云浮市食品药品检验所
微生物无处不在，在食品生产、运输、售卖等各环节都存在微生物污染的可能。当致病微生物随食品进入人体就可能引发感染或中毒，这一类疾病称为食源性疾病[1]。为了防止食源性疾病发生，就要对食品中微生物进行检测。传统微生物检测主要采用培养法，此法操作过程繁琐、检测时间长，在获得检测结果前受到微生物污染的食品已经扩散了。随着PCR技术在食品微生物检测中的应用，这个问题逐步得到解决，方便、快捷、准确是PCR技术优于传统培养法的最大优势，因此本文结合实例对PCR技术进行研究。
1 PCR技术原理与类型
1.1 PCR技术原理
PCR全称为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），即以单链DNA为模板，通过DNA聚合酶的协助在体外扩增DNA片段，其过程包括高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤[2]。首先，微生物双链DNA在高温（例如93℃）下解离为单链。其次，降温至适当温度（例如55℃），单链与特异性引物结合。然后，升高温度（例如72℃）并在DNA聚合酶催化下，单链DNA末端延伸，重新合成双链。不断重复以上反应，一般经过35个循环拷贝达到扩增目的。
1.2 PCR技术类型
PCR技术包括常规PCR、多重PCR、逆转录PCR、巢式PCR、免疫PCR、荧光定量PCR、数字PCR等多种类型。常规PCR采用一对寡核苷酸引物进行DNA片段扩增，每个周期产生的DNA片段作为下一循环的模板。多重PCR是在常规PCR一对引物基础上再增加一对或更多对引物，操作循环数比常规PCR大大减少，但可能存在引物干扰，扩增效率较低。逆转录PCR利用提取的mRNA为模板，在逆转录酶作用下进行DNA扩增，优点是灵敏度极高，可用于分析微量RNA样品。巢式PCR先后采用两套引物扩增DNA片段，在增加特异性前提下又可获得高敏感性。免疫PCR利用DNA分子为标记物，结合抗原反应特异性，同时进行PCR扩增和电泳分析免疫试验，抗原灵敏度高。荧光定量PCR将荧光能源传递技术用于常规PCR反应，利用受体荧光强度与DNA产量成正比的关系，达到定量检测的目的。
2 PCR技术在食品微生物检测中的应用
2.1 试验菌株
金黄色葡萄球菌ATCC 14458、CMCC 26003；沙门氏菌CMCC 633302、CMCC 50041、CMCC 50115、CICC 21495；蜡样芽孢杆菌CMCC 50093；李斯特氏菌CMCC 54001、CICC 21670；大肠杆菌ATCC 35150、CMCC 44752；志贺氏菌CMCC 51135、CMCC 51552；肺炎克雷伯氏菌CICC 21519等。
2.2 试验试剂
10×TE缓冲液、TAE电泳缓冲液、10%SDS、溴化乙锭、氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、无水乙醇、石油醚、氨水、硫酸镁、溶菌酶、Taq酶、琼脂糖凝胶、DNA Marker、DNA聚合酶、dNTP、引物等。
2.3 培养基
营养琼脂、营养肉汤等。
2.4 仪器设备
艾科浦纯水仪、电热恒温水浴锅、高速离心机、PCR仪、电泳仪、全温培养摇床、生化培养箱、漩涡混合器、不锈钢压力蒸汽灭菌锅、凝胶成像系统、紫外分光光度计、电子天平、pH计、超净工作台、显微镜等。
2.5 致病菌DNA提取
采用热裂解方法提取致病菌基因组DNA，方法如下：致病菌接种于培养基上，在恒温箱或恒温摇床37℃培养。取菌液1mL，置于1.5mL离心管内，以12000r/min离心1min，弃上清液，收集菌体。用灭菌纯水洗涤菌体2次，以100μL灭菌纯水悬浮菌体。沸水浴中加热菌体悬浮液，保持10min，冰浴冷却。再以12000r/min离心10min，上清液移至另一1.5mL离心管内，放入-20℃冰箱内，备用。
2.6 引物设计
在Genbank数据库中查找各致病菌特异性靶基因，确定基因序列：金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌invA基因、蜡样芽孢杆菌hblA基因。采用Primer 5、DNAMAN 6.0软件进行引物设计，得到引物序列（5'→3'）：nuc上游为"GGCAATACGCAAAGAGGTT"，下游为"GCACTTGCTTCAGGACCAT"；invA上游为"GATTTGTCCTCCGCTCTG"，下游为"GTAGACGCTCCGCAAGTT"；hblA上游为"AGCGAGAATGAAAGAGACCT"，下游为"TTCGTATOCCAAGTAACAGC"。nuc、invA、hblA基因的产物大小分别为328hp、487hp、192hp。
2.7 PCR反应
首先对PCR反应条件进行优化，包括退火温度、硫酸镁添加量、Taq酶添加量、dNTP添加量、反应循环数、PCR反应启动方式等，得到最佳反应条件为：10×PCR缓冲液2.5μL，硫酸镁1.0μL，dNTP 2.0μL，引物1.0μL，Taq酶0.5μL，DNA模板2.0μL，双蒸水加至25μL。反应程序：预变性94℃，5min→变性94℃，40s→退火59℃，40s→延伸72℃，40s→循环30次→终延伸72℃，10min。
2.8 PCR扩增特异性与敏感性试验
将致病菌随机组合提取DNA模板检测PCR反应的特异性。分别检测单一致病菌与多种致病菌组合的敏感性。
2.9反应产物检测、测序与实际样品检测
取5μL PCR反应产物，然后在1%琼脂糖凝胶上电泳，通过凝胶成像系统观察结果。反应产物胶回收后进行测序，在NCBI数据库中通过BLAST进行同源性比对，完成菌株的鉴定。从市场上采集鲜奶、猪肉、鸡肉各10份，利用建立的多重PCR方法体系进行检测。同时利用《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10-2016）、《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4-2016）、《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》（GB 4789.14-2014）进行对比试验。
2.10试验结果
试验结果表明，PCR反应特异性强，测序各致病菌基因片段同源性均高达99%。检测单一致病菌敏感性达到103～104CFU/mL，同时检测多种致病菌的敏感性达到104CFU/mL。实际样品对比试验结果见表1。由此可见，PCR检测结果与国标方法符合率较高，超过90%。
3 结语
民以食为天，食品安全关系到人民的健康和福祉，故提高食品检测水平至关重要。虽然传统食品微生物检测方法比较经典、可靠，但从采集样品到获得检测结果需要数日时间，而PCR检测技术可在当日出结果，检测周期大幅度缩短，这一优势使其在食品微生物检测中展现出良好的应用前景。
参考文献：
[1] 钟秀茵，杨晓斌，刘钰钗，等. LAMP和荧光定量PCR检测食品中致病微生物的对比分析[J]. 首都食品与医药，2018,25(1)：97-98.
[2] 胡博. PCR技术在食品微生物检测中的应用[J]. 现代食品，2017(2)：36-37.
论文作者:贺诗静
论文发表刊物:《中国西部科技》2019年第9期
论文发表时间:2019/11/22
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