浙江大学医学院细胞生物研究所 310058
【摘要】目的 探究丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpina）亚群在情志阴虚“上火”候证中的表达水平及意义。方法 以ipT3（三碘甲状腺原氨酸）并叠加口腔牙龈炎模型建立情志型阴虚“上火”大鼠模型组，探究大鼠脏器变化及脏器指数，以iTRAQ-2DLC- MS/MS技术鉴定分析大鼠血清差异性蛋白。结果 模型组大鼠体态消瘦、体重减轻；脾、肾上腺重量增加，胸腺退缩。肝、脾、肾上腺脏器指数大于生理盐水组，胸腺指数明显小于生理盐水对照组。模型组血清Serpina3n、Serpin2c（M/C11.27）；Serpina1（M/C7.05）；Serpina3l、Spin2a（M/C 3.84）；Serpina10、Rasp1、Zpi（M/C 3.13）表达上调。结论 模型组大鼠脾、肾上腺重量增加，胸腺退缩，表明情志型阴虚“上火”是免疫紊乱的候证；Serpina1、Serpina3、Serpin3n亚基的表达上调，进一步表明情志型阴虚“上火”是免疫紊乱（免疫过度与免疫失活）并伴有炎症、TNF-α介导的细胞死亡特征的阴虚候证。Serpin亚群在情志阴虚“上火”表达也为情志阴虚“上火”候证诊断与治疗提供了蛋白组靶位生物学依据。
【关键词】情志；阴虚“上火”；免疫；Serpin亚群
[中图分类号] R432.2[文献标识码] A[文章编号]1672-5018（2016）04-111-02
以ipT3（三碘甲状腺原氨酸）处理SD大鼠建立情志阴虚模型，并在此基础上叠加口腔牙龈炎“上火”模型建立情志型阴虚“上火”SD大鼠模型组。微观辨证模型大鼠体征及脏器特征。用iTRAQ-2DLC- MS/MS蛋白组学技术与生物学信息分析手段探究Serpina（丝氨酸蛋白酶抑制剂）家族在情志型阴虚“上火”证候中的表达及意义。
1.材料与方法
1.1材料
三碘甲状腺原氨酸（T3），北京百灵威科技有限公司，批号：L840O63；牙髓卟啉单胞菌冷冻干菌粉，广东省微生物菌种保藏中心 批号：201505；戊巴比妥钠，中国医药上海化学试剂公司（进口分装），批号：020402；SPF级雌性SD啉单胞菌冷冻干菌粉，广东省微生物菌种保藏中心 批号：201505；戊巴比妥钠，中国医药上海化学试剂公司（进口分装），批号：020402；SPF级雌性SD大鼠，50只（浙江省医科院实验动物中心提供，生产批准文号：SCXK（浙）2014-0001；PL203电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LCMS-8030、Triple Quadrupole MS/MS，日本岛津制作所。
1.2方法
1.2.1动物分组及处理
本实验受浙江大学动物伦理委员会批准。
取5～6周龄，体重220～240 g SPF级雌性SD大鼠50只。称重，随机分成模型组、生理盐水组2组，每组25只。第2天根据设定开始分别药与0.9%NaCl2。模型组每天下午4点ip T3 500g/kg/d（50g %，0.2ml/100g）、生理盐水组分别ip 0.9%NaCl2，（0.2ml/ kg/d）。连续给药ip T36天。模型组给药第3天以丝线结扎下门齿，滴注牙髓卟啉单胞菌，叠加口腔牙龈炎模型，第7天，2%戊巴比妥钠（0.2ml/100g）ip麻醉，颈中动脉插管取血采样。
1.2.2血清样本制备
取2%戊巴比妥钠（0.2ml/100g）ip麻醉，颈中动脉插管取血，将血分别置于真空血清采血管，室温静置2小时，3000rbm/10min离心，提取血清，分装后，置于-80℃备用。
1.2.3脏器样本处理
动物颈椎脱臼处死后，用外科剪迅速打开腹腔取出胸腺、肝脏、脾脏、肾上腺，滤纸吸去血液，修除脂肪与系膜，千分之一电子天平称取其湿重，计算脏器指数。脏器指数公式：脏器指数=（脏器重量/大鼠体重）×100。
1.2.4牙龈炎建模[1]
取牙髓卟啉单胞菌冷冻干菌粉，接种于3ml厌氧培养液，37℃厌氧盒培养复苏5 天，分别提取1ml细菌培养液，分别置于3ml培养液的3试管，37℃厌氧盒培养3天。提取细菌培养液用无菌pbs（pH7.2）稀释至近似 3×10 8/ml置于厌氧培养箱，放入冰箱4℃备用。取大鼠，2%戊巴比妥钠（0.2ml/100g）ip麻醉，丝线结扎下门齿，剥离部分牙龈，滴注牙髓卟啉单胞菌200μl/次/天。
1.2.5 iTRAQ-2DLC- MS/MS蛋白组学技术筛选与生物信息学分析
iTRAQ-2DLC- MS/MS筛选鉴定分析血清差异性；GO、KEGG聚类分析血清差异性蛋白性质。iTRAQ标记按照iTRAQ试剂盒（Applied Biosystems，Foster city，CA，USA）说明书进行操作。蛋白质加入预冷的丙酮，-20摄氏度度沉淀1小时。12000rpm 离心15分钟，弃上清，用试剂盒中自带的溶解液dissolution buffer充分混悬溶解样品。加入还原试剂，60 ℃反应1小时。将还原的蛋白样品烷基化，胰蛋白酶37℃消化过夜，然后进行iTRAQ标记，对照组用118标记，模型组用119标记。标记后的混合肽段用强阳离子交换柱（SCX）进行分馏，然后用Q-STAR XL系统一级质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）分析。
1.2.6数据处理
SPSS10统计软件，t检验分析，（X±S）表示数据，P＜0.05表示显著性差异。单样本T检验用来检测正常组与模型组之间的差异，非参数分析用Mann–Whitney U-test检测。
2.0 结果
2.1 情志型阴虚“上火”大鼠体重与脏器重量变化
模型组大鼠体态消瘦体重明显减轻，与对照组比具有显著差异（P＜0.05；P＜0.001），大鼠体重减轻与 ipT3时间呈正比关系；模型组大鼠脾脏、肾上腺体重明显重于生理盐水对照组，组间差异显著（P＜0.05；P＜0.001），模型组大鼠胸腺轻于生理盐水对照组，组间差异显著（P＜0.001）（表1）。
2.2情志型阴虚“上火”组大鼠肝脏、脾脏、胸腺、肾上腺脏器指数变化
模型组大鼠胸腺指数小于生理盐水对照组，组间比较有显著性差异（P＜0.05）；肝、脾、肾上腺指数指大于生理盐水对照组，组间比较有显著差异。（P＜0.05/ P＜0.001）（表2）。
作者简介：毛连根 研究生学历；
通讯作者：*李继承 博导、教授，E-mail：lijichen@zju.edu.cn
基金项目：973项目“上火”的机理与防治研究；（编号：2014CB54300）
2.3情志型阴虚“上火”组大鼠血清Serpin亚群蛋白组表达分析结果
iTRAQ-2DLC- MS/MS筛选鉴定分析显示，模型组血清Serpin亚群表达上调，上调率分别是Serpina3n、Serpin2c（M/C 11.27）；Serpina1（M/C 7.05）；Serpina3l（M/C 3.84）、Spin2a（M/C 3.84）；Serpina10、Rasp1、Zpi（M/C 3.13）（表3）。
3.0讨论
情志是机体的精神状态，是人对客观外界事物和现象所做出的七种不同情绪反映[2]。情志状态与机体脏器有密切关系，情志不遂诱发阴虚“上火”，历代医家及相关研究均有论述[3] [4] [5]，中医临床也发现甲亢病人多汗、怕热、急躁、神经过敏、震颤、心输出量增加、心率加快等类似于阴虚的现象[6] [7]，以i pT3并叠加口腔牙龈炎模型建立情志阴虚“上火”大鼠模型[8]，观察模型组大鼠体征及脏器变化，用iTRAQ鉴定分析Serpina亚群表达水平。探究Serpina亚群表达水平在情志阴虚“上火”中的意义。
动物实验结果显示，模型组大鼠体态消瘦、体重减轻；脾、肾上腺重量增加，胸腺退缩。肝、脾、肾上腺脏器指数大于生理盐水组；胸腺指数小于生理盐水对照组。脾脏、胸腺均是免疫重要器官，这两器官的变化表明情志阴虚“上火”有免疫平衡的改变。iTRAQ鉴定分析显示，模型组大鼠血清Serpina3n、Spin2c（M/C 11.27）、Serpina1（M/C 7.05）；Serpina3l、Spin2a（M/C 3.84）； Serpina10、Rasp1、Zpi（M/C 3.13）表达显著上调。Serpina亚群是一类分布广泛的蛋白酶抑制剂超家族，在体内生理及病理过程中起重要的调节作用[9]。Serpina1在体内其可抑制TNF-α介导的细胞死亡、调节LPS诱导的促炎症因子及抗炎症因子的表达、Serpina3可抑制组织蛋白酶G、MMP-9等抑制过度免疫损害，Serpina3n也可以抑制颗粒酶B使宿主细胞介导的免疫反应失活[10][11]。模型组血清Serpinal、Serpina3、Serpin3n的表达上调，表明情志型阴虚“上火”存有炎症、免疫紊乱（免疫过度与免疫失活）、TNF-α介导的细胞死亡等特征。
Serpin亚群在情志阴虚“上火”候证中的表达为情志阴虚“上火”候证的诊断与治疗提供了蛋白组靶位生物学研究依据。
参考文献：
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论文作者:毛连根,江婷婷,刘昌铭,平泽朋,王冲,陈钟梁,李
论文发表刊物:《中西医结合护理》2016年第2卷第4期
论文发表时间:2016/8/4
标签：模型论文; 大鼠论文; 脏器论文; 生理盐水论文; 胸腺论文; 血清论文; 肾上腺论文; 《中西医结合护理》2016年第2卷第4期论文;