郭鸿[1]2007年在《水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建及纤维素酶基因的克隆和鉴定》文中研究说明本工作分6次从30个水牛瘤胃内容物中提取了未培养微生物的总DNA，用含2％酸洗PVPP的Sephadex G200凝胶层析纯化DNA后，再用电洗脱法纯化并回收30～50kb的。DNA片段。把回收片段末端修复后，以柯斯质粒pWEB∷TNC为载体构建了6个宏基因组文库，获得1.26×10~5个克隆，随机提取其中15克隆的质粒并用BamHI进行酶切分析，结果显示所有质粒都含有酶切带型不相同的外源片段，说明文库克隆的外源DNA片段随机性比较大。提取的质粒外源片段最大的为48.0kb，最小的20.5kb，平均大小为38.2kb，推测文库含外源DNA的总长度约为4.8×10~6kb。利用活性筛选法从中共筛选获得6个仅表达4-MUCase活性的克隆、22个表达内切葡聚糖酶活性的克隆及118个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆。本工作对2个只表达4-MUCase活性的克隆pCGE04和pCGE06进行了亚克隆和测序分析，发现2个纤维素酶基因umce／5P和umce／5Q，它们编码的产物均属于糖苷水解酶家族5的成员。umce／5P的ORF长999bp，可编码一个含332个氨基酸残基的内切葡聚糖酶，该酶与一个来自于未培养细菌(uncultured bacterium)的内切葡聚糖酶(GenBank索引号：ABA02176.1)的同源性最高，具有53％的一致性和68％的相似性。umce／5Q的ORF长1，331bp，可编码一个含386个氨基酸残基的内切葡聚糖酶，该酶与来自于反刍瘤胃亚菌(Prevotella ruminicola)的一个糖基水解酶家族5的纤维素酶(GenBank索引号：BAA74515.1)的同源性最高，具有75％的一致性和84％的相似性。将118个表达β-葡萄糖苷酶活性的独立克隆在pH5.0、37℃条件下培养，发现其中8个克隆表达的β-葡萄糖苷酶活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆，序列分析发现一个2223bp的潜在的编码β-葡萄糖苷酶基因(umce／3G)的开放阅读框(ORF)，其编码产物的氨基酸序列与来自于芽孢杆菌(Bacillus sp．)的一个β-葡萄糖苷酶(GenBank索引号：BAA36161)同源性最高，具有60％的一致性和73％的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel 3G的分子量与预测大小相似，酶谱分析表明该表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性，证实该基因为一个β-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel 3G的酶学特性，其最适pH和最适温度分别为6.0～6.5和45℃。以pNPG为底物，在最适条件下，测得该酶的比活力为35.4 lU／mg。一些金属离子对Umcel 3G的活性影响非常大，例如Ca~(2+)可以显着提高其酶活，而Fe~(3+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)则几乎完全抑制该酶的活性。
赵广存[2]2005年在《牛瘤胃未培养微生物纤维素酶基因的克隆、鉴定及表达》文中进行了进一步梳理本研究通过构建牛瘤胃未培养微生物的宏基因组文库,共获得12000个克隆,文库外源DNA总容量为4.2×10~8bp,筛选得到十个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆和十个表达β-1,4-内切葡聚糖酶活性的克隆,而且在十个表达β-1,4-内切葡聚糖酶活性的克隆中pGXN1035和pGXN1067两个克隆兼表达木聚糖酶活性。选择表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆pGXN1009和表达β-1,4-内切葡聚糖酶活性兼表达木聚糖酶活性的克隆pGXN1035和pGXN1067作为进一步研究的对象。通过亚克隆及测序得到叁个基因umbg13A、umce15C和umce15D。 umbg13A基因全长为1956bp,其编码产物是由651个氨基酸组成的蛋白,蛋白质预计的分子质量为70133Da。其编码产物与一个来源于小鼠大肠未培养细菌的β-葡萄糖苷酶的一致性为63%、相似性为79%。Umbg13A包含一个家族3糖基水解酶功能域和一个家族3C糖基水解酶功能域。遗传进化分析推测umbg13A基因可能是来自牛瘤胃微生物噬纤维菌属的一个种。 umce15C基因全长为1314bp,其编码产物是由437个氨基酸组成的、分子质量预计为48,675Da。Umce15C蛋白与栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)的木聚糖酶的一致性为45%、相似性为62%,与布赖恩特普雷沃氏菌(Prevotella bryantii)的β-1,4-内切葡聚糖酶的一致性为38%、相似性为55%,Umce15C蛋白N端的第2-221个氨基酸是糖基水解酶家族5功能域。
封毅[3]2007年在《兔子盲肠未培养微生物纤维素酶基因的克隆、表达及产物的酶学特性研究》文中认为全世界的石油资源已经面临枯竭的危险，许多国家正在努力寻找可以替代石油的可再生能源。燃料乙醇是车用汽油的替代燃料，大力开发和使用燃料乙醇对能源危机的缓解，环境的保护，经济的可持续发展、农民收入的增加以及国家的安全都有着重大的意义。目前生产燃料乙醇的主要原料为淀粉类和糖质类。木质纤维素是植物利用太阳能合成的由葡萄糖聚合而成的多糖，是世界上最丰富的、可再生的生物质资源。纤维素可以在纤维素酶的作用下被降解成为葡萄糖，葡萄糖很容易在微生物的作用下发酵生成乙醇，所以，木质纤维素是最有发展潜力的燃料乙醇的生产原料。但由于目前的纤维素酶普遍存在着酶活力低、生产成本高的缺陷，用木质纤维素生产燃料乙醇至今不能真正实现工业化，开发新的纤维素酶资源一直是该领域的研究热点。自然界中，纤维素酶主要由微生物产生，草食动物依靠消化道中的微生物来分解富含纤维素的食物。盲肠是兔子等非反刍草食动物最重要的消化器官，盲肠中许多共生微生物能分泌纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等降解植物的细胞壁。但是，迄今为止，国内外还没有从兔子盲肠中克隆到纤维素酶基因的研究报道。本文通过未培养的方法，从兔子盲肠内含物中克隆细菌的纤维素酶基因，研究兔子盲肠中纤维素酶的多样性以及它们的生化特性，为进一步挖掘兔子盲肠纤维素酶的应用潜力奠定基础。在本研究中，我们直接提取兔子盲肠内含物中微生物的混合DNA(宏基因组DNA)，扩增了宏基因组DNA的16S rRNA基因，通过遗传进化分析发现，样品中大部分细菌是未研究过的细菌，它们主要来源于厚壁菌门(Firmicutes)、变形杆菌门(Proteobacteria)及拟杆菌门(Bacteroidetes)。我们用提取到的混合DNA构建了一个兔子盲肠未培养微生物的宏基因组柯斯质粒文库，文库含3.25×10~4个克隆，平均插入片段为35.1kb，文库总容量为1.14×10~9bp，文库的外源插入片段具有很好的随机性。我们对文库进行活性筛选，获得了11个表达纤维素酶活性的独立克隆，其中有4个克隆表达内切-β-1，4-D-葡聚糖酶和7个克隆表达β-葡萄糖苷酶活性。对这11个独立克隆分别进行了亚克隆和测序分析，所得到的11个纤维素酶基因与GenBank中已知的纤维素酶基因在核苷酸水平上没有明显的同源性，它们的编码产物与已知的纤维素酶的氨基酸一致性低于50％、相似性低于70％，说明本研究所克隆到的纤维素酶基因均为新的基因。由此可见，兔子盲肠是研究和发现新的纤维素酶基因的很好材料。从氨基酸序列分析得知，4个内切-β-1，4-D-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第5家族(Glycosyl hydrolase family 5)，它们都只含有一个糖基水解酶第5家族的催化功能域(Cellulase domain)，而不含碳水化合物结合组件(Carbohydrate-binding module)。7个β-葡萄糖苷酶均属于糖基水解酶第3家族，它们肽链的N端均含有糖基水解酶3C功能域(Glycosyl hydrolase family 3 C-terminal domain)，C端均含有糖基水解酶3功能域(Glycosyl hydrolase family 3 domain)。对11个纤维素酶阳性克隆所表达的粗酶进行了初步的酶学特性分析，其中10个纤维素酶的最适作用pH和温度分别为pH5.5～7.0和40～55℃，与兔子盲肠内的pH和温度(pH6.5和39℃)相似，说明所克隆到的纤维素酶较好地适应了兔子盲肠的内部环境。4个内切-β-1，4-D-葡聚糖酶具有广泛的底物范围，它们都能降解以β-1，3／1，6键合的葡聚糖——昆布多糖(Laminarin)，这一性质在第5家族的内切葡聚糖酶中非常特别。我们用大肠杆菌BL21(DE3)过量表达了一个内切葡聚糖酶基因umcel5G和一个β-葡萄糖苷酶基因umbgl3B，纯化了表达产物，对纯化的重组酶进行了酶学性质研究。纯化后的重组内切-β-1，4-D-葡聚糖酶Umcel5G在pH5.0～9.0和温度低于55℃的条件下比较稳定，其最适作用条件为：pH6.0～6.5和55℃。该酶以随机内切的方式作用于纤维寡糖，CoCl_2、CaCl_2和CrCl_2对该酶有激活作用，而CuCl_2、ZnCl_2、螯合剂EDTA和表面活性剂SDS对该酶有抑制作用。Umcel5G对CMC底物的Km值为16.07mg／ml，最大反应速度Vmax为417.5U／mg。纯化后的重组β-葡萄糖苷酶Umbgl3B在pH4.5～9.0和温度低于35℃的条件下比较稳定，其最适作用条件为：pH6.0～7.0和40℃。Umbgl3B能降解纤维二糖，对叁糖以上的纤维寡糖没有作用，是个典型的β-葡萄糖苷酶。COCl_2和CrCl_2对该酶有较强的激活作用，CuCl_2、EDTA和SDS则显着降低该酶的活力。在本课题的研究中，我们在国际上首次采用未培养方法从兔子盲肠中克隆纤维素酶基因，阐述了兔子盲肠纤维素酶的多样性，首次异源表达了克隆自兔子盲肠未培养微生物的一个内切-β-1，4-D-葡聚糖酶基因和一个β-葡萄糖苷酶基因，并较为深入地研究了这两个纤维素酶的酶学特性。
袁静[4]2012年在《黑山羊胃肠微生物宏基因组文库构建及多样性研究》文中提出我国是环境资源大国。农业废弃物、秸秆等富含纤维素的废弃物也逐渐增多,如何综合利用这些资源,是科研工作者当前研究的热点之一。自然界生物圈中有大量分解纤维素的微生物,其中99%以上是不可培养的,这些微生物含有丰富的基因资源,通过构建宏基因组文库,从中筛选功能基因,为功能基因的开发提供了一条新的途径。本研究采用脉冲场凝胶电泳等技术构建黑山羊瘤胃未培养微生物BAC宏基因组文库,从中筛选到纤维素酶克隆。同时对黑山羊胃肠道不同部位微生物资源群落结构多样性进行了分析,所获结果如下：(1)采用低熔点琼脂糖包埋法提取纯化微生物DNA片段,用Hind Ⅲ不完全酶切DNA片段,获得片段大小约为100-200kb,再用BAC载体构构建微生物宏基因组文库,该文库含有5000个克隆,采用底物驱动的筛选方法,筛选到2个既具有内切葡聚糖酶活性又具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆子,分别命名为B112-C12和B112-D12。(2)采用PCR技术先扩增黑山羊胃肠道不同部位微生物(细菌和真菌)基因片段,通过变性梯度凝胶电泳技术分离,从而进行聚类分析,黑山羊结肠和盲肠部位细菌和真菌微生物群落结构多样性相似性很高,分别为84%和74%。对黑山羊胃肠道不同部位微生物多样性指数和均匀度指数进行分析,结肠的细菌多样性指数最高(H'=4.4609),除外胃室-1和胃室-2的均匀度比较低以为,其余样品的均匀度都较高；而对于真菌群落结构多样性分析,胃室-1的真菌多样性指数最高(H'=5.0806),9个样品的均匀度都较高,没有很明显的差异。本研究构建了黑山羊瘤胃未培养微生物宏基因组BAC文库和胃肠道不同部位微生物群落结构多样性进行了分析,为今后进一步研究宏基因组学和微生态提供了参考依据。
莫新春[5]2007年在《能降解纤维素的富集培养物的宏基因组文库的构建及其新的木聚糖酶基因的克隆、鉴定及表达》文中研究说明本研究利用选择性富集培养的方法构建了一个能降解稻草和滤纸的富集培养物，从该富集培养物中提取所有微生物的总DNA(metagenomic DNA)，用柯斯质粒pWEB：：TNC为载体构建了含12000个克隆的宏基因组文库(metagenomic library)，随机挑取其中的16个克隆提取质粒进行BamHI酶切分析，结果显示所有的质粒都含有插入片段，最大为37 kb，最小为14 kb，平均大小为25.5 kb，文库克隆的外源DNA总容量为3.06×10~8bp，16个质粒的酶切带型都不相同，说明文库克隆的外源DNA片段随机性比较大。基于活性筛选的方法从文库中筛选得到了2个表达外切葡聚糖酶活性的阳性克隆和6个表达内切葡聚糖酶活性的阳性克隆。选择其中的2个表达外切葡聚糖酶的阳性克隆3621和70981、1个表达内切葡聚糖酶活性最强的阳性克隆11210进行了亚克隆和测序分析，鉴定了3个相关基因：umxyn10A、umgs1A和umcel9E。基因umcel9E全长2，841bp，编码一个含945个氨基酸残基的内切葡聚糖酶，该酶与来自于Clostridium thermocellum ATCC 27405的1，4-beta-cellobiosidase(GenBank索引号EAM46961.1)的同源性最高，具有99％的一致性和100％的相似性。基因umgs1A全长1，707bp，编码一个含569个氨基酸残基的对4-MUC具有降解活性的酶，该酶与Saccharomyces cerevisiae的gamma-glutamylcysteine synthetase(GenBarrk索引号BAA14251.1)的同源性最高，具有99％的一致性和99％的相似性。基因umxyn10A全长1，188bp，编码一个含396个氨基酸残基的木聚糖酶，该酶与一个来自Thermobifida fusca YX的endo-1，4-beta-xylanase(GenBank索引号AAZ56824.1)的同源性最高，具有62％的一致性和78％的相似性。对基因umxyn10A进行了异源表达，以木聚糖为底物对纯化蛋白Umxyn10A进行酶学特性分析，该酶的最适反应pH值为6.5，最适反应温度为75℃。Km为3.217mg／ml，Vmax为217U／mg蛋白，该酶可在pH 5.0-7.0之间及温度低于65℃保持活力稳定。该酶对以p-NPC为底物的最适作用pH值为6.5，最适应该温度为70℃。大多数金属离子和螯合剂EDTA对该酶的活性并无明显的影响，但发现表面活性剂SDS对该酶有抑制作用，说明该酶不是金属酶。底物特异性分析表明该酶只作用于含有β-1，4糖苷键的糖类。以各种纤维寡糖作为底物来分析Umxyn10A的作用方式，薄层层析显示Umxyn10A对纤维二糖没有水解作用，纤维叁糖被水解为纤维二糖和葡萄糖，纤维四糖被完全水解为纤维二糖，纤维五糖被水解为纤维二糖和葡萄糖。这说明Umxyn10A是一个具有外切作用方式的木聚糖酶。
许跃强[6]2006年在《造纸废水纸浆沉淀物宏基因组文库的构建及纤维素酶基因的克隆和鉴定》文中研究说明分别采用间接提取法和直接提取法从造纸废水纸浆沉淀物中提取宏基因组DNA，使用含2％酸洗PVPP的Sephadex G200凝胶柱和电洗脱两步法进行纯化。以直接提取法获得并纯化的DNA为模板，PCR扩增该环境中细菌的16S rDNA并构建文库。随机挑取文库克隆进行测序，BlastN对比表明该环境中存在大量的未培养细菌，并具有种类的多样性，系统发育分析显示这些未培养细菌可分为螺旋体、变形杆菌、拟杆菌和厚壁菌四个群落。分别回收间接提取法和直接提取法获得的宏基因组DNA中30～50kb的片段并补平末端，以柯斯质粒pWEB∷TNC为载体构建了两个宏基因组文库PS1和PS2。以间接提取法提取的DNA构建的文库PS1含8，000个克隆，外源总DNA容量为2.43×10~8bp；以直接提取法提取的DNA构建的文库PS2含10，000个克隆，外源总DNA容量为3.53×10~8bp。经活性筛选从文库PS1中得到一个表达内切葡聚糖酶活性的克隆；从文库PS2中得到2个表达内切葡聚糖酶活性的克隆，3个表达外切葡聚糖酶活性的克隆及2个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆。选择文库PS1中的活性克隆PS1-C64，文库PS2中表达不同活性克隆中活性最强的PS2-C2、PS2-M6和PS2-B1作为进一步研究的对象。经亚克隆、测序和表达鉴定了四个新的纤维素酶基因umcel5F、umcel5L、umcel5M和umbgl3D。umcel5F全长1，110bp，编码一个含369个氨基酸残基的内切葡聚糖酶，该酶与一个来自嗜酸细菌的内切葡聚糖酶(GenBank索引号：AF40690)的同源性最高，具有38％的一致性和54％的相似性。umcel5L全长1，521bp，编码一个含506个氨基酸残基的内切葡聚糖酶，该酶与大豆慢生根瘤菌的一个内切葡聚糖酶(GenBank索引号：BAC48632)的同源性最高，具有43％的一致性和59％的相似性。umcel5M全长1，053bp，编码一个含350个氨基酸残基的纤维糊精酶，该酶与产琥珀酸丝状杆菌的一个纤维糊精酶(GenBank索引号：AAA50210)的同源性最高，具有48％的一致性和69％的相似性。umbgl3D全长2，382bp，编码一个含793个氨基酸残基的β-葡萄糖苷酶，该酶与海栖热袍菌的一个β-葡萄糖苷酶(GenBank索引号：AAD35119)的同源性最高，具有46％的一致性和61％的相似性。在(?)KTA explorer 100蛋白纯化仪上使用Source 15Q阴离子交换柱对重组蛋白Umcel5F进行纯化。以羧甲基纤维素(CMC)为底物对纯化蛋白Umcel5F进行酶学特性分析，该酶的最适反应pH值为6.5，最适反应温度为55℃，Km为16.44mg／ml，Vmax为433.7U／mg蛋白，该酶可在pH 5.5-10.0之间及温度低于50℃保持活力稳定。以各种寡糖作为底物来分析Umcel5F的底物特异性，薄层层析显示Umcel5F对纤维二糖和纤维叁糖没有水解作用，纤维四糖被完全水解为纤维二糖，纤维五糖被水解为纤维二糖和纤维叁糖。对Umcel5F降解CMC的产物进行粘度测定，结果表明随着反应时间的推移，反应产物的粘度缓慢下降，同时伴随着还原糖量的不断上升。这说明Umcel5F是一个具有外切作用方式的内切葡聚糖酶。这是第一次采用未培养方法对造纸废水纸浆沉淀物的细菌多样性进行分析并从中克隆新的纤维素酶基因的研究报告。
田伟[7]2012年在《牛粪高温堆肥过程中的物质变化、微生物多样性以及腐熟度评价研究》文中指出好氧高温堆肥是一种经济、环保的农业固体有机废弃物资源化利用的手段。高温堆肥过程中的物质变化与腐熟度评价以及微生物多样性的研究一直以来都是国内外关注的热点,它们与堆肥产品的质量和堆肥发生的机理密切相关,对堆肥的生产具有指导意义。但是,文献报道的大多数堆肥腐熟度的评价指标测定起来比较复杂,不利于中小型堆肥企业的实际应用。另外,对于堆肥过程中微生物多样性的研究更多的是以实验室规模的小型发酵试验为主,而对于企业应用较多的传统条垛堆肥发酵关注较少,并且分析方法也有一定的缺陷。因此,本文以牛粪和水稻秸秆为原料进行了高温条垛堆肥的发酵,对堆肥过程中的物质变化与腐熟度评价以及微生物多样性进行了研究,主要研究结果如下：1.通过对堆肥过程中的部分物理指标、化学指标和生物指标的研究表明整个堆肥过程可以明显的分为升温(0-12天)、高温(22-52天)和降温腐熟(62-112天)叁个不同的阶段,有机物质的降解和水分的蒸发等主要发生在堆肥的升温和高温阶段(0-52天),而硝化作用和腐殖化作用主要发生在堆肥的降温和腐熟阶段。以测得的各种理化指标进行腐熟度评价发现单个指标并不能很好的评估堆肥的腐熟程度,必须两个或两个以上的指标相结合。以发芽指数(GI)为标准进行相关性分析表明C/N、OM损失和NH4+-N/NO3-N是更为可靠的牛粪堆肥腐熟度的评价指标；各指标综合评价表明以牛粪和水稻秸秆为原料的堆肥62天以后已经达到腐熟。2.叁维荧光光谱与荧光区域指数(EEM-FRI)的研究结果表明在牛粪高温堆肥过程中,蛋白质的含量逐渐低,而腐殖酸和富里酸的含量则逐渐上升；通过EEM-FRI与堆肥过程中的理化指标以及生物指标的相关性分析确定,EEM-FRI与大部分常用的评价堆肥腐熟度的理化指标都显着相关,因此可以用于评价牛粪堆肥的腐熟度,并且具有简单、快速的特点。红外光谱的分析结果则显示随着堆肥的进行,不同时期堆肥样品的红外光谱的峰所在的区域变化不大,只是峰的强度变化较大。3.分别对五种不同的堆肥DNA提取方法进行了细胞破壁效率、DNA和腐殖酸产量、PCR扩增和微生物多样性等方面的比较,建立了一种适合以牛粪和水稻秸秆为原料的堆肥样品的DNA提取和纯化方法FTSPP. FTSPP法的细胞破壁效率达到了94.6%,纯DNA的产量达到了33.19μg/g dw,并且在1μg/μ1牛血清白蛋白(BSA)存在的条件下成功的进行了PCR扩增,并且通过荧光定量PCR和DGGE分析表明,FTSPP法提取的DNA获得的细菌和放线菌的16S rRNA的拷贝数以及DGGE条带数均高于其他方法。4.通过平板培养技术对牛粪高温堆肥过程中的常温(30℃)和高温(55℃)微生物的数量进行了研究,结果表明无论常温还是高温可培养微生物的数量在堆肥过程中均经历了一个先增加再降低然后再增加的变化趋势,常温细菌和放线菌的数量在第22天达到最大值,分别为9.331g CFU/gdw和7.181g CFU/gdw,而常温真菌则在第12天达到最大值,为5.121g CFU/g dw;高温细菌和放线菌数量最大值出现的时间比常温微生物明显滞后,均在第32天获得最大值,1g CFU/g dw分别为7.17和5.78,而高温真菌在第22天达到最大值,1gCFU/g dw为3.24。根据DGGE的研究结果可将整个堆肥过程分为0-12天、22-52天和62-112天叁个与根据温度划分相一致的阶段,在堆肥前期(0-12天)微生物种类变化最剧烈,但总体呈现先上升再下降最后再上升的变化趋势,并且高温阶段的样品与降温腐熟阶段的样品的相似性要高于升温阶段的样品。成功测序的DGGE条带的序列比对结果显示,Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria和Actinobacteria是堆肥过程中主要的微生物门类,条带M和条带X均与Bacillus属微生物表现出了较高相似性(99%),条带S则与Streptomyces sp.(EF012138)表现出了100%的序列相似性,另外,大部分为未培养的微生物。根据FRI参数与堆肥过程中细菌的种类变化的相关性分析发现PⅡ,n和PⅣ,n与堆肥过程中细菌的种类变化的相关系数分别达到了0.907和0.949,进一步的线性回归分析证明PⅣ,n是更可靠地评价以牛粪和水稻秸秆为原料的堆肥过程中细菌种类变化的参数。分别对0、12、42和112天的堆肥样品进行了16S rRNA基因克隆丈库的构建和序列分析,成功测序的779个克隆的Genebank登陆号为JQ336994-JQ337772.多样性分析表明四个时间段的Shannon-Wienner指数分别为2.64、3.25、3.18和4.05。序列分析显示Frimicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi门的微生物在堆肥过程中普遍存在,而Actinobacteria则只存在于堆肥的高温阶段(42天),并且第一次在堆肥后期样品中(112天)发现了BCR1门的微生物。Arthrobacter属的克隆数在高温阶段的样品中(42天)含量最高,达到了21.74%；而Bacillus和Bacillus相关的属包括Soilbacillus, Aneurinibacillus, Marinibacillus和Ureibacillus的相对含量为8.70%,在第112天更是达到了10.25%；另外,第112天的样品中,伴随着新的属包括Flavobacterium, Parapedobacter, Nitrosomonas, Ochrobactrum和Rhizobium的出现；所有文库中有相当一部分序列属于未分类微生物,并且随着堆肥的进行它们所占的比例越来越高。5.从第82天的新鲜堆肥样品中经过富集、初筛和复筛成功的分离到两株具有较高纤维素酶活的细菌菌株T1和T2,结合生理生化和16S rRNA基因序列分析分别鉴定为Bacillus cereus和Bacillus subtilis.根据NCBI报道的Bacillus subtilis葡聚糖内切酶基因设计引物,克隆到Bacillus subtilis T2的葡聚糖内切酶基因,与报道的内切酶基因均具有99%的相似性,以PET28a为表达载体构建了重组质粒,以E. coli BL21(DE3)为表达菌株,成功的表达了Bacillus subtilis T2的葡聚糖内切酶基因,且在粗酶液检测到了较高的内切酶活性。
袁静, 李清明[8]2012年在《未培养微生物筛选高纤维素酶活性基因的研究进展》文中研究指明纤维素是地球上最丰富的可再生有机资源,利用微生物产生的纤维素酶将其分解对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重要的现实意义。在自然界中存在着大量的无法用传统方法培养的未培养微生物,通过构建宏基因组文库,从中筛选纤维素酶基因,为纤维素酶的筛选提供了一条新的筛选途径。综述了未培养微生物研究现状、宏基因组学的研究和从未培养微生物中筛选纤维素酶基因的研究,为进一步研究纤维素酶提供了理论依据。
辛盛[9]2013年在《未培养微生物中两个纤维素酶基因的克隆、鉴定及表达研究》文中研究说明现代生物质能源作为新一类的可再生能源,它具有资源丰富、低污染、高热值等特点,主要指经过一系列转换技术生产出高品位能源产品来代替化石燃料,其中最主要的是燃料乙醇的生产,目前已受到世界各国的普遍关注和重视。第一代燃料乙醇主要利用淀粉和糖类物质(玉米、大豆和甘蔗等粮食作物)为原材料,不仅产量有限,生产成本也受制于粮食价格的变化,而且还引起了粮食与能源的不良竞争。因此,为了提高燃料乙醇的可持续性,研究人员把目光转向第二代燃料乙醇的生产,主要利用木质纤维素为原材料(如农作物秸秆、能源植物等),生物酶催化水解为糖类物质后发酵生产生物乙醇。目前,第二代生物燃料的研究主要集中两个方面来降低生产成本,一是寻找新型纤维素酶基因或者构建产高效纤维素酶的工程菌株,一是培养易处理的高纤维素含量能源植物。本文以实验室构建的芒草驯养牛瘤胃微生物宏基因组文库和白蚁肠道微生物宏基因组文库为材料,筛选了具有纤维素酶活力的功能菌株。其中,从牛瘤胃微生物文库中筛选到的2-C5菌株具有p-葡萄糖苷酶和CMC酶活性,功能基因全长1414bp,查找出ORF为657bp(命名为unbifC5),编码219个氨基酸。从白蚁肠道微生物文库中筛选到的1-B6菌株具有β-葡萄糖苷酶活性,功能基因全长1021bp,ORF长为825bp(命名为ungluB6),编码275个氨基酸。然后,本文根据序列信息设计特异性扩增引物克隆功能基因,采用Escherichia coli BL21(DE3)原核表达系统、pET28a(+)为表达载体,成功构建了功能基因的重组菌株pET-unbifC5/BL21,经过0.1mMIPTG,37℃诱导6h表达出功能蛋白质unbifC5,并通过Ni-NTA His-Bind Resins纯化。接着对unbifC5功能蛋白质酶学性质分析中,发现其仍具有β-葡萄糖苷酶活性而丢失CMC酶活性,可能是全长基因编码多个开放阅读框的原因；unbifC5β-葡萄糖苷酶最适反应温度为37℃,pH为6.4,耐酸性环境,遇热不稳定；以pNPG为底物测定β-葡萄糖苷酶活力达65.49U/mL,而且功能蛋白质在低浓度葡萄糖的存在下,β-葡萄糖苷酶活力有所增加,在近400mM葡萄糖浓度下仍保留60%,unbifC5的其它性质还有待进一步研究。本文为挖掘未培养微生物中丰富的纤维素酶基因资源,实现燃料乙醇可持续生产奠定了一定的基础。
张鹏[10]2005年在《堆肥未培养微生物的宏基因组文库构建及新的木聚糖酶基因的克隆、鉴定和表达》文中指出通过差速离心从自制堆肥样品中分离未培养微生物细胞,提取其总DNA(metagenomic DNA),末端平头化后,用柯斯质粒pWEB::TNC为载体构建成了包含约5万个克隆的未培养微生物的宏基因组文库(metagenomic library),随机挑取其中的14个克隆提取质粒用BamHI酶切分析,结果显示所有的质粒都含有插入片段,最大为45kb,最小为25kb,平均大小为35kb,文库外源DNA总容量是1.8×10~6kb(1.8Gb),14个质粒的酶切带型都不相同,说明文库克隆的DNA片段随机性比较大。 筛选文库获得2个表达木聚糖酶活性的克隆,分别命名为pGXN1050和pGXN1051。亚克隆、测序分析表明:pGXN1050上潜在的木聚糖酶基因umxyn11A具一个771bp的ORF(Open Reading Frame),可编码含257个氨基酸的蛋白质,所编码产物与混合纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)的内切-1,4-β-木聚糖酶(endo-1,4-beta-xylanase)(GenBank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有46%的一致性和57%的相似性;pGXN1051上潜在的木聚糖酶基因umxyn11B具一个723bp的ORF,可编码含241个氨基酸的蛋白质,编码产物与混合纤维弧菌的内切-1,4-β-木聚糖酶(GenBank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有73%的一致性和80%的相似性。经用SMART工具分析umxyn11A
参考文献：
[1]. 水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库的构建及纤维素酶基因的克隆和鉴定[D]. 郭鸿. 广西大学. 2007
[2]. 牛瘤胃未培养微生物纤维素酶基因的克隆、鉴定及表达[D]. 赵广存. 广西大学. 2005
[3]. 兔子盲肠未培养微生物纤维素酶基因的克隆、表达及产物的酶学特性研究[D]. 封毅. 广西大学. 2007
[4]. 黑山羊胃肠微生物宏基因组文库构建及多样性研究[D]. 袁静. 湖南农业大学. 2012
[5]. 能降解纤维素的富集培养物的宏基因组文库的构建及其新的木聚糖酶基因的克隆、鉴定及表达[D]. 莫新春. 广西大学. 2007
[6]. 造纸废水纸浆沉淀物宏基因组文库的构建及纤维素酶基因的克隆和鉴定[D]. 许跃强. 广西大学. 2006
[7]. 牛粪高温堆肥过程中的物质变化、微生物多样性以及腐熟度评价研究[D]. 田伟. 南京农业大学. 2012
[8]. 未培养微生物筛选高纤维素酶活性基因的研究进展[J]. 袁静, 李清明. 农产品加工(学刊). 2012
[9]. 未培养微生物中两个纤维素酶基因的克隆、鉴定及表达研究[D]. 辛盛. 湖南农业大学. 2013
[10]. 堆肥未培养微生物的宏基因组文库构建及新的木聚糖酶基因的克隆、鉴定和表达[D]. 张鹏. 广西大学. 2005
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