李兰 (四川省新津县人民医院 611430)
【摘要】建立了实用的肌酐酶法测定方法,通过实验将比色测定终点法改为两点法,使其适合自动分析，并节省工具酶。本法的线性为0～2749 Μmmol/L，精密度：手工操作，批内CV<3%,总CV<5%。三种分析仪的批内CV在0.34%～1.44%间，回收率99.66%～100.9%。本法(Y)和BM的试剂(X)比较：Y=0.973X+10.33 Μmol/L,r=0.9995。
【关键词】肌酐 酶法 两点法
【中图分类号】R446 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2013）35-0355-02
酶法测定肌酐目前已报告的有四条途径[1～5]，其中三种为紫外测定，一种为比色测定。相比之下比色测定具有更多优越性，商品试剂盒多采用此法。但Fossati原法[1，2]的反应时间较长，且要做一血清空白以除去血清中肌酸的干扰，因此不适合自动分析。自动分析一般总反应时间为10分钟，为了除去肌酸的干扰必须采用两步法，反应要求5分钟内达到终点。据我们实验，必须将几种工具酶的用量增加到Fossati原法的5～10倍。在实验过程中我们还发现几种工具酶的水解速率均较缓慢，反应的线性时间较长，因此将其改成两点法或速率法测定，取得很好的结果。
1 原理
第一步反应：排除肌酸干扰;
第二步反应：测定肌酐;肌酸反应同第一步。
2 材料和方法
2.1 仪器 自动分析仪HITACHI 7170,Beckman Synchron △CX5和Ciba Coring Express Plus。分光光度计Beckman DU-640。
2.2 原料试剂 肌酐酰氨基水解酶(Cretininase,CRNase);肌酸脒基水解酶(Creatininase,CRTase);肌氨酸氧化酶(SO)；棘根过氧化物酶(POD)，抗坏血酸氧化酶(ASO)，均为Boehringer Mannheim公司产品。3，5-二氯-2-羟-苯磺酸(DHBA)，4-氨基安替比林(4-AAP)和肌酐为Sigma公司产品。
2.3 应用试剂 试剂Ⅰ：每L磷酸盐缓冲液(150 mmol/L,pH 7.5)中含CRTase 20 kU,SO 6 kU,POD 1 kU,ASO 1 kU,DHBA 3 mmol,K4Fe(CN)6 20 Μmol,和4-AAP 4 mmol。试剂Ⅱ：每L含CRNase 50 kU。参考物(177 Μmmol/L):精确称取肌酐20 mg溶于1L经透析的混合血清中。
2.4 测定方法 自动分析通用参数：反应类型：两点法，反应温度：37℃，波长500～520 nm(主)/650 nm(次)；标准：15 Μl;样品：15 Μl;试剂Ⅰ：200 Μl;孵育时间300秒；试剂Ⅱ：50 Μl;第一点读数时间：120秒，第二点读数时间300秒。
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2.5 比较方法 Boehringer Mannheim的肌酐酶法测定试剂盒，按说明书测定。
3 实验和结果
3.1 去除肌酸干扰的能力 选择肌酐含量为495 Μmol/L的样品一份,分别加入肌酸34,67,101,134 Μmol/L用本法测定,结果分别为497.6,495.8,492.7,489.1 Μmol/L,说明通过第一步反应至少能去除134 Μmol/L的肌酸。
3.2 反应动力学曲线 选择不同浓度的样品按测定方法中的参数将样品和试剂Ⅰ混匀，37℃水浴300秒，然后加入试剂Ⅱ，立即于Beckman DU-640分光光度计自动记录动力学曲线（图略）。说明样品浓度在2740 Μmol/L(31 mg/dl)以下时120～300秒间呈线性。在此时间内可以用两点法测定。
3.3 线性范围 按NCCLS(EP6-P)的评价方案,选择低值(97 Μmol/L)和高值(2 749 Μmol/L)样品各一份等量混匀产生中间值,再分别将中间值和低值、中间值和高值等量混匀,共产生5个不同值,用三种分析仪分别用两点法从低值到高值,然后从高值到低值测定,求得均值为Y,以理论值为X,进行回归分析，三种仪器的回归方程如下,Hitachi 7170:Y=0.9912X+9.55,r=0.9999；Beckman CX5:Y=1.0799X-32.56，r=0.998；Ciba-Coning:Y=0.997X-39.4，r=0.9987。均有很宽的线性范围。
3.4 精密度 按NCCLS(EP5-T2)的评价方法，选择88.7和752.3 Μmol/L的样品各一份，用Beckman DU68分光光度计每天上下午双份测定，测10天。结果：批内CV 2.73%和0.71%；批间CV 4.43%和2.93%；总CV 4.92%和2.73%。三种仪器二个样品的批内CV：Hitachi 7170为0.38和0.34%；Beckman ΔCX5为1.44和1.31%以及Ciba-Coring为0.58和0.43%。
3.5 回收率 选择肌酐含量82.7 Μmol/L的混合血清一份，分别加入221，442和884 Μmol/L用本法测定，回收率在99.66%～100.9%。
3.6 方法比较 按NCCLS(EP9-P)的评价方案，选择含量在35～2 655 Μmol/L间的临床样品40份，分别用本法(Y)和BM公司的试剂盒(X)测定，结果X=411.1 Μmol/L,Y=410.2 Μmol/L,Y=0.973X+10.33 Μmol/L,r=0.9995。二者有良好相关。
3.7 参考值测定 选择健康体检样品275份(其中男183份，女92份)，年龄在23～60岁。列入统计者均无肾病史，肾功能检验均正常。在Beckman CX5分析仪上用本法测定,结果：男子±s为98.4±18.9 Μmol/L,范围为60.6～136.2 Μmol/L,女子±s为77.8±16.5 Μmol/L,范围为44.8～110.8 Μmol/L。
4 讨论
4.1 据报告，肌酐酶法测定有四条反应途径[1～5](图略)。我们选择比色测定是因为其灵敏度较高，线性范围宽，几种工具酶的稳定性较好[6]。
4.2 酶法测定肌酐的特异性远优于Jaffe氏法，血清中的内源性肌酸可用二步反应清除，我们在反应体系中加入亚铁氰化钾和抗坏血酸氧化酶以消除Trinder反应中的胆红素和维生素C的干扰。
4.3 工作试剂保存在4℃至少可稳定一个月，但在保存过程中工具酶或其它组份的少许变动均可影响反应速率，因此要求每天定标。
参考文献
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[2] 马鸿娟,刘胜林.两种肌酐测定在全自动生化分析仪上的应用及评价[J].哈尔滨医药.2006年06期
[3] 华永川,金斐,吕国才,娄域峰,徐根云.肌酐酶-肌氨酸氧化酶法测定血清肌酐[J].
[4] 华中医学杂志.2004年01期
[5] 唐金玉,崔四放,李海林.CEMB HCL为色原的酶法测定血清肌酐试剂盒的评价[J].包头医学院学报.2011年01期、
[6] 蒙开喜.血清肌酐测定方法的研究[J].中外医疗.2009年05期
论文作者:李兰
论文发表刊物:《医药前沿》2013年第35期供稿
论文发表时间:2014-3-6
标签：肌酐论文; 血清论文; 试剂论文; 样品论文; 法测定论文; 氧化酶论文; 线性论文; 《医药前沿》2013年第35期供稿论文;