王征[1]2001年在《淋巴毒素缺失体在大肠杆菌中的融合表达及生物活性》文中进行了进一步梳理淋巴毒素α(简称LT)是活化的淋巴细胞产生的一种细胞因子，具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种重要的生物学功能。由于来源及制备的困难使对其的深入研究受到限制。随着分子生物学的发展，自80年代中期起，人们已经能通过基因工程的方法获得大量均一有活性的LT，从而大大推动了LT的基础和临床研究。 本研究通过构建表达N端缺失27个氨基酸的淋巴毒素融合蛋白的重组质粒，在大肠杆菌中实现融合蛋白的可溶及分泌表达，同时利用表达载体上的几种特殊序列经简单的分离纯化步骤直接获得大量的有生物活性的淋巴毒素缺失体LT△27，为寻找一种高抗肿瘤活性、低临床毒副作用的生物抗癌药物进行了有效的探索。 采用PCR的方法扩增出人淋巴毒素N端缺失27个氨基酸的缺失体基因片段，将此基因片段克隆至表达载体pET36b(+)上，与T7 lac启动子控制下的CBD Tag构建成表达融合蛋白的重组质粒pE736b-LT△27。插入片段测序正确的重组质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3)pLysS后，经IPTG诱导可表达一分子量为37kDa的新生蛋白条带。SDS-PAGE分析和Western杂交结果显示，此诱导表达的新生蛋白即为所需的融合蛋白CBD-LT△27。表达产物在细胞内外的精细定位研究表明，融合蛋白CBD-LT△27在经诱导的大肠杆菌中表达量占总菌体蛋白的20％以上，融合蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于细胞中，少量以可溶产物的形式存在于细胞质、分泌于细胞周质间腔及培养基中。这种以可溶形式表达N端缺失27个氨基酸的淋巴毒素CBD融合蛋白的研究国内外至今未见报道。 以低温超声破碎法，直接从破菌上清中获得可溶表达的融合蛋白进行纯化及测活工作，以避免包涵体形式表达于细胞中的蛋白质在变性和复性纯化的过程中得率低和易失活带来的不利影响。采用CBIND 100 Resin从破菌上清中快速纯化可溶的融合蛋白CBD-L7A27，洗脱下来的融合蛋白纯度可达80％以上。利用融合蛋白中目的蛋白LT△27与CBD Tag接头处的肠激酶特异性识别位点，用肠激酶处理粗纯化的融合蛋白，可将卜!的蛋自有效的从融合头上释放出来。运用NiZ+金属鳌合亲和层析柱进一步快速纯化去除融合头，上样流出经SDS一队GE分析和Western印迹分析ii1:明得到的纯化产物为淋巴毒素缺失体蛋白LT凸27，LT△2:产物纯度可达95%以上。 为确定经上述步骤纯化后得到的目的蛋自LT△27的生物活性，本研究以L929细胞为靶细胞、淋巴毒素国际标准品为参照，采用结晶紫染色法检测经淋巴毒素处理后存活的细胞，对淋巴毒素生物活性测定的细胞接种浓度、淋巴毒素标准品板上稀释的起始浓度和梯度稀释的倍数、放线菌素D的使用剂量等进行条件实验后，建立了人淋巴毒素生物活性测定方法。结果表明，L929细胞以1 .6士0.1 x 10“个/孔接种%孔板为宜，增敏剂AMD使用终剂量为lug/ml，淋巴毒素标准品板上稀释起始浓度为10 IU/ml、用2倍梯度系列稀释法进行连续稀释时能达到最好的量效关系。用R&D公司研制的thTNFp对建立的检测系统进行了可行性验证，测得的生物活性均在其产品标示范围内。用建立的淋巴毒素生物活性测定方法对上述纯化的淋巴毒素缺失体LT△27的生物活性进行检测，测得其比活为2一3xl口Iu/mg.ProO 纯化的淋巴毒素缺失体LT△27的生物活性与rhTNFp和淋巴毒素国标标准品的生物活性大致相当，表明LT经N端缺失27个氨基酸后仍能保持很高的体外肿瘤细胞毒活性。初步动物实验结果表明，纯化的LT△27在体内的抗肿瘤作用与淋巴毒素完整蛋白相当，但毒副作用却小得多。采用上述方法大量制备和纯化LT△27的过程简单，适合大规模生产，因此LT△27有望被开发成为一种高效低毒的抗肿瘤药物。
张巍[2]2003年在《抗人TNF-α单抗Z12识别的抗原表位研究及其人源化改造》文中研究表明本论文的创新点在于建立一种以计算机模拟结果为理论依据从而指导实验设计和操作的技术方法，使其作为一种有力的工具用于分析蛋白的结构-功能关系(如抗体识别的抗原表位)、合理的药物设计(如抗体的人源化改造)等研究。 以已有晶体结构的人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)，作为研究靶抗原。hTNF-α在许多疾病的生理和病理反应中都发挥关键作用，因而成为治疗这些疾病的有效靶分子。抗hTNF-α中和性单抗作为hTNF-α活性的阻断剂，已被用于治疗类风湿性关节炎、脓毒性休克和炎性肠病等疾病，在国际和国内都有广阔的发展前景。本室研制的小鼠抗hTNF-α单抗Z12，由于具有中和活性和较高亲和力，因而具有理论研究和实际应用意义。 抗原表位的确定和抗体的人源化改造是抗体研究工作的两个主要方面，利用计算机模型可为上述工作提供极大的帮助。首先钓取了Z12抗体的可变区基因，利用同源模建、分子对接等方法，模拟了Z12 Fv的叁维结构和抗原抗体复合物模型，由后者预测抗体识别的抗原表位；随后通过寻找抗原表位的实验研究，确定了Z12抗体结合hTNF-α的主要部位(hTNF-α141-146)，并证实了计算机模型是可靠的；在认为是可靠的计算机模型的基础上，对Z12抗体的可变区进行了合理的人源化设计(将VH骨架区中88位Ser突变为Ala，VL骨架区中17位Glu和18位Lys分别突变为Asp和Arg)；最后完成人源化抗体基因的克隆、表达，活性研究的结果表明人源化抗体很好地保持了亲本抗体的特异性和亲和活性。通过以上研究，一方面确定了Z12抗体识别的抗原表位，另一方面获得了有意义的人源化抗体，并申请了一项国内发明专利。 本研究中的Z12抗体可变区基因序列由本室获得，具有独立的知识产权；抗体的可变区序列、抗体识别的抗原表位以及人源化改造方法与已公开发表的抗体均有所不同。
杨芳[3]2009年在《抗肿瘤坏死因子-α人源性抗体的制备及功能研究》文中研究说明肿瘤坏死因子-α是一种具有多种生物学活性的多效性细胞因子,来源极广泛,主要包括脂肪细胞、激活的小胶质细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞。有活性的TNF-α分子量为17KD,以叁聚体形式与细胞表面的TNF受体(TNFR)结合,介导多种生物学活性。已知TNF-α是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子,但TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡,与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。在许多疾病,如心血管疾病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合征(MDS)等的病理生理过程中TNF-α起着重要的介质作用。临床上,抗TNF-α的治疗性抗体被成功用于治疗RA、Crohn’s病,同时研究表明其对牛皮癣和强直性脊髓炎也具有肯定的疗效。目前已有2种抗TNF-α的抗体被FDA批准用于治疗RA——Infliximab(Remicade)和Adalimumab(Humira)。另外,目前临床在研的多株抗TNF-α的中和抗体也取得良好的效果。人源性抗体在治疗中独具优势,被认为是治疗性抗体发展的最终方向。Humira作为第一个上市的全人源抗体,2008年年销售额就超过30亿美元。我国类风湿性患者众多,在我国研制具有自主知识产权的TNF-α人源性中和抗体具有重要的应用价值。本研究以原核表达的hTNF-α为抗原,利用本室构建的大容量全合成人源性抗体库进行筛选,获得两株特异性较好并且有一定细胞学活性的hTNF-α人源性中和抗体,为相关疾病的治疗研究奠定良好的基础。首先,原核系统表达纯化hTNF-α。表达质粒pBVTNF在大肠杆菌DH5α中经过42℃热诱导6小时后获得了hTNF-α可溶性表达,接着根据其理化性质即等电点PI5.6、分子量大小17KD、以及疏水性质采用离子交换、疏水层析、凝胶过滤叁种方案对其进行了纯化并获得纯品。以获得的表达纯化的TNF-α作为抗原,对库容量为1.35×1010的大容量人源噬菌体单链抗体库进行了特异性抗体的筛选。叁轮筛选后采用ELISA方法进行特异性抗体的鉴定,得到3株具有不同序列的单链抗体W18、G3-4、T12,并利用pel-SN表达载体实现了3株单链抗体在大肠杆菌中的分泌表达。pel-SN表达载体是本室在大肠杆菌可溶性表达载体PTIG-Trx的基础上进行改造后所得到的大肠杆菌分泌型表达载体,在原载体的基础上引入了pelB信号肽序列,并且引入了SfiI和NotI酶切位点,以方便从含单链抗体基因的噬菌体质粒直接克隆到分泌型表达载体中。对叁株抗体分泌表达产物进行特异性鉴定,W18保持了与噬菌体抗体相同的结合特异性,但T12丧失了与抗原结合的活性,G3-4改造为单链抗体后的结合特异性降低。蛋白质通过特定的叁维空间结构发挥其特殊生物活性。蛋白质的叁维结构信息对于了解蛋白质的折迭机理、酶催化活性、分子稳定性、蛋白质结构域之间的相互作用以及蛋白质分子与配基的相互作用等方面都是至关重要的。另外蛋白质的叁维结构信息也是分子设计研究、生命进化规律研究以及药物设计的基础,因此蛋白质叁维结构的研究非常重要。同源模建方法是蛋白质结构预测方法中应用得最多也是最成熟的方法,在蛋白质工程研究中已有广泛应用。同源模建方法的理论基础就是一级序列决定叁维结构,序列同源性高的蛋白质其叁维结构也应该相似。T11是本室从大容量抗体库中筛选出来的一株抗TNF-α突变体的特异性噬菌体抗体,该株抗体也能与野生型的TNF-α特异性结合,但转换为IgG型后其特异性下降。本实验中将抗天然TNF-α特异性抗体W18与T11抗体分别进行计算机同源模建,分析TNF-α参与与之相互作用的氨基酸位点以及抗体参与与抗原相互作用的氨基酸。结果显示,TNF-α参与与W18相互作用的关键氨基酸残基为65位、140-157位氨基酸段;而TNF-α参与与T11相互作用时关键氨基酸残基29-33位氨基酸残基、65位氨基酸、140-157位氨基酸位点。另外,分析抗体参与与TNF-α相互作用时,研究结果初步表明可能W18的轻链较T11的轻链在参与抗原抗体反应中作用的原子更多,而T11的重链较W18的重链在参与与抗原抗体反应中作用的原子更多。根据以上实验数据我们将W18的轻链与T11的重链进行了重新组合得到一株新的组合抗体即W1hT11,对其分别在单链和全抗水平进行了特异性分析,结果表明该株抗体的特异性较好。将得到的两株抗体W18、W1hT11改造为全抗体形式,在FreeStyleTM细胞中获得了瞬时表达。W18、W1hT11全抗体保持了与TNF-α特异性结合的活性。采用非竞争酶联吸附实验测定了W1hT11、W18全抗体与抗原的亲和常数KD分别为4.3×10-8M和7.5×10-8M。为了分析W18、W1hT11与抗原的结合表位,根据计算机同源模建的结果设计并构建了4个TNF-α突变体即65位突变为甘氨酸突变体、84-91位缺失突变体、140-157位缺失突变体以及84-91位与140-157位同时缺失突变体,实现了这4个突变体在大肠杆菌DH5α中的表达。利用western-blot检测了W18、W1hT11单克隆抗体与各突变体的结合情况。初步实验结果表明,W1hT11识别的抗原表位可能位于140-157位与84-91位,W18识别的抗原表位可能位于65位与84-91位。利用TNF-α杀伤L929细胞活性实验检测W18、W1hT11的体外中和活性,结果表明,W18、W1hT11均能一定程度上拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用。W1hT11这株抗体在浓度为80ug/ml时对TNF-α细胞毒的中和率达到90.85%,随着其浓度的下降中和率降低,到50ug/ml时对TNF-α细胞毒的中和率为43.94%;W18这株抗体的中和率相对低一些,在浓度为80ug/ml时中和率为79.58%,随着其浓度的降低对TNF-α细胞毒的中和率也呈相应的下降趋势,到50ug/ml时对TNF-α细胞毒的中和率为36.86%。本研究从大容量全合成人噬菌体抗体库中共获得了2株具有体外中和活性的抗肿瘤坏死因子-α的人源单克隆抗体W18、W1hT11,为下一步深入研究研制肿瘤坏死因子-α中和抗体药物奠定了良好的基础。
参考文献：
[1]. 淋巴毒素缺失体在大肠杆菌中的融合表达及生物活性[D]. 王征. 华中农业大学. 2001
[2]. 抗人TNF-α单抗Z12识别的抗原表位研究及其人源化改造[D]. 张巍. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[3]. 抗肿瘤坏死因子-α人源性抗体的制备及功能研究[D]. 杨芳. 中国人民解放军军事医学科学院. 2009
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