李昀辉[1]2004年在《草原龙胆生物学特性及遗传研究》文中研究指明一、本研究在探讨草原龙胆生物学特性过程中进行了如下研究：采取不同的播种时间比较植株生长的差异；利用光学显微镜观察营养器官及繁殖器官的结构；利用石蜡切片法研究了花芽分化过程以及大孢子的发生、胚和胚乳的发育过程，并且根据花蕾生长数据分析了花的生长趋势；利用荧光显微法观察了在柱头上的花粉萌发情况；采用不同的光照、水分、温度等条件观察了种子的萌发与植物的生长特性。 对生物学特性研究的主要结果如下：北方地区播种时间选择在11月到12月份比较适宜；主枝与侧枝花蕾直径的发育进程呈现出S型的变化趋势，主枝与侧枝花蕾直径与花蕾长度发育的对应关系都经过较快的前期生长及平稳的后期生长过程；单瓣花和重瓣花花芽分化过程均可分为萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期5个时期，其重瓣类型属于花冠重复类型；雌配子体发育属于蓼型，成熟种子的胚大部分发育到心形胚时期；种子处理采用48小时的浸种，提高萌发率最高；在有光照的条件下，20～25℃是种子萌发的适宜温度，萌发率和萌发势均较高，且幼苗后期生长健壮。 二、本研究在探讨草原龙胆的花色及花型遗传特性研究结果如下： 1 根据对花瓣中所含的色素种类进行测定的吸收峰可以初步确定，紫色所含色素可能由花青素构成；白色花瓣中可能存在类黄酮；红色花有两个吸收峰，可能由类黄酮和花青素两种色素，绿色花可能含有以叶绿素为主的色素类群。 2 利用常规的染色体制片方法，选择根尖以及长度为7mm-8mm的花苞中的花药进行有丝分裂和减数分裂过程的观察，并且观察到草原龙胆的染色体为72条。 3 利用全轮配模型初步探讨了草原龙胆的花色遗传特性，从后代表现可以初步看出，同一色系不同品系间杂交，后代表现亲本的花色；紫色具有明显的显性性状；其他花色之间进行杂交，后代颜色趋于父母本的中间色偏颜色较深的亲本。 4 根据现有草原龙胆品系中花型具有明显特征的四个品系(钟状、漏斗状、杯状和平状)，建立叁步花型比较模型，逐步进行筛选，以确定未知种类的花型类型。 5 通过杂交的手段初步研究了四种花型之间的遗传特性，根据杂交结果可以初步看出，无论正反交，钟状与漏斗状品系的杂交后代都表现漏斗状；钟状与平状杂交后代花型表现为钟状，杯状与平状杂交后代花型表现为杯状。
王卅[2]2013年在《草原龙胆花瓣质感相关基因EgMIXTA的初步研究》文中认为草原龙胆(Eustoma grandiflorum)为龙胆科(Gentianaceae)草原龙胆属(gentian)被子植物,其呈圆锥形花序排列的花瓣表面具有天鹅绒质感,拥有较高的观赏价值。这种天鹅绒质感来源于花瓣表面锥形细胞的形状特征和光学特性,花瓣表面细胞的锥形化受MIXTA家族基因的表达调控。锥形细胞的存在改变了花瓣表面生物学特性,通过影响花瓣表面质地、颜色、光泽、湿度、温度和挥发性等物理特征建立对授粉昆虫的吸引和选择优势,为自身种质繁衍创造优越条件。本实验的目的是以草原龙胆试验品系的花瓣的天鹅绒质感特性为出发点,借鉴已有报道的具有天鹅绒质感的金鱼草花瓣中MIXTA基因调控花瓣锥形表皮细胞生长的功能及其在烟草中遗传转化对烟草叶片表皮细胞锥形化的作用,利用生物信息学手段分析已有其他物种中的MIXTA基因序列,通过在分子水平克隆并检测含有天鹅绒质感的草原龙胆中MIXTA基因的存在形式,探寻并调节MIXTA基因的表达模式,验证MIXTA蛋白在真核植物中的功能,在一定程度上达到改变草原龙胆花瓣表皮细胞形状和花瓣天鹅绒质感的效果,为进一步利用锥形细胞的生长调控来创造天鹅绒质感特性,改良被子植物花瓣表型特性、提高观赏价值奠定基础。本研究的主要结果如下:1.以东北林业大学花卉工程研究所培育的具有天鹅绒质感的'2003-2-2'号草原龙胆植株及一种非天鹅绒质感花瓣植株作为试验材料,利用扫描电子显微镜对试验材料切片进行观察并照相,前者花瓣发育不同时期的表皮细胞呈现不同程度的锥形化,完全开放花瓣程度最高,叶片及非天鹅绒质感的花瓣为扁平的表皮细胞。2.通过利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)从含天鹅绒质感的草原龙胆花瓣中克隆获得的MIXTA基因共有两种序列信息:EgMIXTA1和EgMIXTA23,序列全长分别为1128 bp和1134 bp,它们的3'末端高度保守,由Blastn比对得知两基因与金鱼草中AmMIXTA-like2的同源性高达86%;生物信息学分析得到两基因的开放阅读框分别编码375个和377个氨基酸,均含有两个保守的SANT结构域,属于R2R3型MYB类的转录因子;两基因的氨基酸序列与金鱼草中的AmMYBML3具有82%的同源性;进化树分析表明两基因与矮牵牛的MYB类基因在进化关系上最为相近。3.基于获得的MIXTA基因信息,采用Southern Blotting的方法检测MIXTA基因在'2003-2-2'号草原龙胆中的拷贝数量,获得叁个杂交条带即为有叁组基因拷贝;利用'2003-2-2'号草原龙胆的基因组DNA为模板,克隆MIXTA基因共得到两种基因序列信息,分别命名为EgMIXTAD3和EgMIXTAD5,去除内含子后与EgMIXTA1、EgMIXTA23和EgMIXTA41进行相似性比对,结果EgMIXTAD5和EgMIXTA23基因的序列完全一致,同时EgMIXTAD3和EgMIXTA41的氨基酸序列信息完全一致,从而初步确定了EgMIXTA1、EgMIXTA23/EgMIXTAD5和EgMIXTA41/EgMIXTAD3这叁种拷贝的序列信息。4.构建MIXTA基因的原核表达载体pGEX-EgMIXTA1和pGEX-EgMIXTA23,转化BL21(DE3)表达菌株,诱导EgMIXTAl和EgMIXTA23蛋白表达,均在约67 KDa处获得高丰度表达条带,并成功进行了 GST-EgMIXTA融合蛋白的纯化,由此验证了其在低等生物中的表达可行性;取'2003-2-2'号草原龙胆四个发育时期的花瓣为实验材料进行Real-time PCR检测,EgMIXTA基因在花蕾中表达量较高,在开放的花瓣中表达量较低,且在叶子中也有一定程度的表达。5.利用Gateway技术构建EgMIXTA1和EgMIXTA23两基因的植物过表达和干涉载体,分别为pH7WG2D-EgMIXTA和pK7GWIWG2D-EgMIXTA,通过农杆菌介导法分别对'2003-2-2'号草原龙胆进行遗传转化,对阳性转化再生植株花瓣进行PCR分子鉴定。
张坤[3]2007年在《草原龙胆耐盐相关基因群的表达分析》文中研究指明草原龙胆(Eustoma grandiflorum)属龙胆科草本植物，是优良的鲜切花材料，它具有一定的耐盐性，在pH9盐碱地中，植株仍然可以完成生活史。本试验的目的是通过抑制消减杂交技术结合cDNA芯片技术分离草原龙胆盐胁迫诱导基因及耐盐相关基因群。抑制消减文库采用盐处理1 h、3 h、6 h条件下草原龙胆等量混合的mRNA做为tester，未处理条件下草原龙胆的mRNA做为driver。将抑制消减杂交第2次PCR的产物连接至pGEM-T载体中，随后转化到JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选、培养后提取质粒DNA。应用测序试剂盒(Amersham)进行质粒DNA测序PCR反应，产物经纯化后在MegaBACE 500测序仪上测序。得出的序列经SeqClust2.1软件去除冗余。结果共得到1153条200bp以上的序列，平均长度为375bp，去除载体和冗余序列，得到658条非重复序列。文库的冗余度为42.9％。将得到的658条序列进行GO分类，在生物学途径中分为有丝分裂检查点、类泛素化蛋白修饰、氧化胁迫反应、转运、电子传递等14类；分子功能中分为过氧化氢酶活性、催化活性、环氧化物酶活性、单氧化酶活性、谷胱甘肽脱氢酶活性等21类；在细胞组件中分为线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞核等10类。以“primer 1”和“primer 2R”为引物，通过PCR的方法将以上获得的658个非重复基因片段从文库的质粒克隆中扩增出来用于芯片的制作。分别用Cy3、Cy5荧光染料标记盐处理和未处理草原龙胆的mRNA，按照3DNA Array900~(?)试剂盒(Genisphere Inc．)的使用说明完成芯片杂交。用ScanArray 4000~(?)芯片扫描仪扫描芯片。通过limma软件包分析，结果显示，显着上调表达的基因为14条，显着下调的基因为16条。其中功能已知的序列为5条，分别为硫氧还蛋白、类泛素化蛋白、缩氨酸转运蛋白、脱氢抗坏血酸还原酶、细胞色素P450。
吴佳岩[4]2017年在《草原龙胆EgMIXTA1转录因子功能的研究》文中研究表明本研究以东北林业大学生命科学学院培育的草原龙胆转基因及野生型组培幼苗作为试验材料基础,结合目前在模式植物和非模式植物中MIXTA及MIXTA-like转录因子的相关研究报道,利用分子生物学、生物信息学及转录组测序(RNA-seq)相关技术预测并分析EgMIXTA1转录因子的目标靶基因,从而研究EgMIXTA1转录因子的调控功能。本研究不仅有利于实现对草原龙胆抗逆分子机制的深入了解,改良草原龙胆鲜切花的品种,获得观赏性更强的植株,而且为今后其他研究R2R3 MYB Sub 9家族基因的分子调控机制提供了理论基础。本论文研究的主要结果如下:1.利用实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)、扫描电子显微镜观察(SEM)、蛋白质免疫印迹试验(Western blot)、失水率测定(Water loss rate)、亚细胞定位(Subcellular localization)试验方法,对原有的草原龙胆转基因植株进一步确定。定量结果表明:在EgMIXTA1过表达转基因植株中,EgMIXTA1的表达量明显比野生型表达量高;扫描电镜结果显示:过表达转基因植株叶片表达表皮蜡质较野生型相比明显增多,表明EgMIXTA1转录因子可以调控草原龙胆叶片表皮蜡质的合成;Western blot结果显示,在草原龙胆过表达转基因植株中EgMIXTA1蛋白的表达量也比野生型中的表达量高;对其过表达转基因植株及野生型植株叶片进行失水率测定,结果发现过表达植株因叶片表皮蜡质的增厚,其失水率明显低于野生型,推测表皮蜡质对草原龙胆具备保水功能;同时,利用洋葱表皮细胞亚细胞定位法对EgMIXTA1进行定位,研究发现EgMIXTA1主要定位于细胞膜和细胞核上。2.利用生物信息学技术,构建EgMIXTA1的系统进化树,结果显示EgMIXTA1与矮牵牛的MYB类基因在进化关系上最相近,另外与其他种属的MIXTA-like关系较近,如唇形金鱼草Anarrhinum bellidifolium(AbMIXTA-like3)、金鱼草Antirrhinum majus(AmMYBML3)等;利用基因组数据库比对,确定Eg1g77670,Eg3g50800,Eg4g20960,Eg2g26250-KCS10,Eg5g52510-SCL8,KCS1,KCS2等10个目标靶基因,对上述基因进行定量分析,结果显示:除Eg5g52510-SCL8在EgMIXTA1过表达转基因植株中表达量有所下调外,其余均是表达量上调。3.利用RNA-seq技术,对草原龙胆野生型及EgMIXTA1过表达转基因植株叶片的转录组进行测序分析。通过比较EgMIXTA1转基因植株和野生型植株转录物序列,获得差异表达基因。初步确定,在EgMIXTA1过表达型转基因植株中有504条差异表达序列,其中有232条序列表达量上调,272条序列表达量下调;结合测序结果样品之间的相关性以及差异表达基因在各数据库的功能注释结果,从所得到的差异基因中选取20个与EgMIXTA1转录因子功能相关的基因进行定量分析,基因ID分别为c87990,c80418,c72766,c83250,c65763,c27131,c54864,c80265,c32894,c71819,c35983,c80696,c90308,c82147,c66358,c80916,c29911,c72094,c79034,c89150,定量结果与RNA-seq结果除c80696外均为一致。综上所述,通过生物信息学及转录组测序(RNA-seq)技术,初步预测获得目标靶基因30个,这些基因参与调控的功能概括为:参与植物表皮细胞形态学发育(Eg1g77670,Eg3g50800,Eg4g20960,Eg2g26250-KCS10,Eg5g52510-SCL8);对激素信号、光信号作出响应(c87990(ABR1-like),c80418(PRE6-like),c54864(PINOID2),c80265(PID2),c82147(GH3.1),c66358,c80916(SAUR71),c72094(OPR7));对生物和非生物胁迫作出响应(c35983(HSC80),c89150(MDH));参与植物体细胞的生长和凋亡周期(c65763(fabB),c32894,c71819,c80696(UPTG2),c90308(Clp1),c29911(ST3),c79034(XTH));参与表皮蜡质主要成分长链脂肪酸的合成及脂质类物质的合成,包括KCS1,KCS2(c83250),KCS9,CER10,KCS20,c72766(CER3),c27131(SBH1)共7个基因。
孟欣欣[5]2005年在《草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究》文中研究表明草原龙胆(Eustoma Gradiflorum)属龙胆科一、二年生草本植物,原产于美洲中部地区,直到近20年草原龙胆才迅速发展起来。它具有色彩丰富,花朵美丽,花期长等特点,作为切花新秀,越来越受到人们的喜爱,世界年销售额1.1亿美元,列切花排名第七位。但草原龙胆种子细小,育苗困难,所以建立其快速繁殖体系使其充分满足市场的需要具有重要意义;同时由于常规育种的诸多弊端使得通过基因工程方法选育新品种成为必然的趋势。根据草原龙胆喜湿润不耐干旱的特点,本实验选择转入抗旱及抗盐碱基因,使其具有更强的抗逆性,对提高其逆境中的成活率有较大的意义。 本文以草原龙胆不同部位作为外植体,通过对基本培养基类型,激素种类及浓度,环境因素等方面的调控,对草原龙胆快速繁殖体系的建立做了较为细致的研究。同时本论文还利用β-葡萄糖甘酸酶(Gus)基因的瞬时表达和稳定表达的蓝斑数对农杆菌转化草原龙胆植株的愈伤组织的影响因素进行研究。比较分析后建立其较为适合的转化条件。通过用带有抗旱基因和抗盐碱基因的根癌农杆菌转化草原龙胆愈伤组织,并分化出植株。PCR检测初步证明抗旱基因已整合到草原龙胆植株中。试验中获得的研究成果主要有以下几个方面: 1、对灭菌效果进行比较发现:70%酒精浸泡30s后,用0.1%Hgcl_2浸泡10分钟可达到最佳的灭菌效果,无污染率达到100%,死亡率为2%,根据部位的幼嫩程度可适当调整。 2、研究草原龙胆以茎段为外植体的丛生芽的诱导与增殖情况后发现,当基本培养基为MB(MS大量+B5微量+B5有机+Fe盐),激素种类和浓度分别为:IBA2.0mg/L,6-BA0.5mg/L,GA2.0mg/L时,丛生芽的诱导率、分蘖率最高。 3、研究不同激素6-BA、KT、NAA、IBA不同浓度组合对草原龙胆愈伤组织发生的影响。比较法现:不同种类和浓度的激素组合大部分能使外植体脱分化,产生不同质地的愈伤组织,但当BA的浓度为1.0mg/L时,形成的愈伤组织有一半成水浸状,玻璃化较为严重,当其浓度减至0.5mg/L时现象消除。 4、研究不同培养基MS、N6和不同激素NAA、2,4-D组合对草原龙胆愈伤组织继代效果的影响。结果发现,不同处理愈伤组织褐化率都较低,可正常生长,当选用MS培养基,2,4-D浓度为0.5mg/L,NAA浓度为零时,愈伤组织为淡黄色,质地较松软,增重最快。 5、不同激素6-BA、NAA、KT组合对愈伤组织分化的影响结果表明:以MS为基本培养基,6-BA与KT单独以0.5mg/L浓度使用时,其分化出的苗正常、叶片浓绿、肥大,而当
龙茹[6]2008年在《草原龙胆C/D类MADS-box基因克隆与表达分析》文中研究说明花器官发育的ABC模型的扩展与修饰说明植物MADS-box基因家族在花发育进程中具有重要调节功能,经过基因重复、功能分化、互作网络精调而导致被子植物花形态的多样性。从单一模式植物转向多种植物联合分析,通过比较研究,将有助于阐释花部性状发育及其多样性的分子机制。草原龙胆(Eustoma grandiflorum)为龙胆科(Gentianceae)草原龙胆属(gentian)草本观赏植物,既具有单瓣花又有重瓣花,重瓣花的四轮花器官发育正常且雄蕊数目稳定,这与重瓣花多存在雄蕊瓣化的现象不同。为探讨草原龙胆花器官发育的分子机理,针对C/D类MADS-box基因开展了以下几方面的研究:1.C/D类MADS-box基因的克隆以草原龙胆不同发育阶段的混合花芽RNA为模板,用基因特异性引物,分别利用3'-RACE和RT-PCR技术,克隆了C功能基因EgPLE1和D功能基因EgMADS1。两类基因的C末端均具有保守的AG基序Ⅰ和AG基序Ⅱ,属于AG-like亚家族。Southern杂交结果显示,EgPLE基因在基因组中可能有多个拷贝,EgMADS1基因在基因组中可能有4个拷贝。2.D类MADS-box基因的表达分析用Northern杂交技术分析了EgMADS1基因的器官特异性表达情况。结果表明,该基因仅在雌蕊、胚珠表达。3.EgMADS1基因遗传转化载体的构建为深入开展EgMADS1基因的功能研究,用Gateway技术成功构建该基因的过量表达载体和RNAi载体,转化LBA4404菌株农杆菌,用叶盘法对烟草进行农杆菌介导的遗传转化。
王秋红[7]2011年在《草原龙胆生殖生物学及其差异蛋白质组学的研究》文中研究表明草原龙胆(Eustoma grandiflorum)属于龙胆科草原龙胆属,是鲜切花中的特优种类,具有极高的观赏特性。通过草原龙胆生殖过程中发育规律及分子机制的研究,不仅能为育种实践提供理论依据,而且对高等植物生殖生物学的研究具有重要的意义。本文通过对草原龙胆花蕾、花柱及子房的观察与统计,分析在有性生殖过程中的形态特征；建立大小孢子发生及雌雄配子体发育过程中外部形态特征与内部发育阶段之间的关系；统计了受精作用各个发育阶段的时间间隔期。此外,针对于生殖过程中几个主要发育阶段,进行了蛋白质组的差异表达研究,分析草原龙胆生殖过程中蛋白质表达的情况并鉴定了差异表达的蛋白质。1、草原龙胆生殖生物学的特征研究结果如下：1)大小孢子发生及雌雄配子体的发育(1)花药壁的发育属于双子叶型。异型腺质绒毡层。(2)小孢子母细胞减数分裂过程中的胞质分裂属于同时型。四分体的排列成正四面体型或左右对称型。成熟花粉是二细胞型的,具有叁条萌发沟。(3)子房二心皮一室,倒生型胚珠,多胚珠,侧膜胎座。薄珠心、单珠被。大孢子母细胞由珠心表皮下的孢原细胞直接分化而来。减数分裂后形成线形或T型排列的四个大孢子。合点端的大孢子行使功能大孢子的功能。两个极核在受精之前融合为次生核。成熟胚囊是七细胞七核。蓼型胚囊。(4)在同一个胚珠中发现有双胚囊或双大孢子母细胞等现象,但这种现象发生的几率很小。(5)统计了花蕾及子房的长度与其内部发育阶段的对应关系。2)受精作用及胚和胚乳的发育(1)草原龙胆为湿型柱头。闭合型花柱,花柱中有引导组织。(2)人工授粉后4小时,花粉管在柱头表面萌发；授粉后8小时,花粉管进入花柱。授粉后24小时,生殖细胞分裂形成两个精子。(3)授粉后48小时,花粉管进入子房。通过退化的助细胞进入胚囊,在珠孔端释两个精子。在1%的胚囊中两个助细胞均退化,不只2条花粉管进入胚囊。(4)授粉后60小时,另一个精核贴附在次生核的核膜上,随后与之融合。授粉后72小时,初生胚乳核形成。草原龙胆胚乳的发育属于核型。初生胚乳核没有休眠期。胚乳的细胞化过程从中央细胞细胞壁的附近,向逐步细胞中央推进。(5)授粉后72小时,精核进入卵细胞。授粉后4-5天,合子形成。合子的休眠期为15天左右。授粉后20天左右,合子分裂为2细胞原胚。(6)精核与次生核的融合比精卵的融合速度快。(7)双受精过程属于有丝分裂前配子融合类型。2、草原龙胆生殖过程中蛋白质组的差异研究的结果如下：利用2D-DIGE的技术体系研究了草原龙胆有性生殖过程中特定阶段的差异蛋白质,具体包括孢原、小孢子母细胞、成熟的花粉和胚囊、及受精后精子进入退化助细胞、核融合、合子形成等几个阶段。选择了小孢子母细胞和孢原、以及成熟花粉与小孢子母细胞阶段的差异蛋白质进行了质谱分析及比较,得到可信度达到90%以上的蛋白质30个。其中腺苷高半胱氨酸水解酶(Adenosylhomocysteinase)、5-甲基四氢蝶酰叁谷氨酸高半胱氨酸甲基转移酶(5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase)、推测的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(putative S-adenosylmethioninesynthetase)这叁种蛋白都参与了与甲基转移相关的反应,由此可以推测与甲基转移相关的反应,如DNA的甲基化等,对草原龙胆从孢原到成熟花粉的整个发育阶段起到了定程度的调控作用。另外,与花色素合成相关的蛋白——黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase)也存在于这个发育阶段。还发现了参与叶绿体中光合作用的蛋自质,如光系统Ⅱ放氧复合体(oxygen evolving complex)、果糖二磷酸醛缩酶1(fructose-bisphosphate aldolase 1, chloroplastic)及核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase, large subunit),在成熟花粉阶段表达量升高,可推测在这一时期光合作用较强。鉴定出来的其他蛋白质还参与了基础代谢、防御胁迫、DNA代谢、细胞循环、转录、蛋白质合成、氧化代谢、糖酵解等代谢过程。这些都为揭示基因对草原龙胆生殖过程的调控机制提供了参考。
王继刚[8]2008年在《草原龙胆抗盐相关基因表达谱分析及BADH基因的遗传转化》文中研究指明草原龙胆(Eustoma grandiflorum)属龙胆科草本植物,是流行的鲜切花材料,具有一定的耐盐性,是一种具有重要经济价值的研究材料。为了研究草原龙胆的抗盐机理,分离抗盐相关基因,提高其抗盐水平,进行了以下叁方面的研究:1草原龙胆盐抗性相关基因的筛选为了分离草原龙胆盐抗性相关基因,以NaCl 400 mmol/L处理的草原龙胆叶片为tester,清水处理的对照为driver,制作了盐胁迫抑制差减(SSH)文库。经过序列测定以及序列分析,获得了658条非重复序列。通过GO(Gene Ontology)的分子功能、生物学途径及细胞组件叁方面的分析,获得了123条序列的注释,占总序列的19%。在生物学途径中分为:有丝分裂检查点、类泛素化蛋白修饰、氧化胁迫反应、转运、电子传递等14类;分子功能中分为过氧化氢酶活性、催化活性、环氧化物酶活性、单氧化酶活性、谷胱甘肽脱氢酶活性等21类;在细胞组件中分为线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞核等10类。2草原龙胆盐胁迫基因表达分析为了研究草原龙胆在盐胁迫条件下的基因表达谱,以构建的SSH文库制作了基因芯片。提取NaCl 600 mmol/L处理3 h草原龙胆的叶片以及清水处理的对照mRNA,经反转录后分别进行了Cy3和Cy5的标记,进行了芯片杂交。杂交数据利用limma软件包进行了数据标准化,分析获得了差异表达基因。结果显示,显着上调表达的基因为14条,显着下调的基因为16条。其中功能已知的序列为5条,分别为硫氧还蛋白、类泛素化蛋白、苏氨酸转运蛋白、脱氢抗坏血酸还原酶、细胞色素P450。3草原龙胆BADH基因的遗传转化为了提高草原龙胆的盐抗性,对草原龙胆进行了BADH基因的遗传转化。从拟南芥中克隆了BADH基因的编码区全长,经过测序验证正确后,将其构建到了植物表达载体pH2GW7,0上。表达载体转化农杆菌LBA4404后制备了农杆菌侵染菌株。通过农杆菌介导法转化草原龙胆,获得了1个转化株系。PCR和Southern杂交检测表明,目的基因已经整合到了草原龙胆基因组中。
张旸[9]2003年在《激光和高压静电场克服植物自交不亲和性和远缘杂交不亲和性的研究》文中研究指明本研究是以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)和草原龙胆(Eustoma grandiflorum)的自交不亲和系，及黑芥(Brassica nigra)和白菜(Brassica campestris)为试材。利用激光和高压静电场对试材的花粉进行处理，以期克服自交不亲和性和远缘杂交不亲和性。通过对处理后的花粉的表面结构和蛋白酶活性、及其在柱头上的萌发情况的研究，进一步分析激光和高压静电场的生物效应。利用Northern杂交技术和双向电泳技术，检测了经激光和高压静电场处理的花粉，在授粉后柱头上SLG和SRK基因表达的差异和蛋白质图谱的差异，以探讨激光和高压静电场对生殖反应的作用机制。通过上述实验得到如下结论： 1、通过适宜剂量的激光和高压静电场处理，羽衣甘蓝和草原龙胆的花粉萌发率提高，自交亲和指数和结籽率提高；同时自交后代植株的生长势也有较大改善，幼苗健壮，测定植株的生物量也显着提高。 2、从花粉的表面结构的电镜显微观察分析，通过激光和高压静电场处理后的花粉，其花粉壁的雕纹受到了伤害，网脊线有些断裂，网眼变大，花粉管原始体变长，并且成熟花药的水溶性总蛋白，α-淀粉酶活力，总淀粉酶活力均不同程度的提高。 3、经激光和高压静电场处理的花粉自交后，取不同时间间隔的柱头样品提取总RNA，利用Northern杂交技术对SLG和SRK基因的表达量进行检测。结果表明，授粉后8小时，激光和高压静电场处理与对照之间SLG和SRK基因的表达量无明显差异。授粉后24小时激光处理的SLG和SRK基因的表达量比对照明显降低，但高压静电场处理与对照无明显差异。 4、未授粉柱头的蛋白质点明显多于授粉后柱头的蛋白质点；授粉后一些碱性端的蛋白点消失，同时一些小分子量的蛋白点减少。用激光处理后的花粉与对照花粉在授粉后8和24小时进行比较，在处理与对照之间找到了特异蛋白点。
孙晶[10]2012年在《利用RNA干扰技术抑制洋桔梗ACC合酶基因表达的研究》文中指出洋桔梗(Eustoma grandiflorum),又名草原龙胆,为龙胆科草原龙胆属观赏植物,是目前国际上十分流行的盆花和切花种类之一,具有较高的经济价值和观赏价值。花卉的观赏寿命,特别是切花的瓶插寿命是直接影响花卉商品价值的一个极其重要的品质特征。如何使花卉延缓衰老,延长保鲜期,一直是国内外相关方面关注的重要问题。本研究以洋桔梗'Double Mariachi Pink'品种为试验材料,在洋桔梗高频再生体系和高效稳定的遗传转化体系建立的基础上,通过农杆菌介导的叶盘转化法将重组子pCAMBIA1301-gfp-(GUS+ACS)i-NPTⅡ转入洋桔梗基因组中,以期培育出瓶插寿命更长的洋桔梗新种质。叶盘转化法条件为：经预培养3d的洋桔梗叶片,用农杆菌重悬液(浓度为OD600≈0.5)浸泡10min,再于24℃黑暗条件下共培养5d,然后转入筛选培养基中选择培养抗性苗。对抗性再生植株进行了分子生物学鉴定。65株再生抗性苗经选择生根培养有46株生根,生根率为70.6%;46株健康的生根植株,对其进行PCR鉴定,得到11个PCR阳性株系；11个PCR阳性株系经RT-PCR鉴定得到3株阳性植株；对3株阳性植株进行GFP荧光观察,其中2株GFP荧光观察呈阳性；并提取该3株转基因洋桔梗的蛋白质,利用SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳法检测出gfp基因在3株RT-PCR呈阳性的洋桔梗植株中得到表达。本实验还对洋桔梗组培苗出瓶、炼苗、移栽、花期进行研究,探究组培苗根的条数对成活率的影响。结果显示,根数小于6条的组培苗,出瓶后的适应能力较差。根数目为6条以上的组培苗,根生长能力较强,有利于驯化成活。花期统计结果表明,空白洋桔梗的花期为10d,转化反义ACS基因的洋桔梗平均花期为24d,转化干扰ACSi基因的洋桔梗的花期为27d。转化干扰ACSi基因的洋桔梗花期比空白组显着延长17d,延长了洋桔梗植株的观赏周期。
参考文献：
[1]. 草原龙胆生物学特性及遗传研究[D]. 李昀辉. 东北林业大学. 2004
[2]. 草原龙胆花瓣质感相关基因EgMIXTA的初步研究[D]. 王卅. 东北林业大学. 2013
[3]. 草原龙胆耐盐相关基因群的表达分析[D]. 张坤. 东北林业大学. 2007
[4]. 草原龙胆EgMIXTA1转录因子功能的研究[D]. 吴佳岩. 东北林业大学. 2017
[5]. 草原龙胆快速繁殖体系建立及转基因研究[D]. 孟欣欣. 吉林农业大学. 2005
[6]. 草原龙胆C/D类MADS-box基因克隆与表达分析[D]. 龙茹. 东北林业大学. 2008
[7]. 草原龙胆生殖生物学及其差异蛋白质组学的研究[D]. 王秋红. 东北林业大学. 2011
[8]. 草原龙胆抗盐相关基因表达谱分析及BADH基因的遗传转化[D]. 王继刚. 东北林业大学. 2008
[9]. 激光和高压静电场克服植物自交不亲和性和远缘杂交不亲和性的研究[D]. 张旸. 东北林业大学. 2003
[10]. 利用RNA干扰技术抑制洋桔梗ACC合酶基因表达的研究[D]. 孙晶. 南京师范大学. 2012