马晶[1]2004年在《β-肾上腺素能受体不同亚型对于血管平滑肌细胞迁移、凋亡及增殖的影响及其信号转导机制》文中进行了进一步梳理β-肾上腺素能受体(β—AR)分布于几乎所有的血管平滑肌细胞，通过介导舒张血管效应对于心血管系统血液动力学的稳定发挥重要的调节作用。近年研究表明β_1-和β_2-AR两种亚型共存于血管中，除了介导负性变力效应外，还参与调节血管平滑肌细胞的其他生理学功能，但亚型特异性作用以及内在机制尚未阐明。本研究旨在观察β_1-和β_2-AR对于动脉平滑肌细胞迁移、凋亡和增殖的亚型特异性调控效应，并进一步探讨可能的信号转导机制。 第一部分：用特异性的β_1-AR和β_2-AR激动剂持续刺激原代培养的Wistar大鼠胸主动脉平滑肌细胞，以细胞划片法观察在5％胎牛血清存在情况下激动β_1-AR或β_2-AR对VSMC迁移的影响，结果发现β_1-AR和β_2-AR对于VSMC迁移的调控有明显差异。β_1-AR可剂量依赖性地抑制5％FBS诱导的VSMC迁移，NE为10~(-6)M浓度时细胞迁移距离仅为对照组的58.8±7.95％。PKA抑制剂PKI14-22、钙通道阻滞剂硝苯地平均不能逆转β_1-AR引起的迁移抑制效应，而PTIO、L-NAME则可逆转β_1-AR激动对VSMC迁移的抑制。与β_1-AR的迁移抑制作用不同，β_2-AR对迁移无明显影响。但在百日咳毒素阻断Gi信号、过表达βARKct抑制Gβγ活性以及LY294002阻断P13K通路后，β_2-AR激动可使细胞迁移明显受到抑制(为对照组的37.45±5.12％，P＜0.01)，并且激动β_2-AR可明显增加细胞内Akt和ERK1／2的磷酸化水平。而在过表达βARKct的情况下，PTIO和L-NAME亦可阻断β_2-AR的抑制迁移效应。 第二部分：应用携带β_1-AR或β_2-AR重组片段的腺病毒转染血管平滑肌细胞，制备特异性受体亚型过表达模型，采用HE染色、中国人民解主欠月阵月民医金生修学院中国入民解放军总医院博士学位论文摘要Hoeehst33342、AnnexinV一Pl双标的流式细胞仪分析(FCM)以及DNA琼脂糖凝胶电泳四种方法检测内源性以及过表达两种受体亚型对于细胞凋亡的影响。结果显示在维持量血清培养基(l%FBS)中，内源性或过表达D，一和p;厂AR激动都可诱导细胞凋亡，Hoechst染色阳性率显着高于对照组(P
何晶晶[2]2017年在《去甲肾上腺素介导的β-肾上腺素能受体活化通过激活ERK_(1/2)/CREB和PI3K/PDK1/AKT信号通路促进肝癌细胞增殖》文中研究说明研究背景和研究目的:肝癌是我国最常见、死亡率较高的恶性肿瘤之一,其发病率有逐年升高及发病年龄提前的趋势。肝癌侵袭性强,术后复发快,死亡率高,未经治疗的生存期不超过10个月。近年来,尽管肝癌的临床研究取得了一定的进展,但与肝癌发生相关的分子机制仍远未阐明。研究发现,β-肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor,β-AR)被激活后可以促进肿瘤的新血管生成、迁移侵袭、上皮间质转化和炎症等许多恶性生物学行为,同时β-AR也可以调控与这些恶性生物学行为相关的多条信号通路。本项目主要研究激活β-AR后促进HepG2细胞增殖的相关信号机制。实验方法:1.肝癌细胞(HepG2)β1-AR、β2-AR基因表达的检测:从肝癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(LO2)中提取的总RNA,然后用qPCR或RT-PCR检测细胞的β1-AR、β2-AR的m RNA表达水平。2.去甲肾上腺素(NE)对HepG2细胞增殖的影响:用浓度分别为0、1、2、5、10、20、30μM的NE刺激HepG2细胞和LO2细胞48h后,用MTT法检测细胞的增殖情况。再用浓度为0、5、10和20μM的NE分别刺激HepG2细胞24h、48h、72h,用MTT法检测细胞的增殖情况。3.NE对细胞迁移及细胞形态的影响:分别用细胞划痕实验和EMT实验检测激活β-AR对HepG2细胞迁移和细胞形态的影响。4.NE促进HepG2细胞增殖的机制分析:1)β-AR的特异性抑制剂PRO或ERK1/2的特异性抑制剂U0126对NE诱导HepG2增殖的影响:上述抑制剂处理HepG2细胞30min,然后分别用NE刺激细胞48h,再用MTT法检测细胞的增殖情况;2)CREB特异性si RNA干扰CREB后,用NE刺激HepG2细胞48h,再用MTT法检测细胞的增殖情况;3)各种抑制剂对NE诱导下游信号通路的影响:首先用浓度为10μM的NE分别在0、2、5、10、20、30、60和120 min刺激HepG2细胞,western blot分别检测ERK1/2、CREB、AKT和PDK1的磷酸化情况,并观察各种抑制剂对NE介导的下游靶蛋白磷酸化的影响。实验结果:1.qPCR和RT-PCR结果显示,肝癌细胞(HepG2)β1-AR、β2-AR的m RNA表达水平明显高于LO2细胞。2.NE明显促进HepG2细胞的增殖,并呈浓度依赖性。NE的最佳浓度为10μM,最佳时间为48h。3.NE对HepG2的细胞迁移和细胞形态无明显影响。4.机制分析:1)β-AR的特异性抑制剂PRO、ERK1/2的特异性抑制剂U0126以及特异性干扰CREB后,均可明显抑制NE促HepG2细胞增殖效应;2)NE(10μM)可显着增加HepG2细胞的ERK1/2、CREB、AK T和PDK1的磷酸化水平;3)β-AR的特异性抑制剂PRO和ERK1/2特异性抑制剂U0126均可明显抑制NE刺激HepG2细胞诱导的ERK1/2和CREB的磷酸化作用。结论:1.肝癌细胞(HepG2)β1-AR和β2-AR的表达水平远高于正常肝细胞(LO2)。2.NE显着促进HepG2细胞的增殖,但对细胞迁移及细胞形态没有明显影响。3.NE促进HepG2细胞增殖的机制可能与其激活β-AR介导的ERK1/2/CREB信号通路以及PI3K/PDK1/AKT信号通路有关。
王晶晶[3]2016年在《抗高血压药物对机械牵张力诱导的VSMCs MAPKs磷酸化、细胞增殖/凋亡及甲基化的影响》文中研究指明研究目的:高血压诱导的机械牵拉作用是造成血管壁结构与功能改变即血管重构的重要因素之一。过去人们普遍认为临床上降压药物,主要是通过降低血压进而减少机械力对管壁作用而发挥治疗作用,这种作用强调了药物间接阻断机械力对血管的作用。降压药物是否可以直接阻断机械力对管壁的作用而改善血管重塑呢?未见相关报道。目前临床上常用抗高血压药物有四大类,分别为受体抑制剂、离子通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂和利尿剂等。本研究选取了临床传统上常用的利尿剂,氢氯噻嗪(Hydrochlorothiazide,HCTZ);离子通道阻滞剂,钙离子阻滞剂,硝苯地平(Nifedipine);受体抑制剂--血管紧张素受体A抑制剂,缬沙坦(Valsartan),以及血管紧张素转换酶抑制剂,依那普利(Enalapril)等四种药物作为实验药物,观察这些药物是否可以直接阻断机械力引起的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的作用。本课题组前期研究证实,机械牵张力(mechanical stretch stress,SS)可以非特异性激活小鼠VSMC细胞膜上所有跨膜蛋白如离子通道、受体和其它跨膜蛋白等,同时激活下游MAPK信号传导通路,改变基因转录和蛋白表达,最终导致细胞增殖和凋亡同时增加,从而加速血管重塑过程。本研究旨在上述研究模型和成果的基础上,继续探讨上述四种药物(氢氯噻嗪、硝苯地平、缬沙坦以及依那普利)是否可以直接阻断机械牵张力诱导的VSMC MAPKs活性、细胞增殖与凋亡以及细胞内DNA甲基化的影响,以期发现传统抗高血压药物新的作用机制(直接阻断机械力的作用),为传统的抗高血压药物的新降压机制的探讨提供重要的实验资料。实验方法:(1)利用实验室传统的贴块培养法,体外分离C57BL/6J小鼠的主动脉中膜,对VSMCs进行原代培养,通过倒置相差显微镜观察和拍照以及随后的进行形态学分析和鉴定,继而用免疫荧光的方法对VSMCs特有生物标志物平滑肌α肌动蛋白(SM-α-actin)进行鉴定,确认为高纯度的VSMCs后继续传代培养,扩增细胞,用于后续实验研究。(2)无血清细胞培养使得细胞同步化,处于静息状态下的VSMCs在分别给予氢氯噻嗪、硝苯地平、缬沙坦以及依那普利四药预处理1h后,给予机械牵张力牵拉不同时间和强度。收集处理后的细胞蛋白用免疫印迹法检测细胞内ERK1/2、JNK1/2和p38磷酸化水平。设DMSO的阴性对照组。(3)无血清细胞培养使得细胞同步化,处于静息状态下的VSMCs在分别给予氢氯噻嗪、硝苯地平、缬沙坦以及依那普利四药预处理1h后,给予10%机械牵张力牵拉强度1h,再静息培养23h。处理后的细胞用免疫荧光方法对细胞进行细胞增殖(Ki67)和细胞凋亡(TUNEL阳性)以及静息细胞(DAPI核染色)同时观察分析。设DMSO的阴性对照组。(4)无血清细胞培养使得细胞同步化,处于静息状态下的VSMCs在分别给予氢氯噻嗪及硝苯地平预处理1h,给予10%机械牵张力牵拉强度1h,再静息培养23h。处理后的细胞用免疫荧光方法对细胞进行DNA甲基化(5m C阳性)以及细胞核(DAPI染色)检测和分析。设DMSO的阴性对照组。结果:(1)组织块培养7天后,小鼠主动脉中膜组织有细胞从中长出,并逐渐达融合。而后,胰酶消化分离、传代培养。种植的VSMCs先呈圆形,贴壁后呈梭形,最后细胞长成“峰—谷”样特性。经免疫荧光鉴定VSMCs呈强阳性表达平滑肌特异性抗原SM-α-actin,阳性细胞数大于90%。(2)与加入DMSO的阴性对照组相比,氢氯噻嗪或硝苯地平对静息培养的VSMCs中ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化无影响,但对机械力牵拉引起的MAPK磷酸化影响不同。机械力可激活MAPK叁成员,硝苯地平可直接抑制机械力诱导的MAPK叁成员的激活,与硝苯地平作用相反,氢氯噻嗪可进一步协同促进机械力诱导的MAPK的激活,而缬沙坦以及依那普利与硝苯地平作用相同。(3)同样,与加入DMSO的阴性对照组相比,氢氯噻嗪或硝苯地平对静息培养的VSMCs的增殖和凋亡无影响,但对机械力牵拉引起的细胞增殖和凋亡同时增加的影响不同。机械力可诱导细胞增殖和凋亡同时增加,硝苯地平可直接抑制机械力诱导的细胞增殖和凋亡同时增加,与硝苯地平作用相反,氢氯噻嗪可进一步协同促进机械力诱导的细胞增殖和凋亡同时增加。(4)DMSO的阴性对照组细胞甲基化水平较高,氢氯噻嗪对静息细胞甲基化水平无影响,与DMSO组相近,但硝苯地平可少量减少静息培养的VSMCs的甲基化。机械力牵拉引起的细胞甲基化明显减少,硝苯地平可抑制机械力诱导引起的甲基化减少,氢氯噻嗪也可阻断机械力诱导的甲基化减少达到与DMSO阴性组相近的高度。(5)与DMSO组相比,缬沙坦和依那普利并不引起静息细胞的MAPKs磷酸化变化,而机械力可诱导VSMCs ERK和P38MAPK磷酸化增加,这种增加可分别被缬沙坦和依那普利浓度依赖性抑制。结论:(1)机械力可诱导静息培养的VSMCs中ERK1/2、JNK1/2、p38的磷酸化增加,氢氯噻嗪起到协同促进作用,而硝苯地平与氢氯噻嗪作用相反,呈现抑制作用。缬沙坦以及依那普利与硝苯地平作用相同,呈现浓度依赖性抑制。(2)机械力可引起VSMCs增殖与凋亡同时增加,氢氯噻嗪起到协同促进作用,而硝苯地平与氢氯噻嗪作用相反,呈现抑制作用。(3)机械力可引起VSMCs甲基化减少,氢氯噻嗪可起到甲基化抑制作用,而硝苯地平的抑制作用要小于氢氯噻嗪的。总之,四大抗高血压药物对于机械力诱导的VSMCs内MAPKs、增殖和凋亡增加以及甲基化减少作用均有直接影响,但各自作用有所不同,该研究发现了临床上常用的抗高血压药物新的作用机制。
黄莹莹, 许梦习, 庄朋伟, 张艳军[4]2017年在《Epac信号分子在心血管疾病中的研究进展》文中认为3',5'-环磷酸腺苷(cAMP)直接激活交换蛋白(Epac)是小GTP酶Ras超家族Rap1和Rap2的鸟嘌呤核苷酸交换因子,参与细胞黏附、细胞间连接、胞吐/分泌、细胞增殖和分化等cAMP相关的细胞功能。近几年,许多外文文献报道了Epac在各种cAMP依赖性心血管疾病中的功能,如心肌肥大、纤维化、凋亡、心律失常和血管调节作用,而国内研究报道则较少。本文对Epac与心血管系统的作用及机制进行综述,以促进Epac相关药物的研究。
景晓娟[5]2009年在《氨氯地平联合替米沙坦或复方盐酸阿米洛利治疗高血压患者血压和左室肥厚的效果及其与血清瘦素和脂联素的关系》文中研究表明研究背景高血压病是危害我国人民健康最常见的心血管疾病之一。而左心室肥厚(LVH)是高血压病的最具有特征性的改变之一。目前公认,高血压引起的LVH是发生各种心血管并发症的独立危险因素。LVH与心脏舒缩功能的下降、冠状动脉储备量的减少和各种心律失常发生密切相关。因此,欲根本改善高血压患者的预后,除将血压降至理想水平外,更需要逆转LVH,逆转LVH才是改善高血压患者预后的关键,具有重要的临床价值。故在降压药的选择上,须挑选那些既能有效降压又能预防和逆转LVH的降压药物。近年来,国内外在逆转LVH方面作了大量的工作,认为各类降压药物逆转LVH的机制和效果是不同的。国内外多项临床研究表明,钙离子拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻断剂、血管紧张素受体拮抗剂、利尿剂、内皮素受体拮抗剂均有逆转高血压患者左室肥厚的作用。虽然高血压左心室肥厚的研究已经取得了巨大的进展,但是各种降压药物逆转LVH的效果报告有较大差异,单一用药效果比联合用药差。国人采用哪种联合用药方案降压能更好的逆转左心室肥厚,目前尚无肯定的答案。瘦素、脂联素是肥胖基因(ob)编码的产物,主要是由脂肪细胞分泌的循环激素。目前多数研究也表明高血压患者的瘦素水平升高、脂联素水平降低。但瘦素和脂联素在高血压LVH患者中的浓度及药物干预后的变化不是十分清楚,因此,瘦素、脂联素可否作为早期预测高血压左心室肥厚患者的高敏感性和高特异性指标,目前尚无相关报道。研究目的本研究旨在比较氨氯地平加用替米沙坦(氨+替组)和氨氯地平加用复方盐酸阿米洛利(氨+阿组)两种方案在治疗高血压和逆转左心室肥厚方面的效果,并观察高血压左心室肥厚患者治疗前后血清瘦素和脂联素水平的变化,探讨高血压左室肥厚发生与瘦素和脂联素的关系,从而筛选出可早期预测高血压左心室肥厚者的高敏感性和高特异性指标。研究方法(1)、病历选择按2005年中国高血压防治指南提出的高血压病诊断标准,确诊为原发性高血压的患者,同时经超声心动图检测确诊伴有LVH,经洗脱期后血压达到入选标准(收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg),男性49例,女性43例,共92例。患者年龄50～79岁,平均64±5岁。排除继发性高血压、不稳定性心绞痛、急性心脑血管事件(3个月内)、严重的肾脏及肝脏疾病、恶性肿瘤、痛风、妊娠以及对研究药物有过敏和明确禁忌症的患者。(2)、实验分组将92例原发性高血压患者随机分为两组:①氨+阿组46例(男25,女21) ,平均(65±4)岁;②氨+替组46例(男24,女22),平均(66±3)岁。随机号由北京随机中心产生。两组患者的用药分别为:氨氯地平2.5 mg/d+复方阿米洛利1片/d;氨氯地平2.5 mg/d+替米沙坦80 mg/d。(3)、彩色多普勒超声心动图检查,分别测量:①左心室肥厚形态学特征:舒张期室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室内径(LVID)。观察左心室肥厚影像学特征。根据公式计算:左室重量(LVM)=1.04[(LVID+IVST+LVPWT)﹣LVID]3-13.6,左室重量指数(LVMI)=LVM/BSA(g/㎡)。左室肥厚诊断标准:LVMI:男:131>g/㎡,女:108>g/㎡。②心脏功能检查:取左室长轴切面、M型超声二尖瓣腱索水平测左室收缩功能指标:左室射血分数(LVEF);左室舒张功能指标:取心尖四腔切面,脉冲多普勒取样容积置二尖瓣瓣尖部,以最大二尖瓣前向频谱为准,取5个心动周期测下述指标的平均值:二尖瓣舒张早期流速峰值(E峰),二尖瓣舒张晚期流速峰值(A峰),E/A比。(4)、瘦素和脂联素测定:取患者清晨空腹10ml血,离心后取血清- 80℃保存。采用北京北方生物技术研究所提供的瘦素及脂联素试剂盒。瘦素采用放射免疫法进行测定。脂联素采用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行测定。(5)、对每例患者进行随访观察一年,每月随访1次。观察心脏与血管的结构与功能的变化。研究结果(1)氨氯地平+替米沙坦组收缩压由157±4mmHg降至123±6mmHg;舒张压由98±5mmHg降至76±6mmHg,与治疗前比较均有非常显着差异(P <0. 01)。氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组收缩压由156±5mmHg降至127±5mmHg;舒张压由97±7mmHg降至82±5mmHg,与治疗前比较均有非常显着差异(P <0. 01)。每组治疗前后无论收缩压还是舒张压均有非常显着差异(P <0. 01),但两组间治疗后收缩压及舒张压差别无统计学意义(P >0. 05)。(2)氨氯地平+替米沙坦组IVST由12.7±1.5mm降至9.8±0.6mm;LVM由311.3±15.4g降至245.2±19.7g;LVMI由179.8±9.2g/m~2降至138.6±10.5g/ m~2,与治疗前比较均有非常显着差异(P <0. 01)。氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组IVST由12.3±1.6mm降至10.5±0.4mm ; LVM由338.6±24.3g降至270.7±18.6g;LVMI由187.2±12.1g/m~2降至161.4±9.7g/ m~2,与治疗前比较均有非常显着差异(P <0. 01)。每组治疗前后IVST、LVM、LVMI的比较均有非常显着差异(均P < 0. 01),氨氯地平+替米沙坦组以上各项指标与氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组比较差异显着(P < 0. 05)。(3)氨氯地平+替米沙坦组E/A比值由0.6±0.4增至0.8±0.2;EF值由65.7±3.6%增至68.1±4.4%,与治疗前比较均有显着差异(P <0. 05)。氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组E/A比值由0.6±0.3增至0.7±0.2;EF值由62.4±4.1%增至63.4±3.9%,与治疗前比较均有显着差异(P <0. 05)。每组治疗前后E/A比值、EF值的比较均有显着差异(P < 0. 05),氨氯地平+替米沙坦组E/A比值、EF值比氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组差异更为明显(P < 0. 05)。(4)氨氯地平+替米沙坦组的血清瘦素水平由(7.2±1.9)μg/ L降至(3.4±1.3)μg/ L;氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组的血清瘦素水平由(7.3±1.6)μg/ L降至(4.8±1.3)μg/ L,每组治疗前后血清瘦素水平的比较均有非常显着差异(P < 0. 01);氨氯地平+替米沙坦组与氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组比较差异更为显着(P < 0. 05)。(5)氨氯地平+替米沙坦组的血清脂联素水平由(6.3±1.2)μg/mL增至(8.1±1.8)μg/mL;氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组由(6.1±1.3)μg/mL增至(7.2±1.6)μg/mL,每组治疗前后差异均显着(P<0. 01或P<0. 05),氨氯地平+替米沙坦组的血清脂联素水平较氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组增加更为明显(P<0. 05)。(6)在氨氯地平和替米沙坦或氨氯地平和复方盐酸阿米洛利的作用下,高血压LVH患者随着左室重量指数的降低,血清瘦素水平随之降低,两者之间呈显着正相关(r=0.742,P<0.01)。(7)在氨氯地平和替米沙坦或氨氯地平和复方盐酸阿米洛利的作用下,高血压LVH患者随着左室重量指数的降低,血清脂联素水平随之升高,两者之间呈显着负相关(r=-0.367,P<0.01)。(8)在氨氯地平和替米沙坦或氨氯地平和复方盐酸阿米洛利的作用下,高血压LVH患者随着血清瘦素水平的降低,血清脂联素水平随之升高,两者之间呈显着负相关(r=-0.312,P<0.01)。研究结论氨氯地平+替米沙坦组及氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组均具有显着降低收缩压及舒张压、逆转高血压患者左室肥厚、提高EF值改善心功能及降低左心室肥厚患者血清瘦素水平、升高血清脂联素水平的作用,但氨氯地平+替米沙坦组比氨氯地平+复方盐酸阿米洛利组能有更明显的逆转左心室肥厚、提高EF值改善心功能和降低血清瘦素水平、升高血清脂联素的作用。说明氨氯地平+替米沙坦组有更好的治疗高血压的效果,保护心脏作用。并提示瘦素、脂联素参与了左心室肥厚的发生、发展。综上所述,不难看出氨+替组无论在降压方面还是在逆转LVH效果方面均优于氨+阿组。此外,随着血压降低和LVH逆转而瘦素水平下降和脂联素水平升高。此说明两者参与高血压和LVH发生和发展。并提示血清瘦素、脂联素水平可作为判断高血压左室肥厚逆转的一个客观指标。
刘子泉[6]2011年在《人源S100A1和S100B全基因合成、表达、单抗制备及其活性分析》文中指出S100A1和S100B蛋白是低分子量钙结合蛋白,均属于S100蛋白家族。S100蛋白家族分子具有广泛的生物学活性。其主要功能是作为钙结合蛋白参与多种细胞内的活性调节,通过钙离子信号转导、影响激素分泌、抑制微管蛋白的组装及抑制蛋白激酶C介导的磷酸化等途径,在细胞增殖与分化、肌肉收缩、基因表达与分泌、以及细胞凋亡中发挥重要作用。研究表明,S100基因或蛋白在很多疾病中表达异常,如阿希海默病、银屑病、胆囊纤维化、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化、心肌病和癌症等,而且与疾病的分期和预后密切相关。目前,S100蛋白家族在肿瘤发生发展中的作用尚不明确。但已有研究提示,S100蛋白家族通过调节信号通路影响肿瘤发生发展。S100蛋白家族成员在多种肿瘤组织中高表达,其抗体在肿瘤的诊断和治疗中具有很重要的潜在作用和意义。S100A1和S100B蛋白是最早被发现的S100蛋白家族成员。S100A1蛋白的表达有高度的组织特异性和细胞特异性,在骨骼肌中很少表达,而在健康心肌细胞中则大量表达。心力衰竭时S100A1表达下降,增加S100A1的表达能改善心肌细胞内Ca2+转运的动态平衡,抑制心肌细胞凋亡,改善心肌能量供应,影响心脏重构,从而改善心肌收缩、舒张功能,抑制和逆转心力衰竭的进展。S100A1可与其它S100家族成员如S100A4共同作用,影响肿瘤的浸润、侵袭和转移。此外,它还参与细胞糖代谢,与细胞骨架动力学组成相关,通过与G蛋白作用调控cAMP的信号传导途径,参与细胞增殖相关的钙信号传导过程。S100B是S100家族中存在于脑内最主要和最具有活性的成员,约96%存在于脑内,主要由星形胶质细胞合成。S100B蛋白有广泛的生物学活性,在生理情况下发挥重要的生理功能,但含量过高可能具有直接神经毒性作用,或者同糖基化终末产物的受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)相互作用而导致神经细胞凋亡。S100B能调节细胞的可塑性,有助于星形胶质细胞的钙处理能力,参与信息传递,调节细胞代谢,有胶质源性的营养作用。此外, S100B能促进胰岛细胞、垂体瘤细胞分泌胰岛素和催乳素,参与炎症反应。神经胶质细胞旁分泌和自分泌S100B蛋白,可作用于神经元和神经胶质细胞,促进神经的生长和损伤的修复。S100A1和S100B蛋白与很多疾病的发生发展有密切联系,在胞内和胞外均能发挥其生物学作用。由于S100A1和S100B蛋白功能的多样性,研究人员把S100A1和S100B蛋白作为某些疾病诊断的标志物以及潜在药物靶标进行探索,并已取得了阶段性研究成果。目前,对S100A1和S100B蛋白的功能研究比较全面,但开展S100A1和S100B蛋白作用机制方面的研究很少,S100A1和S100B蛋白在细胞内外发挥作用的信号转导途径是什么?是否存在特异性受体?其在肿瘤发生发展中的作用及机制如何?需要进一步研究确定。但S100A1和S100B蛋白及其单克隆抗体多为进口产品,价格高,购买困难,无论从经济上还是效率上都限制了对该蛋白和抗体的研究和利用,不利于大规模地开展蛋白相关功能及其机制的研究。因此,我们拟构建人源S100A1和S100B蛋白表达载体,制备高纯度国产人源S100A1和S100B蛋白及其单克隆抗体。制备获得的重组蛋白,可用于肿瘤组织的临床检测及分子靶标作用的基础研究,以揭示其作用机制。制备其单克隆抗体可用于人源S100A1和人源S100B蛋白表达水平的检测、疾病诊断、治疗及预后判断,这为以后深入研究该蛋白特性及其在相关疾病中的作用机制奠定了基础,具有重要的现实意义。主要研究结果如下:第一部分:人源S100A1和S100B全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定实验一人源S100A1全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定方法:1.优化人源S100A1基因序列,设计合成人源S100A1序列引物,在两端引物分别引入EcoR I和BamH I酶切位点,分段合成法PCR全基因合成人源S100A1全基因。2.回收纯化PCR产物, TA克隆至载体pMD18-T ,构建克隆载体pMD18-S100A1,并将其转化到E. coli DH5α中,PCR筛选阳性转化子,小量提取质粒,经酶切鉴定后送invitrogen公司测序。3.用EcoR I和BamH I双酶切测序正确的pMD18-S100A1,与经同样酶切的pBV220质粒用T4 DNA连接酶连接,构建表达质粒pBV220 -S100A1,并将其转化到表达宿主E.coli DH5α中,PCR筛选阳性转化子。4.将阳性单菌接种于含氨苄西林的LB培养基中,热激诱导表达人源S100A1蛋白。5. SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定重组蛋白。6.采用离子交换层析法纯化人源S100A1蛋白。7.脱盐并冻干人源S100A1蛋白。结果:1.全基因合成了人源S100A1基因,成功构建重组表达质粒pBV220-S100A1,经酶切鉴定和DNA序列测序分析表明,该质粒含有人源S100A1基因的编码序列全长,开放阅读框架正确。2.重组表达质粒pBV220-S100A1转化入表达宿主,诱导表达产物经纯化、SDS-PAGE和Western Blotting分析,表明表达蛋白为人源S100A1蛋白。结论:1.成功构建含有人源S100A1编码序列原核表达载体pBV220-S100A1。2.经热激诱导表达、离子交换层析纯化获得纯度达95%的重组S100A1蛋白。实验二人源S100B全基因合成和优化、表达、纯化与鉴定方法:1.优化人源S100B基因序列,设计合成人源S100B序列引物,在两端引物分别引入Nde I和XhoⅠ的酶切位点,分段合成法PCR合成人源S100B基因。2.回收纯化PCR产物,TA克隆至载体pMD18-T,构建克隆载体pMD18-S100B,并将其转化到E. coli DH5α中,PCR筛选阳性转化子,小量提取质粒,经酶切鉴定后送invitrogen公司测序。3.用Nde I和XhoⅠ双酶切测序正确的pMD18-S100B,与经同样酶切的pET32a质粒用T4 DNA连接酶连接,构建表达质粒pET32a-S100B,并将其转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中,PCR筛选阳性转化子。4.将阳性单菌接种于含氨苄西林的LB培养基中,IPTG诱导表达人源S100B蛋白。5. SDS-PAGE和Western Blotting分析鉴定重组蛋白。6.采用离子交换层析法纯化人源S100B蛋白。7.脱盐并冻干人源S100B蛋白。结果:1.全基因合成人源S100B基因,成功构建重组表达质粒pET32a-S100B,经酶切鉴定和DNA序列测序分析表明,该质粒含有人源S100B基因的编码序列全长,开放阅读框架正确。2.重组表达质粒pET32a-S100B转化入表达宿主,诱导表达产物经纯化、SDS-PAGE和Western Blotting分析,表明表达蛋白为人源S100B蛋白。结论:1.成功构建含有人源S100B编码序列原核表达载体pET32a-S100B。2.经IPTG诱导表达、离子交换层析纯化获得纯度≥95%的重组S100B蛋白。第二部分:人源S100A1和S100B蛋白促进Hela细胞侵袭迁移研究方法:利用人工基底膜和基质胶,模拟在体的基质膜屏障,根据肿瘤细胞穿过基质膜的数量间接反映它的侵袭能力,而肿瘤细胞穿过不含基质胶滤膜的数量间接反映它的迁移能力。铺有基质胶的滤膜放在上下室之间,铺有基质胶面朝向上室,在下室中加趋化剂,对照组上室加入100uL重悬的Hela细胞和100uL基础培养基,实验组上室加入100uL重悬的Hela细胞和100uL重组蛋白,具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面,可用棉签将上表面的细胞拭去,然后经固定、染色,观察统计穿过基质胶的细胞数量。结果:1.人源S100A1蛋白显着提高Hela细胞迁移能力(与对照组相比,P<0.05),但对其侵袭能力无显着影响。2.人源S100B蛋白可使Hela细胞的侵袭能力提高2.8倍,迁移能力提高3.5倍。结论:1.纯化获得的重组人源S100A1蛋白具有生物活性,可提高肿瘤细胞的迁移能力。但对其侵袭能力影响较小。2.纯化获得的重组人源S100B蛋白具有生物活性,可提高肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。第叁部分:抗人S100A1和S100B蛋白单克隆抗体的制备、纯化与鉴定实验一抗人S100A1蛋白单克隆抗体的制备、纯化与鉴定方法:1.将纯化的重组人源S100A1蛋白和免疫佐剂共同制备成免疫原,免疫小鼠。2.用传统的细胞融合法,将免疫成功的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞。3. ELISA检测杂交瘤细胞上清液中抗人S100A1抗体的效价,筛选阳性细胞株。4.有限稀释法对阳性细胞株进行亚克隆,得到能够分泌目标抗体的单细胞株。5.冻存阳性细胞株,叁个月后复苏细胞,检测其抗体分泌的稳定性。6.体内接种杂交瘤单细胞株,制备腹水型单克隆抗体,用Protein G HP层析纯化蛋白,得到人源S100A1单克隆抗体。7. Western Blotting及ELSIA法鉴定抗体特异性。8. ELSIA法测定抗体的亲和常数。结果:1.获得了4株能稳定分泌抗人S100A1单克隆抗体细胞株。2. 4株细胞抗体亲和常数均较高,结合抗原的能力均较强,与其他抗原无交叉反应,特异性好。结论:1.建立了能稳定分泌抗人S100A1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.制备出抗人S100A1单克隆抗体,并进行了相关性质鉴定。实验二抗人S100B蛋白单克隆抗体制备、纯化与鉴定方法:1.将纯化的重组人源S100B蛋白和免疫佐剂共同制备成免疫原,免疫小鼠。2.用传统的细胞融合法,将免疫成功的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞。3. ELISA检测杂交瘤细胞上清液中人源S100B抗体的效价,筛选阳性细胞株。4.有限稀释法对阳性细胞株进行亚克隆,获得能分泌目标抗体的单细胞株。5.冻存阳性细胞株,叁个月后复苏细胞,检测其抗体分泌的稳定性。6.体内接种杂交瘤单细胞株,制备腹水型单克隆抗体,用Protein G HP纯化蛋白,获得人源S100B单克隆抗体。7. Western Blotting及ELSIA法鉴定抗体特异性。8. ELSIA法测定抗体的亲和常数。结果:1.获得了3株能稳定分泌抗人S100B单克隆抗体的细胞株。2. 3株细胞抗体亲和常数均较高,结合抗原的能力均较强,与其它抗原无交叉反应,特异性好。结论:1.建立了能稳定分泌抗人S100B单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.制备出抗人S100B单克隆抗体,并进行了相关特性鉴定。第四部分:抗人S100A1和S100B单克隆抗体活性分析方法:1.外源性给予抗人S100A1单克隆抗体,观察其对人黑色素瘤细胞A375增殖、凋亡及P53蛋白表达的影响。2.以商业化的抗人S100A1单克隆抗体为对照,利用制备的抗人S100A1单克隆抗体Western Blotting法检测人黑色素瘤细胞A375中S100A1蛋白的表达。3.外源性给予抗人S100B单克隆抗体,观察其对人黑色素瘤细胞A375增殖、凋亡及P53蛋白表达的影响。4.商业化的抗人S100B单克隆抗体为对照,利用制备的抗人S100B单克隆抗体Western Blotting法检测人黑色素瘤细胞A375中S100B蛋白的表达。结果:1.外源性给予抗人S100A1单克隆抗体,细胞增殖速度减慢,细胞凋亡增加,胞浆内S100A1蛋白表达降低,P53蛋白表达增多。2. Western Blotting检测显示,S100A1蛋白在人黑色素瘤细胞A375中弱表达,且与商业化的进口单抗相比,检测效果无明显差异。3.外源性给予抗人S100B单克隆抗体,细胞增殖速度减慢,细胞凋亡增加,胞浆内S100B蛋白表达降低,P53蛋白表达增多。4. Western Blotting检测显示,S100B蛋白在人黑色素瘤细胞A375中有表达,但与商业化的进口单抗相比,检测效果无明显差异。结论:1.制备的抗人S100A1和S100B单克隆抗体既可以用于肿瘤细胞的Western Blotting检测,又可发挥抑制肿瘤细胞的增殖,起到靶向治疗作用,为相关疾病的诊断和治疗提供了新的筛查手段。2.抗人S100A1和S100B单克隆抗体对癌细胞的靶向治疗作用,其机制可能是通过与S100A1和S100B蛋白结合,使胞浆内S100A1和S100B蛋白表达减少,增加了野生型P53蛋白表达,从而促细胞凋亡,达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。
冯晔囡, 肖晗, 张幼怡[7]2019年在《自主神经系统调控心脏炎症反应的研究进展》文中认为心脏受自主神经系统的交感神经和副交感神经的双重支配,两者相互平衡,维持并调节心脏能量代谢、心率及血压。多种心脏病理状态均存在自主神经系统的失衡,表现为增强的交感神经活性及受抑制的副交感神经活性。越来越多的证据表明,过度激活的交感神经会引起心脏炎症反应。适度的炎症反应有助于心脏清除损伤组织并启动修复,而过度的炎症反应则可造成心脏损伤。近年来由于对α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)介导的胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP)的认识,副交感神经在心脏中的抗炎作用也受到更多的关注。本文旨在总结交感神经和副交感神经对心脏炎症反应的作用及其机制,为临床干预心脏炎症反应提供新思路。
王赛仑, 陆佳玮, 管又飞, 张晓燕, 徐虎[8]2019年在《前列腺素E2受体EP4在心血管疾病中的作用》文中指出前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)是花生四烯酸的代谢产物,作为一种重要的活性脂质介质,在多种生命活动中发挥重要作用。PGE2通过4种G蛋白耦联受体发挥其功能,包括EP1、EP2、EP3和EP4。其中,EP4广泛表达于人体多种器官和组织中。大量研究显示,EP4在心血管稳态调节和重大心血管疾病发生中具有重要作用,但其具体功能和机制尚不明确。本文从炎症调控的角度,分析和总结EP4与心血管功能调节和重大心血管疾病的关系。
李跃文, 刘志强, 易增兴, 秦后响, 王博龙[9]2019年在《左金丸活性成分-靶点-多维作用机制》文中认为目的 分析左金丸活性成分-靶点-多维作用机制。方法 通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库获取左金丸活性成分及对应靶点,TTD数据库预测分析左金丸潜在治疗疾病,Cytoscape软件分别构建活性成分-靶点、靶点-疾病网络,STRING平台构建靶蛋白互作网络,BINGO和MCODE插件对靶基因进行GO生物过程富集和聚类分析,生物学信息注释数据库(DAVID)对靶点进行KEGG信号通路分析。结果 左金丸中13种活性成分作用于49个潜在靶点,涉及炎症反应调节、突触传递、细胞分化、凋亡等19个生物子簇;KEGG富集得到消化液分泌、癌症、内分泌、神经递质、炎症、信号转导、心血管7大类22条信号通路,在消化、神经、心血管系统疾病以及炎症、癌症等方面具有治疗价值。结论 本研究揭示了左金丸活性成分、靶点、多维作用机制,可为其临床治疗价值拓展提供新的线索。
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