46.03%相同。结果表明克隆到的基因极可能是人p一型肤抗生素家族中的一个新成员，将之命名为hPAB一p (human peptide antibioties一p)。④新克隆的hPAB一p编码63个氨基酸，经信号肤分析表明hPAB一p编码一22个氨基酸组成的信号肤，成熟肤为41个氨基酸，分子量4333.04Da，等电点(px)8.791。 2.hPAB一p抗菌活性初步鉴定:①采用固相法合成了hPAB一p成熟肤，经即一HPLC纯化后用质谱测定合成肤的分子量为4334.%Da，与其理论分子量相符。②采用谷肤甘肤氧化/还原法对合成肤进行复性，平板法测得复性后合成肤对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等实验菌均具有杀菌活性。 3.突变体的设计及其重组杆状病毒构建:①采用同源模建法分析hPAB一p的空间结构，并以此结构为基础，设计hPAB一p突变体hPAB一p38和hPAB一p 34。②通过引物设计引入突变和PCR扩增法获得突变体的基因序列，并将之插入杆状病毒供体质粒pFAST HTa中，筛选重组质粒进一步转染携带杆状病毒的DH 1 OBac大肠埃希菌。遗憾的是本研究在用重组杆状病毒DNA转染昆虫Sf-9细胞时未获得重组病毒。 4.h队B一p及其突变体高效表达工程菌的构建:①将用PCR扩增的h队B一p、h狱B一p 35、h队B一p 34基因，分别与pinpointXa一3质粒连接，转化JM 109大肠埃希菌，获得的工程菌在表达融合蛋白时不稳定，第5代后即见不到表达条带。②将pinpoini一hPAB-p重组质粒转化入蛋白酶缺陷BLZI大肠埃希菌，新筛选到的菌株表达的融合蛋白占细菌总蛋白的20%左右，但在传至n代后也见不到融合蛋白表达，工程菌逐步丧失融合蛋白表达能力的原因不详，可能与融合蛋白中的承载蛋白分子(Carrier protein，CP)不够理想有关。③根据肤抗生素的特性要求，特异设计并筛选到了个新的承载分子，将肤抗生素hPAB一日及其突变体hPAB一p 38、h队B一p34分别插入该承载分子3’端构建成融合基因，在两个基因间含有澳化氰 (cNBr)的裂解位点，进一步将融合基因插入pQE一32表达载体，转化大肠埃希菌筛选出pQE一h队B一p/J M 1 09工程菌，经表达分析，该工程菌表达稳定，表达的融合蛋白占细菌总蛋白的40%以上，为肤抗生素hPAB一目及其突变体的制备、纯化和筛选奠定了基础。 5.重组肤抗生素的纯化及活性测定:①大量表达并分离肤抗生素h队B-日及其突变体融合蛋白包涵体，采用smol/L尿素或6mol几盐酸肌溶解包涵体并用Ni一Nl’A柱纯化融合蛋白。②用CNBr裂解融合蛋白，经透析后用葡聚糖凝胶过滤和阳离子交换层析分离和纯化目的肤抗生素。③采用谷肤甘肤氧化/还原法对重组肤抗生素进行复性，应用平板法和稀释法测定复性目的产物对8株实验室保存菌株及10个临床分离株的杀菌活性，表明重组肤抗生素hPAB一p和突变体hPAB一日38与化学合成的hPAB一p有?
侯瑞[2]2007年在《肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达、纯化与活性鉴定》文中研究指明研究背景:肽抗生素(peptide antibiotics)是生物体基因编码的、具有抗微生物活性的小肽。它通常由12～60个氨基酸所组成,分子量小于10kD,是生物体天然免疫的重要组成部分,是宿主在感染之后、机体的特异性免疫建立之前,控制微生物生长的重要物质。与传统的抗生素相比,它们具有广谱、高效的杀菌活性。在临床上耐药性问题日益棘手的今天,肽抗生素的研究和开发得到广泛重视。本室曾用简并引物从人皮肤角质形成细胞中克隆到一人β型肽抗生素,称为hPAB-β,并通过化学合成该肽证实了其杀菌活性。在原核表达系统中,曾以融合蛋白的形式表达该肽,但实际表达量占菌体总蛋白的比率仅约7%;也设计过多拷贝串联体来提高目标肽的产量,通过制备工艺的优化,在10升发酵罐中高密度发酵hPAB-β(3)/M15目的肽的表达率可达30.2%。但通过原核表达系统制备肽抗生素hPAB-β仍存在一些问题,如经过化学裂解、纯化、复性等处理,能获得活性目标肽,但回收率较低(约20%),使得最终复性得到的目标肽的产量较低,不利于规模化制备。因此寻找更好的表达系统,提高目标肽的表达量,得到回收率及纯度较高的产物是hPAB-β高效制备及临床前研究必须解决的问题。为此,我们选择了毕赤酵母表达系统来表达hPAB-β,展开了本课题的研究。研究内容与结果:1. hPAB-β毕赤酵母表达载体的构建:设计构建两类重组质粒。①含有6×His纯化标签:A:含天然hPAB-β序列的重组pPIC9K质粒。B:根据毕赤酵母密码子偏嗜性,构建含优化hPAB-β序列的重组pPIC9K质粒。②不含6×His纯化标签:含优化hPAB-β序列的重组pPIC9K质粒。我们首先用PCR及引物延伸法得到含标签的天然及优化的hPAB-β序列,经SnaB I和Not I双酶切后,与经过同样双酶切的pPIC9K质粒连接,转化DH5α大肠埃希菌,提取重组质粒,用PCR、双酶切和核苷酸测序鉴定。对于无标签的优化hPAB-β序列,我们以含标签的优化hPAB-β基因为模板,设计PCR引物扩增目的基因序列,经SnaB I和Not I双酶切后,与经过同样双酶切的pPIC9K质粒连接,转化DH5α大肠埃希菌,同样用PCR、双酶切和核苷酸测序鉴定。结果表明,从这两类重组质粒中可分别扩增出约167bp和144bp大小的片段,经Xho I/Not I双酶切也可切出约167bp和144bp大小的片段,与预期结果相符。核苷酸测序证实,含标签的天然hPAB-β序列有一同义突变,阅读框正确。含标签和无标签优化的hPAB-β序列和阅读框均完全正确。2. hPAB-β重组毕赤酵母的构建:将构建好的两类重组质粒经Sal I酶切线性化后,电转化整合入GS115毕赤酵母中,用浓度逐渐增加的G418来筛选多拷贝菌株,并鉴定其表型。对筛选出的菌株在DNA、mRNA及蛋白水平进行鉴定。结果表明,通过提取转化子的基因组进行PCR扩增,可得到约167bp和144bp大小的片段;经过对转化子的诱导表达,RT-PCR可扩增出约167bp和144bp大小的片段,均与预期结果一致。3.摇瓶水平表达目标肽的纯化与活性鉴定:对于含有6×His标签的目标肽先用Ni-NTA亲和层析进行初步纯化,再用P2分子筛层析脱盐进一步纯化,可得到较纯的目标肽;对于不含6×His标签的目标肽则用Source-30 RPC柱进行反相层析初步纯化。纯化后Tricine-SDS-PAGE分析显示,在约5.6kD和4.5kD处检测到目的蛋白条带。经抑菌实验验证,纯化后的两类重组目标肽对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌临床分离株具有良好的抑菌作用。4. hPAB-β工程菌高密度发酵条件的研究:与摇瓶水平表达相比,大规模高密度发酵时工程菌的生长环境不同,受培养基成分、细胞密度、溶氧值等诸多参数的影响。因此,在初步确定hPAB-β的表达条件后,用发酵罐深入探讨毕赤酵母高密度发酵表达无标签hPAB-β的条件:采用补料分批发酵的方式,接种工程菌于BMGY培养基中培养,作为一级种子菌;再在200ml BMGY培养基中按1%的比例接种一级种子菌作为二级种子菌。然后将二级种子菌按10%的比例接种于2L基础盐培养基的发酵罐中,同时添加微量元素培养基,通过调节转速将溶氧控制在70%以上,pH值控制在(5±0.05),温度控制在30℃,在初速度600r/min的条件下密集生长。待培养基中甘油耗竭,溶氧开始上升时添加补料生长培养基,每小时10ml/L,直到菌体湿重达到200～250g/L。停止流加补料生长培养基3 h,然后向罐中流加补料诱导培养基,开始用甲醇诱导菌体表达,每小时3ml/L持续3 h,之后增加到每小时9ml/L,在此期间pH值仍控制在5.0左右。按此条件,发酵上清经Tricine-SDS-PAGE分析可以看到有分子量约4.5kD的蛋白表达,与预期结果相符。叁次发酵上清的总蛋白浓度分别为664.0μg/ml、781.8μg/ml和721.3μg/ml,目标肽的表达率达分别为11.1%、9.8%和10.3%。那么,叁次发酵上清中目标肽的表达量分别为73.7mg/L、76.6 mg/L和74.3mg/L。5.高密度发酵表达hPAB-β的纯化与活性鉴定:对工程菌优5’高密度发酵表达无标签的hPAB-β后,将上清首先用Source-30 RPC柱进行反相层析初步纯化,再用P10分子筛层析分离不同大小的蛋白,同时达到脱盐的效果,Tricine-SDS-PAGE分析表明目标肽存在于P10分子筛的2峰中。之后将P10分子筛的2峰用Hi-pore Reversed Phase column进行反相高效液相色谱纯化,使目标肽纯度达95%以上。经抑菌实验验证,纯化后无标签hPAB-β对金黄色葡萄球菌临床分离株(MRSA)具有抑菌作用,且它对金黄色葡萄球菌临床分离株(MRSA)的抗菌活性强于新青Ⅱ、克林霉素,而略弱于去甲万古霉素。结论:本研究成功获得含标签的天然及优化的hPAB-β序列和无标签的优化的hPAB-β序列,在毕赤酵母表达载体pPIC9K基础上构建了两类重组质粒,筛选到能成功表达目标肽的高拷贝阳性转化子。在摇瓶表达的基础上进一步摸索了工程菌高密度发酵的条件,经过对重组目标肽的一系列纯化,得到了具有高纯度、较强生物学活性的hPAB-β,探索了一条更好的规模化制备重组hPAB-β的路线。
饶贤才, 金晓琳, 黎庶, 胡金川, 胡晓梅[3]2003年在《人肽抗生素hPAB-β分子的同源模建及其突变体设计》文中认为目的 :获得肽抗生素hPAB β的分子结构 ,设计其突变体。 方法 :在序列比较的基础上 ,利用同源分子对hPAB β进行同源模建 ,并以此为基础设计其突变体 ,通过PCR引入突变法获得突变体基因序列 ,将其克隆到原核融合蛋白表达质粒 pQE CP4中 ,转化JM 10 9大肠杆菌进行表达。 结果 :模建结果表明 ,hPAB β由一个α螺旋和3个 β片层构成 ,二级结构保守 ,具有两亲性结构 ;其α螺旋推测与活性寡聚体形成有关 ;Asp4带负电 ,可能通过削弱寡聚体中央微孔口处阳电荷富集区而降低目的分子的生物学活性。利用PCR成功克隆了所设计的突变体基因 ,通过构建融合蛋白表达质粒 ,实现了突变体融合蛋白在大肠杆菌中的表达。 结论 :基于分子同源模建的肽抗生素hPAB β突变体的设计、克隆和成功表达 ,为筛选肽链更短、抗菌活性保持不变或更强的新分子创造了前提
参考文献：
[1]. 人肽抗生素hPAB-β的基因克隆、表达及活性研究[D]. 饶贤才. 第叁军医大学. 2002
[2]. 肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达、纯化与活性鉴定[D]. 侯瑞. 第叁军医大学. 2007
[3]. 人肽抗生素hPAB-β分子的同源模建及其突变体设计[J]. 饶贤才, 金晓琳, 黎庶, 胡金川, 胡晓梅. 医学研究生学报. 2003
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