曲辰[1]2014年在《长非编码RNA H19在乳腺癌化疗耐药中的作用与机制研究》文中提出研究背景与目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。迄今为止,手术、放疗、化疗仍然是乳腺癌的主要治疗手段。其中化疗以其在手术前控制和缩小病灶,手术后防止复发转移等特殊作用而在乳腺癌综合治疗中占有不可替代的地位。但是几乎不可避免的化疗耐药一直是有效控制乳腺癌的瓶颈。乳腺癌耐药与乳腺癌患者复发及侵润转移相关,但发生机制并未明确。因此研究乳腺癌耐药机制,寻找新的耐药标志物对于有效逆转乳腺癌耐药,提高乳腺癌治疗水平具有非常重要的理论意义和潜在的临床应用价值。长非编码RNA (Long no-coding RNA, LncRNA)是一类长度在200bp以上的非编码RNA。许多研究显示LncRNA可能参与到肿瘤发生发展、治疗耐受等多种病理过程。本课题采用LncRNA基因芯片检测了我们前期建立的5-氟尿嘧啶诱导的乳腺癌多药耐药细胞系(MCF7/5FU)和亲本细胞(MCF7) LncRNA表达差异,旨在构建乳腺癌耐药细胞与敏感细胞LncRNA差异表达谱,筛选和鉴定乳腺癌耐药相关LncRNA,为阐述乳腺癌耐药机制提供新的理论依据。实验方法1.通过长非编码RNA高通量基因芯片分析5-氟尿嘧啶诱导的乳腺癌多药耐药细胞(MCF7/5FU)与亲代乳腺癌细胞(MCF7)之间的长非编码RNA表达差异.本项目受国家自然科学基金资助(基金资助号：81272450)2.荧光实时定量PCR从MCF7/5FU及亲代MCF7细胞和12例乳腺癌组织及配对癌旁组织验证H19等片段的表达差异；3.采用靶向H19的siRNA干扰MCF7和T47D细胞中H19的表达,实时定量PCR检测干扰效果,MTS检测H19干扰后细胞耐药性变化；4.构建H19表达慢病毒感染H19低表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞,嘌呤霉素筛选后获得H19稳定高表达细胞系,MTS检测其耐药性变化；5. Western blot检测H19干扰和过表达细胞中EMT标志物的表达变化情况；Transwell实验确定这些细胞侵袭性的变化；6.实时定量PCR确定H19干扰的MCF7、T47D细胞、H19过表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞相对对照细胞miRNA200c的表达变化,western blot检测miRNA200c的下游分子ZEB1的表达变化；7.将miRNA200c抑制物导入H19过表达细胞,MTS、transwell和western blot检测miRNA200c抑制物对H19表达的影响,确定miRNA200c在H19参与的调控过程中的作用；8.染色质免疫共沉淀(CHIP)检测H19干扰的MCF7、T47D细胞、H19过表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞相对对照细胞miRNA200c启动子组蛋白H3乙酰化改变情况,确定H19对miRNA200c的表达调控机制；实验结果1.基因芯片和实时定量PCR提示H19长非编码RNA在药物敏感乳腺癌细胞MCF7和药物耐受乳腺癌细胞MCF7/5FU之间存在明显的表达差异。在MCF7/5FU细胞中H19表达明显下调。另外在先天耐药的乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中同样存在明显的H19表达下调；2.H19的表达水平在乳腺癌组织中相对癌旁正常组织存在显着的表达下调；3.在药物敏感的上皮表型乳腺癌细胞MCF7和T47D中干扰H19表达后这些细胞对5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、紫杉醇等叁种化疗药物的敏感性出现了一定程度的下降；4.通过慢病毒表达载体在乳腺癌耐药细胞系MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞中过表达H19,MTS实验检测发现这两株细胞的耐药性出现部分逆转；5.H19干扰的MCF7和T47D细胞EMT标志物表达出现变化,上皮标志物E-cadherin表达下调,间充质标志物Vimentin表达上调,且侵袭性上升；6.干扰H19表达的MCF7和T47D细胞中miR200c表达量下降,过表达H19的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞中miRNA200c表达量上升；且H19过表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞的EMT标志物出现变化,上皮标志物E-cadherin表达上调,间充质标志物Vimentin表达下调,且侵袭性下降；7.在H19过表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞中转入miRNA200c抑制物后,这两株细胞的耐药性上升、侵袭性增强且上皮标志物表达下调,间充质标志物上调；8. CHIP实验显示干扰H19后MCF7和T47D细胞miRNA200c启动子区域组蛋白H3乙酰化水平下降,而过表达H19后MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞miRNA200c启动子区域组蛋白H3乙酰化水平上升；结论1.H19长非编码RNA为乳腺癌多药耐药的重要标志物,其表达下调是乳腺癌化疗耐受和侵袭性增强的原因之一；2.H19长非编码RNA通过激活miRNA200c对抗乳腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT)增加乳腺癌细胞药物敏感性,降低细胞侵润；3.H19长非编码RNA主要通过提高miRNA200c启动子区域组蛋白H3乙酰化水平而激活miRNA200c表达。
周婷[2]2011年在《氟西汀合并乳腺癌化疗药物临床应用的药理基础》文中提出研究背景乳腺癌是全世界妇女最常见的恶性肿瘤之一,在我国,乳腺癌的发病率也在逐年上升。肿瘤和抑郁相关性的长期随访研究证实二者共病例比较高。由于乳腺位置的特殊性,使得乳腺癌并发抑郁障碍的发生率尤为突出,国内外研究显示乳腺癌病人中抑郁的症状呈现率大约在10-30%,抑郁障碍会严重影响患者的依从性、降低其生活质量及预后、甚至影响化疗药物的药代动力学从而影响药物的治疗效果。因此临床对乳腺癌伴发抑郁症的患者在化疗同时进行抗抑郁治疗。氟西汀便是其中之一,临床研究显示,接受氟西汀治疗的患者其抑郁症状明显得到缓解、生活质量明显提高。肿瘤化疗失败最主要的一个原因就是存在多药耐药(multidrug resistanceMDR)。多药耐药性是指抗某种细胞毒药的耐药细胞对许多结构上无关和作用机制上不同的其他细胞毒药物产生交叉耐药。肿瘤MDR形成涉及以下四大机制：一、药物转运：药物转运蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein P-gp)及其编码基因MDR1基因,P-gp是研究的最多也是MDR形成最主要的蛋白；二、药物代谢：谷胱甘肽S转移酶(glutathione S epoxide transferase GST),其中GST同工酶π(GST-π)与肿瘤耐药及疾病进展密切相关；叁、细胞凋亡基因：对那些通过诱导凋亡来杀伤肿瘤细胞的抗肿瘤药物,细胞凋亡基因的调控也与MDR发生息息相关,这其中就包括正向调控基因p53和负向调控基因Bcl-2；四、药物靶：拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ,topo Ⅱ),topo Ⅱ的定量或定性改变均影响药物疗效,这种类型的耐药称为不典型MDR。乳腺癌的多药耐药在临床上也十分常见,逆转乳腺癌化疗的多药耐药问题是乳腺癌治疗中亟待解决的问题。近年来对肿瘤化疗MDR逆转剂的研究越来越多,寻找低毒高效的逆转剂是研究的目标。以往的叁代MDR逆转剂由于不良反应严重、溶解性差以及达到逆转耐药效果所需剂量大等原因而在临床应用受限。近年来有研究发现新型抗抑郁药氟西汀(Fluoxetine, FLX)可逆转肿瘤细胞的多药耐药,有望成为第四代肿瘤化疗的增敏剂或MDR逆转剂。目前,乳腺癌化疗方案中合用氟西汀已成为常规。但这种临床合并用药的药理基础尚无系统研究。本课题将研究常用的乳腺癌化疗药物阿霉素(AdriamycinADM)、紫杉醇(Paclitaxel PTX)与合用氟西汀后对乳腺癌细胞的药理作用及机制,为临床乳腺癌化疗药物合并氟西汀的临床应用提供药理学依据。本研究拟从两方面探讨氟西汀对乳腺癌细胞的增敏或逆转耐药作用。一方面我们从氟西汀诱导凋亡这一设想出发,研究联合氟西汀前后细胞凋亡的变化,以及凋亡相关基因抑癌基因p53、抑凋亡基因Bcl-2的表达有无差异。另一方面,直接研究多药耐药P-gp基因和蛋白的表达以及GST-π的表达,探讨氟西汀联合使用前后P-gp及GST-π的表达有无改变；从而阐明氟西汀逆转乳腺癌多药耐药的分子机制。研究目的1细胞水平检测化疗药物单独使用以及合并使用氟西汀对人乳腺癌细胞敏感株MCF-7及耐药株细胞MCF-7/ADM的细胞毒性作用。2流式细胞术检测氟西汀联合使用前后对细胞凋亡的影响。3在分子水平对p53、Bcl-2、P-gp、GST-π蛋白以及MDR1mRNA表达进行检测,探讨氟西汀逆转乳腺癌多药耐药的分子机制。实验方法1MTT法检测氟西汀联合用药前后对细胞增殖抑制的影响倍比稀释氟西汀母液至80、40、20、10、5、2.5μg/ml的工作浓度；同样的稀释阿霉素至80、40、20、10、5、2.5μg/ml和4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml；紫杉醇至16、8、4、2、1、0.5μg/ml。进行MTT实验,加药72h后检测细胞增殖抑制率,细胞增殖抑制率小于10%范围内选择氟西汀的适宜浓度作为联合用药浓度,紫杉醇和阿霉素的用药浓度不变再次进行MTT实验。计算阿霉素、紫杉醇联合氟西汀前后的IC50值,得出氟西汀的逆转倍数。t检验比较联合用药前后IC50值及阿霉素、紫杉醇单独作用MCF-7/ADM和MCF-7两细胞IC50值的差异显着性。2流式细胞术检测氟西汀联合用药前后对细胞凋亡的影响根据MTT实验结果以IC50值为参考,分别选择低、高两浓度作为后续联合用药的药物浓度：1,4μg/ml作为紫杉醇联合氟西汀作用MCF-7/ADM和MCF-7细胞的两个梯度浓度；5,20μg/ml作为阿霉素作用MCF-7/ADM的联合用药浓度；0.5,2μg/ml作为阿霉素作用MCF-7的联合用药浓度。氟西汀联合用药浓度固定为5μg/ml。两细胞经10个药物处理组:control、PTX(l)、PTX(h)、FLX-PTX(l)、 FLX-PTX(h)、ADM(l)、ADM(h)、FLX-ADM(l)、FLX-ADM(h)、FLX处理24h后,Annexin Ⅴ-PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用one-way ANOVA统计方法,并根据方差齐性与否采用Dunnett或Dunnett's T3检验法进行组间多重比较,比较各单独用药组凋亡率与空白组水平差异显着性,以及t检验比较各联合用药组与对应的单独用药组之间凋亡率表达水平差异显着性。3Western blot法从蛋白水平,RT-PCR和qRT-PCR从基因水平进行氟西汀作用的机制研究各药物处理组(同上)作用两细胞72h后,提取总蛋白用免疫蛋白印迹(Western blot)方法从分子水平检测凋亡相关蛋白p53、Bcl-2蛋白,多药耐药蛋白P-gp、GST-π的表达情况。多药耐药基因MDR1mRNA的表达检测则是两细胞经各组药物处理48h后,提取细胞总RNA进行半定量RT-PCR (semi-quantitative RT-PCR)和实时定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)实验。对所有组的目的蛋白及nRNA表达量以内参表达量进行上样量标准化后,以control组作为对照进行归一,采用(?)ne-way ANOVA统计方法,并根据方差齐性与否采用Dunnett或可信区间检验法比较各单独用药组蛋白和mRNA表达与空白组水平差异显着性,以及t检验比较各联合用药组与对应的单独用药组之间蛋白和nRNA表达水平差异显着性。结果1MTT实验检测氟西汀联合用药前后对细胞活力的影响MTT实验结果表明氟西汀作用MCF-7/ADM和MCF-7细胞的IC50值分别是25.34±1.3μg/ml和17.56±0.98μg/ml,5μg/ml浓度下MCF-7/ADM和MCF-7细胞的增值抑制率分别是5.43±2.33%和7.53±0.98%,因此选择5μg/ml作为氟西汀无细胞毒性的联合用药浓度。阿霉素联合氟西汀作用MCF-7/ADM细胞前后IC50值分别是13.62±1.44μg/ml,2.71±0.42μg/ml(P<0.001),差异有统计学意义。逆转倍数RF为5.03。阿霉素联合氟西汀作用MCF-7细胞前后IC50值分别是0.53±0.12μg/ml和0.45±0.04μg/ml,无显着性差异(P=0.338)。阿霉素单独作用耐药株和敏感株的IC50值相差25.7倍(P<0.001)。MCF-7/ADM细胞中紫杉醇联合用药前后的IC50分别是3.30±0.12μg/ml和2.59±0.11μg/ml(P=0.002)。而MCF-7细胞中分别是2.11±0.37μg/ml和1.22±0.16μg/ml(P=0.019),差异均具统计学意义。紫杉醇单独作用耐药株和敏感株的IC50值统计结果具有显着性差异(P=0.006)。2氟西汀增强阿霉素、紫杉醇凋亡诱导作用流式细胞仪检测经药物处理24h后的细胞凋亡结果显示MCF-7/ADM细胞中各组间凋亡率有显着性差异(F=312.564,P<0.001)。多重比较显示与空白组相比,FLX(P=0.161)、ADM(1)(P=0.061)、FLX-ADM(1)(P=0.058)叁组凋亡率无显着差异；其余各组凋亡率均显着提高(P<0.05),凋亡率的提高呈剂量依赖性。t-检验联合氟西汀前后各组凋亡率差异结果显示：与单独用药相比,联合用药各组凋亡率均有所上升,差异有统计学意义,FLX-PTX(1)组(P=0.001)、FLX-PTX(h)组(P=0.000)、FLX-ADM(1)组(P=0.020)、FXL-ADM(h)组(P=0.025)。MCF-7细胞中各组间凋亡率具有显着性差异(F=1095.432,P<0.001)：多重比较显示与空白组相比,除氟西汀单独用药组外,其他各处理组凋亡率均显着提高(均P<0.05)。联合氟西汀前后各组凋亡率差异显示：FLX-PTX(1)组(P=0.002)、FLX-ADM(1)组(P=0.008)、FLX-PTX(h)组(P=0.007)、FLX-ADM(h)组(P=0.020)与其对应的单独用药组相比凋亡率均有提高。3Western blot检测两细胞中p53、Bcl-2、P-gp、GST-Tπ蛋白表达3.1两细胞中p53蛋白表达MCF-7/ADM细胞中,One-way ANOVA统计学方法分析显示组间蛋白表达具有显着性差异(F=792.490,P<0.001),与空白组相比,除氟西汀单独作用组外(P=0.953),其余各药物处理组p53蛋白表达均有上升,且呈剂量依赖性(均P<0.001)。与阿霉素、紫杉醇单独作用相比,氟西汀联合用药显着上调p53的表达水平,各组均具统计学意义(均P<0.05)。MCF-7细胞中,One-way ANOVA分析各组p53表达具有显着性差异(F=272.446,P<0.001)。与空白组相比,各药物处理组p53蛋白表达均显着上升,且呈剂量依赖性。与耐药株相似,与对应的单独作用相比,联合氟西汀后显着上调p53的表达水平,且上调效果更为明显。与阿霉素、紫杉醇高浓度单独用药相比,分别8倍和14倍的上调p53水平(均P<0.05)。3.2两细胞中Bcl-2蛋白表达MCF-7/ADM细胞十个药物处理组间Bcl-2蛋白表达统计有显着性差异(F=57.169,P<0.001)。与空白组相比,氟西汀单独作用Bcl-2蛋白表达无统计学差异。阿霉素、紫杉醇单独作用MCF-7/ADM细胞并没有出现预期的下调Bcl-2表达,反而有所上调,这种现象紫杉醇低高两组尤为突出,蛋白表达的上升均具统计学意义。但氟西汀逆转了这一现象,使得各联合用药组Bcl-2相对表达水平均下降到空白组以下,差异均具统计学意义(均P<0.05)。MCF-7细胞各药物处理组间Bcl-2蛋白表达有统计学差异(F=569.921,P<0.001)。该细胞株中空白组仍检测到Bcl-2蛋白的表达,氟西汀单独作用对其无影响。与MCF-7/ADM细胞不同的是,紫杉醇单独作用MCF-7细胞两组下调Bcl-2的表达至空白组的77%和38.8%,阿霉素引起的下调较小,分别至空白组的85.6%和72.3%。联合氟西汀后,Bcl-2的下调更为显着,阿霉素和紫杉醇的联合用药组相对表达量均分别降到空白组的60%和30%以下,差异有显着性(均P<0.05)；与其单独用药组相比,差异有显着性,(均P<0.05)。3.3两细胞中P-gp蛋白表达MCF-7/ADM细胞中,各药物处理组间P-gp的表达具统计学差异(F=96.914,P<0.001)。可信区间检验结果发现与空白组相比,无论单用阿霉素还是阿霉素联合应用氟西汀,P-gp表达均无显着性变化。而紫杉醇单独作用使P-gp水平高达空白组的3.6倍,但联合氟西汀后却下调至空白组的30%以下。MCF-7细胞中各药物处理组间P-gp的表达也具统计学差异(F=146.396,P<0.001)。与空白组相比,阿霉素单用或联合应用组蛋白表达情况与MCF-7/ADM细胞相似；紫杉醇联合氟西汀组与其单独作用组相比虽蛋白表达下调有统计学差异,但相对空白组的表达量差异不大。3.4两细胞中GST-π蛋白表达MCF-7/ADM细胞空白组检测到GST-Tπ的表达,氟西汀单独作用对其表达无影响(P>0.05)；其余各药物处理组均引起GST-π的表达下调(均P<0.05),而与对应的单独用药相比,氟西汀联合用药组GST-π表达水平均下降,差异有统计学意义(均P<0.05)。MCF-7细胞各组均未检测到GST-Tπ的表达。4两细胞中MDR1基因表达经one-way ANOVA统计分析,MCF-7/ADM各药物处理组间差异有显着性(F=9.404,P<0.01),经可信区间检验显示与空白组相比,除FLX组外各单独用药组MDR1表达均呈上调态势,差异有统计学意义。氟西汀联合紫杉醇诱导MDR1基因表达的下调,与其对应单独用药相比差异有显着性(P=0.005,P<0.001),但与Western blot结果不同的是,氟西汀联合阿霉素反而引起MDR1基因表达上调,FLX-ADM(1)组上调明显,差异具统计学意义(P=0.030)。MCF-7细胞中未检测到MDR1基因的表达。qRT-PCR结果同样证实了这一点：以MCF-7细胞的control组为参比,MCF-7/ADM细胞中MDR1相对表达量是其的200倍以上,由此可见MCF-7细胞中MDR1表达可忽略。而MCF-7/ADM细胞中MDR1的相对表达量呈上升趋势,FLX-ADM((?))相对表达量是ADM(1)组的2倍,control组的近5倍,差异均具统计学意义(均P<0.05)。结论1无细胞毒性水平的氟西汀与阿霉素、紫杉醇联合应用对MCF-7/ADM和MCF-7细胞增殖抑制及凋亡诱导具有协同作用,可作为潜在的化疗增敏剂。2氟西汀增敏机制是通过直接和/或间接的作用于药物排流泵P-gp,抑制P-gp、GST-π、Bcl-2蛋白表达,诱导p53蛋白表达。
刘晶晶[3]2016年在《miR-205靶向VEGFA与FGF2调控乳腺癌化疗耐药性》文中研究表明背景:乳腺癌的多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR)是导致化疗失败及复发的最主要原因。肿瘤细胞可随诱导药物、诱导方式、细胞分化阶段及所处微环境的不同而表现出不同的耐药表型。MDR是指肿瘤对一种化疗药物出现耐药的同时对其他结构和功能各异的药物亦产生交叉耐药现象。难以避免的化疗耐药一直是有效控制乳腺癌的关键瓶颈。因此深入的研究乳腺癌的耐药机制,寻找新的耐药相关生物学标志物对于有效逆转化疗耐药,提高乳腺癌的整体治疗水平具有非常重要的理论意义,并且为其临床应用开展提供前期基础。micro RNA(mi RNA)是由长18~24个核苷酸组成的、内源性高度保守的非编码单链RNA,mi RNA发挥作用的机制是通过与靶基因的m RNA结合进而降解或者抑制其翻译,不同的mi RNA可以靶向调控同一靶基因,而一个mi RNA在不同情况下可以调控下游不同的靶基因,其基因表达调控方式为我们更加全面地了解肿瘤的发生发展,包括肿瘤细胞的MDR均开拓了更多的思路,对进一步认识和理解肿瘤耐药发生的潜在的分子机制均具有重要意义。在本文的工作中,我们主要对乳腺癌多药耐药相关mi RNA:mi R-205在乳腺癌耐药过程中发挥的功能,明确与mi R-205直接结合并受其调控的靶基因,及是否通过该靶基因影响乳腺癌的耐药及相关分子机制进行了研究与探讨。方法:1.使用mi RNA芯片对敏感株乳腺癌细胞MCF-7与耐药株乳腺癌细胞MCF-7/A02中的人源mi RNA表达谱进行检测,筛选出在两种细胞系中表达差异最显着的mi RNA:mi R-205作为后续实验研究的对象。2.用Taqman实时定量PCR的方法在不同乳腺癌细胞及对应耐药细胞株中验证mi R-205表达与肿瘤细胞耐药的相关性,并在其他耐药细胞系进一步验证。并且检测新辅助化疗前乳腺癌组织中mi R-205表达的情况,了解mi R-205的表达与乳腺癌新辅助化疗敏感性的关系。3.在MCF-7/A02细胞和CALDOX细胞中用慢病毒感染方式过表达mi R-205,以MTT方法检测细胞对阿霉素(DOX)、紫杉醇(Taxol)、依托泊苷(VP-16)的IC50,检测其耐药性的变化;采用平板克隆形成实验方法,评价肿瘤细胞对阿霉素、紫杉醇的敏感性;通过Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法等方法检测紫杉醇对目标细胞的凋亡诱导作用,同时使用实时定量PCR法检测凋亡相关基因的m RNA水平改变,采用Western-blotting检测了PI3K/AKT信号转导通路活性及相关凋亡蛋白的改变。4.综合生物信息学预测软件得到mi R-205的候选基因VEGFA和FGF2。实时定量PCR方法检测FGF2与VEGFA在MCF-7 VS MCF-7/A02细胞和CAL51VS CALDOX细胞系中的表达差异,同时ELISA法检测四组细胞上清液中VEGFA和FGF2两种因子的变化情况。进一步检测MCF-7/A02和CALDOX两组耐药细胞系转染mi R-205后,细胞VEGFA和FGF2基因的变化及上清液中两种因子的变达改变,分析比较各细胞系中mi R-205表达、VEGFA和FGF2基础表达水平的相关性。双荧光素酶报告实验验证mi R-205和VEGFA 3'UTR和FGF23'UTR的靶向关系。5.检测新辅助化疗前乳腺癌组织中VEGFA和FGF2表达情况,分析其表达水平与乳腺癌新辅助化疗敏感性及mi R-205的相关性。以MTT方法检测过表达VEGFA和FGF2和沉默两者后细胞对阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,检测其药物敏感性的变化;并进一步检测VEGFA和FGF2对细胞凋亡的影响。6.采用rescue实验检测VEGFA和FGF2的过表达是否可以逆转mi R-205对乳腺癌化疗耐药性抑制,以确认VEGFA和FGF2作为mi R-205下游功能性的直接靶点调控乳腺癌化疗耐药性:以MTT方法检测处理后各组细胞对阿霉素、紫杉醇、依托泊苷的IC50,检测其耐药性的变化;采用平板克隆形成实验方法,评价各组细胞对阿霉素、紫杉醇的敏感性;通过Annexin V/PI染色法,Caspase-3/7活性检测以及Caspase-9检测法等方法检测紫杉醇对各组细胞的凋亡诱导作用,同时检测凋亡相关蛋白及PI3K/AKT信号通路蛋白的变化,以确认mi R-205与VEGFA和FGF2的相互作用对下游通路的影响。7.采用上述方法检测在MCF-7/A02和CALDOX耐药细胞系应用PI3K抑制剂后对凋亡的影响,以进一步证明mi R-205对MCF-7/A02与CALDOX细胞化疗敏感性的调控作用是通过影响PI3K/AKT通路活性完成的。8.建立裸鼠皮下移植瘤模型。将BALB/c裸鼠随机分为四组,将MCF-7/A02-mi R-205、MCF-7/A02-NC、CALDOX-mi R-205和CALDOX-NC细胞的细胞悬液分别接种于各组裸鼠右腋皮下,约1周后,开始每隔3天清晨用游标卡尺测量小鼠移植瘤最长径L和最短径W,计算肿瘤体积并做好记录。于d15最后一次测量肿瘤体积后,给药DOX(1mg/kg)Taxol(2.5mg/kg)每叁天1次腹腔注射。开始每隔3天测量小鼠移植瘤,计算肿瘤体积,于d45最后一次测量肿瘤体积,统一颈椎脱臼处死,剥离瘤块,称重,液氮保存备用。分别取各组瘤组织,实时定量PCR检测MCF-7/A02-mi R-205及空白对照细胞移植瘤体中mi R-205的表达及VEGFA、FGF2、bax和survivin的表达变化情况。ELISA法检测动物模型血液中VEGFA和FGF2的表达变化。结果:1.对比MCF-7细胞与MCF-7/A02细胞中mi RNA芯片表达谱结果,在这两种细胞内共获得19个差异表达的mi RNA,结合本课题组前期血清学mi RNA检测结果,选定在耐药细胞系中为下调表达的mi R-205为进一步的研究对象。2.采用q PCR方法对芯片结果进行验证后发现在乳腺癌MCF-7细胞、Cal51细胞、MTMEC细胞及其对应耐药细胞系中,mi R-205在耐药细胞中低表达,同时在白血病K562细胞、HL60细胞、淋巴瘤BJAB细胞及对应耐药细胞中mi R-205表达量与耐药性呈负相关性。mi R-205表达量与乳腺癌患者新辅助化疗疗效正相关,即mi R-205表达越高疗效越好。3.在乳腺癌耐药细胞MCF-7/A02和CALDOX细胞中过表达mi R-205后肿瘤细胞对阿霉素的敏感性提高,同时对紫杉醇、依托泊苷的化疗敏感性均有所提高;平板克隆形成实验检测发现,相同化疗药物浓度下,mi R-205过表达能抑制MCF-7/A02和CALDOX细胞的克隆形成能力;对于由紫杉醇诱导的细胞凋亡检测实验,过表达mi R-205后乳腺癌细胞凋亡程度显着提高;过表达mi R-205后,各组细胞凋亡基因Bax m RNA表达增加,抗凋亡基因survivin m RNA表达下降;在蛋白水平的检测中,p AKT表达下降,促凋亡蛋白Bax表达增加,抗凋亡蛋白survivin表达下降。4.生物信息学软件预测显示VEGFA和FGF2 m RNA 3'UTR和mi R-205有两处可以结合的保守序列。VEGFA和FGF2在两种耐药细胞系中表达均高于在对照细胞中的表达,在细胞上清液中的两种因子的表达也明显升高。且在mi R-205过表达的乳腺癌细胞系中,mi R-205不仅可以在m RNA水平并且也可以在细胞因子水平抑制VEGFA和FGF2的表达。双荧光素酶报告实验中,mi R-205可以降低构建的VEGFA 3'UTR和FGF2 3'UTR野生载体的荧光活性。5.分析新辅助化疗前患者乳腺癌组织中mi R-205和VEGFA和FGF2表达,发现叁者呈负相关,并且mi R-205含量越高,患者新辅助化疗疗效越好,而高表达VEGFA和FGF2的患者其新辅助化疗疗效较差。在MCF-7和CAL 51细胞中加入VEGFA和FGF2因子后,直接导致细胞对阿霉素的耐药,凋亡减少,Bax的m RNA和蛋白表达均下降,而survivin m RNA和蛋白表达增多,激活PI3K/AKT通路;而外源转入VEGFAsi RNA和FGF2 si RNA的CALDOX细胞,对阿霉素的敏感性提高。6.Rescue实验结果显示,在mi R-205稳定转染细胞中转入VEGFA和FGF2后,降低耐药细胞的化疗敏感性,凋亡减少。VEGFA和FGF2过表达后,逆转mi R-205促进紫杉醇诱导的细胞凋亡,并且可减弱mi R-205对PI3K/AKT通路的削弱作用。Bax的m RNA和蛋白表达均下降,而survivin m RNA和蛋白表达增多。7.MCF-7/A02细胞给予10μM,CALDOX细胞给予2μM PI3K抑制剂LY294002处理24小时,同时添加不同浓度的紫杉醇(0.25μM VS 2.5 n M)处理48小时后,Bax的m RNA和蛋白表达均增加,而survivin m RNA和蛋白表达减少。也间接提示mi R-205是通过抑制PI3K/AKT通路活性来诱导凋亡而增加乳腺癌细胞化疗敏感性的。8.通过裸鼠皮下移植瘤模型证明过表达mi R-205能显着抑制MCF-7/A02接种后小鼠肿瘤体积的生长,同时能够提高裸鼠接受紫杉联合蒽环类化疗的敏感性。肿瘤组织中VEGFA、FGF2和survivin表达减少,bax表达增多。小鼠外周血清中VEGFA和FGF2两种因子表达下降。而CALDOX-mi R-205细胞接种后的小鼠未见明显成瘤。结论:mi R-205在乳腺癌细胞及其他多种肿瘤细胞中与多药耐药性呈负相关。mi R-205表达量与乳腺癌患者新辅助化疗疗效正相关,其表达越高疗效越好。在乳腺癌细胞中过表达mi R-205后,肿瘤细胞对阿霉素的敏感性提高,同时对紫杉醇、依托泊苷的化疗敏感性均有所提高;并能促进紫杉醇诱导的细胞凋亡。并且mi R-205是直接通过靶向VEGFA和FGF2实现削弱PI3K/AKT通路活性,减少p AKT表达,增加促凋亡蛋白Bax,减少抗凋亡蛋白survivin表达进而实现其促进凋亡影响乳腺癌细胞多药耐药的功能。过表达mi R-205能明显抑制裸鼠移植瘤的生长,并且可以通过抑制VEGFA和FGF2提高肿瘤的化疗敏感性。以mi R-205为治疗靶点逆转乳腺癌的耐药,将为乳腺癌的治疗带来新的探索。
薛娉娉[4]2016年在《RY10-4逆转乳腺癌多药耐药性及其抗肺腺癌活性研究》文中进行了进一步梳理黄酮(flavonoids)大量存在于我们的饮食中,有着优良的药理、保健活性于一体的多种功效。它是一种在草本植物当中广泛存在的化合物,对人类的身体健康起着重要的维系作用。黄酮类化合物不仅可以从基本的日常生活中去调节身体机能的基本状态,还可以预防肿瘤以及心血管等重大疾病。近年来随着科学水平的深入研究,在临床治病的角度上来看,有一些黄酮有着纯天然且几乎无毒性等特点而广受人们的青睐。普通针毛蕨主要生长在我国长江以南的位置,是一种金星蕨科针毛蕨属植物。民间古方中普遍认为该种草本植物在清热解毒,散结软坚方面具有独特的功效,因此在传统祖国中医学里,它常常被用来做消除水肿及治疗止血之用。这种植物当中含有一种特殊的黄酮成分叫做原芹菜素(Protoapigenone)。它在体内外的抗癌活性细胞筛选中均有很好的抗瘤表现。Protoapigenone对很多不同来源的癌症细胞都能够表现出很明显的细胞毒作用,因此抗肿瘤谱较为全面,这让广大科研工作者为之欣喜。在后续科学研究中发现,一系列的非芳香B环的黄酮类化合物例如原芹菜素都有着强大的抗瘤活性。原芹菜素近几年在多药耐药方面也表现出不俗的成绩,可以有效的治疗和逆转肿瘤细胞多药耐药。根据构效关系研究及相关文献的报道,结合前人对Protoapigenone的研究基础,采用化学全合成的方法合成了毒性更低,药效更强,含1-hydroxy cyclohexa-2,5-dien-4-one基团的新型化合物RY10-4,其化学名为2-(1-hydroxy-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-yl)-4H-Pyran-4-one。本课题主要对RY10-4的药效活性进行了深入研究,主要内容包括两个部分：第一部分主要进行了RY10-4体内和体外逆转多药耐药性的乳腺癌的作用及其所涉及影响的相关信号传递通路；第二部分主要研究了RY10-4体外抑制人肺腺癌A549细胞增殖、侵袭以及诱导凋亡的作用,并对其抗肺癌活性相关的作用机制进行了研究。第一部分：RY10-4体内外对多药耐药乳腺癌的杀伤及逆转作用研究目的：本实验在前期工作中证实RY10-4在体外可以诱导乳腺癌细胞MCF-7的凋亡,同时我们在对RY10-4的一个初步预实验中发现,RY10-4作为原芹菜素类似物能逆转阿霉素(Adriamycin, ADR)激活的p-AKT,提示其可能和原芹菜素一样对阿霉素耐药的肿瘤细胞也发挥抗肿瘤作用,在临床运用上可能具有潜在意义,但RY10-4是否真正具有逆转耐药作用及可能的作用机制尚不清楚,因此本部分对此进行着重探讨。首先,研究RY10-4在体外水平对乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR生长增殖的影响；其次,进一步研究RY10-4对化疗药物ADR运用于MCF-7/ADR细胞的敏感性及其对药物转运相关功能的改变；然后,我们更进一步探讨了RY10-4在逆转MCF-7/ADR多药耐药时所涉及的相关信号传导通路；最后,在体内水平研究了RY10-4对耐药型乳腺癌的抗肿瘤效应及逆转作用。方法：本实验采用了乳腺癌敏感细胞系MCF-7和对阿霉素耐药的多药耐药细胞系MCF-7/ADR,观察RY10-4体内和体外抗癌和逆转耐药的作用。(1)采用四氮唑盐还原法(MTT法)绘制细胞生长曲线,观察RY10-4对MCF-7和MCF-7/ADR细胞生长的影响；采用/Annexin V/PI染色法,流式细胞术检测RY10-4对细胞MCF-7和MCF-7/ADR凋亡状态的改变和影响。(2)采用MTT法体外检测RY10-4对药物ADR敏感性的分析,探究细胞MCF-7/ADR在RY10-4作用下对ADR药物敏感程度的影响。(3)采用罗丹明(Rhodamine)外排实验检测MCF-7和MCF-7/ADR细胞膜在RY10-4作用下的药物转运泵功能的影响；运用Western Blot实验技术检测MCF-7/ADR细胞在RY10-4作用下细胞内P-gp蛋白表达水平的改变；运用Real-time PCR技术检测RY10-4作用后细胞MCF-7/ADR内多药耐药基因MDR1的转录水平的改变。(4)通过ATP水平检测实验,研究RY10-4对MCF-7/ADR细胞中过量表达的P-gp的影响。(5)通过、Western Blot和Real-time PCR等实验方法检测RY10-4对MCF-7/ADR细胞内Akt, p-Akt, NF-κB蛋白表达的影响,进一步联合使用Akt抑制剂LY294002和NF-κB抑制剂PDTC检测对MDR1基因和P-gp蛋白的影响。(6)运用移植瘤模型研究RY10-4体内逆转阿霉素的作用并用HE染色研究肿瘤组织的病理学改变。结果：RY10-4具有很强的逆转乳腺癌多药耐药作用。(1)细胞生长曲线显示,化合物RY10-4对敏感株MCF-7细胞及耐药株MCF-7/ADR细胞均有生长抑制作用,和对照组阿霉素相比,RY10-4可显着抑制MCF-7/ADR细胞的生长；用流式细胞仪采用Annexin/PI染色法检测对乳腺癌细胞的凋亡,结果显示：RY10-4可显着诱导MCF-7/ADR细胞的凋亡。(2)MTT法体外分析检测乳腺癌多药耐药细胞对药物敏感性影响的结果显示：MCF-7/ADR细胞虽对ADR耐药但对RY10-4的细胞毒作用敏感,且RY10-4能够增强MCF-7/ADR细胞对化疗药物ADR的敏感性,改变耐药的状况。(3)罗丹明123外排实验结果显示：RY10-4能够增高细胞MCF-7/ADR内罗丹明潴留量和蓄积量,提示RY10-4可降低MCF-7/ADR细胞膜外排泵的药物转运功能；Western Blot实验技术检测P-gp蛋白,结果显示：RY10-4能够上调细胞MCF-7/ADR内P-gp蛋白的表达水平；Real-time PCR对MDR1基因的检测结果显示：RY10-4可以上调MCF-7/ADR细胞内MDR1基因的转录水平。(4)通过ATP水平检测实验显示：RY10-4可以抑制ATP酶活性,降低ATP的水平从而逆转多药耐药。(5)通过Western Blot及Real-timePCR方法对逆转耐药的相关信号通路蛋白检测发现：RY10-4通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控MDR/P-gp介导的耐药型乳腺癌细胞MCF-7/ADR的多药耐药。(6)通过移植瘤模型发现：RY10-4可以体内逆转耐药型乳腺癌对阿霉素的抵抗,不论单用RY10-4还是联用ADR均能使组织中的肿瘤细胞死亡,表现出强大的抗癌效应和逆转耐药效力。结论：RY10-4作为原芹菜素类似物,一方面可抑制耐药的乳腺癌细胞增殖,诱导其凋亡,下调ATP水平并抑制P-gp的外排功能,另一方面可通过抑制PI3K/Akt/NF-KB信号通路,下调MDRl/P-gp的表达,逆转MCF-7/ADR的多药耐药,而且体内水平也可以抑制耐药型乳腺癌肿瘤组织的生长情况。因此,RY10-4在体内水平以及体外水平均表现出抗癌和逆转耐药的双重作用。在前期研究中,RY10-4的抗乳腺癌作用虽然已经做出了比较深入的研究,但本课题首次报道并验证了RY10-4具有逆转耐ADR乳腺癌的多药耐药作用,首次考察了RY10-4逆转耐药的分子机制,并且没有明显的毒副作用,在保证了强大的逆转耐药作用同时特保证了其应用的安全性,可以说RY10-4比传统的逆转剂维拉帕米(Verapamil)在逆转多药耐药方面有更明显的优势。我们的实验研究结果也提示了两个逆转多药耐药的潜在靶点：NF-κB及Akt。本实验的研究内容为RY10-4今后在临床上的抗癌运用(与化疗药联合使用或者单独使用)治疗肿瘤多药耐药提供了宝贵的指导基础。第二部分：RY10-4体外抗肺腺癌活性研究目的：本部分在体外水平研究RY10-4化合物抑制人源肺腺癌细胞A549的增殖作用,探究药物RY10-4在体外抗肺腺癌的药效活性,同时研究其抗肺腺癌药效活性所涉及的相关分子机制及信号通路。方法：本实验选用人肺腺癌细胞株A549,观察RY10-4体外抗肺癌作用。(1)运用MTT法和台盼蓝拒染法研究RY10-4抑制A549细胞体外增殖的作用。(2)运用Annexin V/PI双染法并用流式细胞仪进行检测、Hoechst33258荧光染色法,同时研究RY10-4对诱导肺腺癌A549细胞凋亡的作用。(3)通过PI染色法流式细胞仪分析RY10-4对细胞周期的阻滞作用。(4)通过Transwell法来评价RY10-4对A549细胞体外侵袭能力的影响。(5)运用Western Blot实验方法检测RY10-4对凋亡侵袭相关蛋白及相关通路蛋白表达水平的影响。(6)用流式细胞仪检测RY10-4对活性氧自由基(ROS)的影响。结果：RY10-4在体外表现出很强的抗肺腺癌活性。(1)RY10-4可以显着抑制A549细胞体外增殖活性。(2)RY10-4可以显着诱导A549细胞凋亡,染色法中经过RY10-4处理过的细胞呈现出明显的凋亡细胞的形态特征,凋亡细胞比率增高,且经STAT3抑制剂AG490预处理可以显着促进RY10-4诱导的凋亡反应。(3)RY10-4处理后,细胞的G1期细胞比率显着增加。(4)当A549细胞使用不同浓度RY10-4干预后发现,能够透过聚碳酸酯膜的细胞也梯度性减少,说明A549的侵袭行为受到了RY10-4的明显抑制。(5)在RY10-4处理后的A549细胞中我们检测到,线粒体中的细胞色素C向胞浆位置释放,线粒体凋亡途径被激活,P38、ERK信号传导通路被磷酸化活化。A549细胞被抑制剂预处理后,则发现U0126 (ERK特异性抑制剂)及AG490 (STAT3特异性抑制剂)明显地能够促进化合物RY10-4所诱导的细胞凋亡现象,而SB203580(P38特异性抑制剂)则抑制了RY10-4诱导的凋亡反应。(6)RY10-4处理后可显着增高ROS水平,且与U0126及AG490联用可进一步协同增高ROS水平,而联用SB203580则使ROS水平降低。结论：本研究首次证实了RY10-4体外抗肺腺癌A549细胞的药效活性,并考察了其分子机制。RY10-4通过抑制增殖,促进凋亡,阻滞细胞周期进程,抑制侵袭作用发挥良好的体外抗肺癌活性,ERK和p38MAPK通路介导的STAT3/ROS途径是RY10-4诱导凋亡和抑制侵袭的重要机制。
王学东[5]2011年在《Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌多药耐药中的作用及机制研究》文中指出背景与目的：乳腺癌是一个世界范围内的严重危害妇女健康的恶性肿瘤之一。化疗在乳腺癌的治疗中有着重要的作用。然而,肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)一直是乳腺癌化疗效果难以突破的一个瓶颈,目前尚无有效的治疗策略。因此,研究乳腺癌的耐药机制,寻找新的治疗靶点是目前研究重点。乳腺癌的化疗耐受机制十分复杂,虽然各类文献陆续有些报道,但至今仍无定论。本课题拟在实验室前期已建立的5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的乳腺癌多药耐药细胞系的基础上,应用基因芯片技术高通量地筛选人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/5-FU与亲本细胞株MCF-7之间的差异基因表达谱。通过筛选鉴定耐药相关基因及其基因功能分析,探讨MDR相关基因信号调控网络,试图寻找MDR新的标志物,为进一步阐述乳腺癌MDR机制,开展逆转耐药的靶向治疗,提高乳腺癌化疗效果提供新的理论依据。方法：(1)选择5-FU诱导的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/5-FU及其亲本细胞株MCF-7为研究对象,应用含21522个基因的人寡核苷酸芯片检测5-FU耐药细胞株MCF-7/5-FU与亲本细胞株MCF-7基因表达谱,筛选耐药相关基因。并且,通过实时定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)对部分差异基因mRNA表达水平进行验证。通过WesternBlot检测β-catenin蛋白在胞浆、核中分布情况。(2)构建人GSK3B基因的慢病毒重组表达载体,通过293T细胞包装,经过浓缩纯化获得高滴度病毒颗粒后,体外病毒感染耐药细胞MCF-7/5-FU,建立GSK-3β高表达细胞系。通过Western Blot、qRT-PCR、MTS检测GSK-3β过表达细胞系相应基因表达以及药物敏感性的影响情况；构建靶向人CTNNB1基因(β-catenin)的RNAi慢病毒重组表达载体,经过包装、浓缩纯化获得高滴度病毒颗粒后,体外病毒感染耐药细胞MCF-7/5-FU,建立β-catenin低表达细胞系。通过Western Blot、qRT-PCR、MTS检测β-catenin(?)表达细胞系相应基因表达以及药物敏感性的影响情况。(3)通过Western Blot检测不同细胞系不同处理组细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关因子蛋白质水平的表达情况；通过实时定量PCR检测不同细胞系不同处理组细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关因子mRNA水平的表达情况；流式细胞术分析不同细胞系不同处理组细胞周期和凋亡的变化情况；通过免疫荧光实验观察β-catenin(?)(?)NF-кB蛋白核移位情况；通过报告基因共转染试验检测(?)GSK3B基因对BCRP启动子的活性调节；并通过EMSA、ChIP实验进一步分析NF-кB对BCRP启动子区域的直接结合情况。结果：(1)通过基因芯片技术检测5-FU诱导的乳腺癌耐药细胞株MCF-7/5-FU与亲本细胞株MCF-7基因表达谱,得到了两组乳腺癌细胞株差异表达的基因,并初步筛选出在两个细胞株中明显差异表达的基因共有635个,其中217个基因在5-FU耐药细胞株中上调,418个基因下调。上调基因主要有Bcl-2、BIRC5 (Survivin)、ABCG2 (BCRP)、LEF1等,下调的基因主要是GSK3B(GSK-3β)、CDH1 (E-cadherin)等。功能涉及不同的分子功能分类,参与多个生物学过程,主要涉及到细胞调亡、细胞骨架及信号传导、细胞增殖、分化及周期调控、膜运输蛋白、DNA修复、基因转录与翻译、细胞粘附以及细胞侵袭与转移等方面。(2)运用实时定量PCR技术对部分差异表达在2倍以上的GSK3B、CDH1、LEF1、ABCG2等基因进行mRNA水平的验证,结果显示实时定量PCR结果与芯片结果具有良好的一致性,进一步证实了芯片结果的可靠性,对筛选策略的有效性提供了一定的实验支持。(3) Western Blot结果显示MCF-7/5-FU细胞中β-catenin,总蛋白表达水平与MCF-7细胞相比无明显改变；但是MCF-7/5-FU细胞核内β-catenin与MCF-7细胞相比明显增加。经LiCl处理后的MCF-7/5-FU细胞核内P-catenin蛋白增加更加明显。(4)成功构建了GSK3B基因过表达和CTNNB1基因干扰慢病毒重组载体,包装纯化后的病毒颗粒分别感染MCF-7/5-FU细胞后经过Puromycin和G418抗性筛选培养获得GSK-3β高表达系MCF-7/5-FU/GSK(?)β-catenin氐表达系MCF-7/5-FU/siCAT。(5) GSK-3β过表达包装病毒和β-catenin干扰包装病毒分别感染MCF-7/5-FU能部分逆转MCF-7/5-FU细胞多药耐药性。MCF-7/5-FU/GSK组与对照组相比对5-FU、THP、Mit和Taxol药物敏感性分别提高了4.06、2.12、3.01和2.00倍。MCF-7/5-FU/siCAT组与对照组相比对5-FU、THP、Mit(?)Taxol药物敏感性分别提高了3.80、2.52、2.62和2.06倍。两者差异具有统计学意义(p<0.05)。(6)流式分析结果显示MCF-7/5-FU细胞与亲本细胞MCF-7细胞相比G0/G1期细胞数增加,S期变化无差异,凋亡率减少。GSK-3β过表达和β-catenin基因干扰慢病毒感染组与未感染组相比G0/G1期细胞数下降,S期变化不明显,凋亡率明显增加；LiCl预处理组与未处理组相比G0/G1期细胞数增加,凋亡率下降。(7) Western Blot结果显示MCF-7/5-FU细胞中Survivin、Bcl-2和BCRP的蛋白表达水平明显高于MCF-7细胞组；NF-кB总蛋白表达水平无明显改变；但是MCF-7/5-FU细胞核内NF-кB蛋白与MCF-7组相比明显增加,LiCl预处理组NF-кB蛋白核内表达增加更加明显。GSK-3β过表达和β-catenin基因干扰病毒感染组与未感染组相(?)BCRP的蛋白表达水平显着下降。LiCI预处理组细胞与未处理组相(?)BCRP蛋白表达水平增加明显,NF-кB活性抑制剂MG132处理后BCRP蛋白表达下降。Real-time PCR检测结果与Western Blot结果基本一致。(8)应用免疫荧光技术检测β-catenin(?)NF-κB蛋白,MCF-7/5-FU组与MCF-7组相比出现蛋白核移位现象。LiCl处理组蛋白核移位更加明显。(9)GSK-3p过表达质粒与BCRP启动子报告质粒共转染MCF-7/5-FU细胞可明显降低BCRP启动子活性；当加入NF-κB活性抑制剂MG132处理后BCRP启动子活性降低程度更加明显；而加入LiCl抑制剂处理后BCRP启动子活性增强。凝胶迁移电泳分析(EMSA)结果显示NF-κB可以与位于BCRP启动子上的NF-κB(p50)结合位点结合。染色质免疫沉淀实验(ChIP)进一步证实了转录因子NF-κB(p50)可以直接结合于BCRP基因启动子区的NF-κB(p50)结合位点上。上述实验结果说明GSK-3β可调节BCRP基因的表达,可能通过NF-κB(p50)活性抑制来实现对BCRP基因的负向调控作用。结论：(1)获得乳腺癌多药耐药基因表达谱,差异基因涉及到细胞调亡、细胞骨架及信号传导、细胞增殖、分化及周期调控、膜运输蛋白、DNA修复、基因转录和翻译、细胞粘附以及细胞侵袭与转移等多种遗传学改变。(2)分别建立了慢病毒感染的GSK-3β高表达以及β-catenin低表达的乳腺癌细胞亚系MCF-7/5-FU/GSK和MCF-7/5-FU/siCAT,为乳腺癌耐药机制的研究提供了很好的细胞模型。(3) Wnt/β-catenin信号通路的激活在乳腺癌细胞多药耐药中起着非常重要的作用。其主要是通过调节NF-кB活性：一方面影响细胞周期和凋亡,另一方面通过调节一些膜蛋白的表达。这可能是Wnt/β-catenin信号通路介导5-FU诱导的乳腺癌耐药细胞株MCF-7/5-FU产生多药耐药的重要机制之一。(4)细胞内的转录因子NF-кB在Wnt/β-catenin通路调节细胞生长和耐药性过程中发挥着重要作用。为确立和完善细胞多药耐药的产生机制并为进一步的基因分析和基因治疗提供新的思路。(5) Wnt/β-catenin信号通路及其介导的相关信号网络,为全面阐明肿瘤化疗耐药的机制提供重要线索,提示Wnt/β-catenin通路中某些相关基因如GSK-3β、β-catenin等有望成为临床预测包含5-FU化疗方案化疗效果的标志物及其干预可作为临床逆转肿瘤多药耐药的重要手段之一。
张玲[6]2008年在《环氧合酶-2在乳腺癌组织中的表达及其与肿瘤多药耐药关系的研究》文中研究指明目的:通过观测环氧合酶-2(cox-2)抑制剂尼美舒利(nimesulide)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的化疗药物敏感性及其对P-gp,MRP1表达的影响,探讨cox-2对乳腺癌多药耐药(MDR)的调节作用。方法:以乳腺癌细胞株MDA-MB-231为研究对象,用MTT法研究cox-2抑制剂nimesulide单独及联合不同浓度的丝裂霉素(MMC)对MDA-MB-231的抑制作用(IC50),流式细胞技术检测细胞凋亡率及cox-2、P-gp,MRP1的表达变化。结果:MMC单独作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MMC对细胞的IC50(半数抑制浓度)为8.59±1.16,25μmol/L的nimesulide与MMC联合作用,IC50减少(5.89±0.66),差异有统计学意义,P=0.002,50μmol/L的nimesulide与MMC联合作用,IC50进一步减少(3.31±0.30),与25μmol/L比较,差异有统计学意义,P=0.003,说明nimesulide能增加MMC对MDA-MB-231的化疗敏感性,这种作用与nimesulide呈剂量依赖性。流式细胞仪分析发现,nimesulide可诱导细胞凋亡,且随着浓度的增加,凋亡率也随之增加(0.13±0.15→29.2±0.95),差异有统计学意义,F=44.84,P=0.000。nimesulide作用于MDA-MB-231细胞后,cox-2、P-gp、MRP1的表达同时下降,cox-2的表达由70.37±1.98降低为9.60±2.11,P-gp的表达由14.13±2.63降低为0.43±0.15,MRP1的表达由4.60±1.45降低为0.33±0.32,差异均有统计学意义。结论:nimesulide能明显增加MMC对乳腺癌细胞株MDA-MB-231的3化疗敏感性,cox-2与肿瘤多药耐药(MDR)密切相关,且可能通过P-gp,MRP1来实现。
景璇璇[7]2015年在《β-arrestin2通过调控多药耐药基因1（MDR1）的表达影响乳腺癌多药耐药的相关性研究》文中认为[研究背景]乳腺癌严重威胁着女性的身体健康,化疗是其非常有效的治疗手段。然而,在乳腺癌临床化疗过程中,逐渐出现的多药耐药严重阻碍了化疗的成功。多药耐药,即肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现抗药性的同时,对其他结构、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生抗药性。多药耐药的机制非常复杂,人类多药耐药基因1(MDR1)编码的p-糖蛋白(MDR1/p-gp)的过表达是其最主要的机制之一。P-gp是一种镶嵌于细胞膜上的泵蛋白,该蛋白过度表达可以导致化疗药物从肿瘤细胞中外排增强,降低了细胞内有效药物浓度,从而使肿瘤细胞对于化疗药物表现出抵抗性。现如今,尽管已开发了多种针对MDR1/P-gp的抑制剂及调节剂,但其毒性及副作用限制了其临床应用,并未取得非常满意的治疗效果。近年来,基于调控P-糖蛋白转录的信号通路的分子靶向治疗,或许可以为逆转肿瘤的多药耐药带来新的希望。β-抑制蛋白,包括β-arrestin2β-arrestin2,是一种广泛分布在各种组织和细胞的多功能蛋白,其经典的功能是介导G蛋白耦联受体(GPCR)的脱敏和内吞。此夕,β-arrestin2还可以结合其他信号分子,调节这些分子的磷酸化、泛素化或者细胞内定位等,从而调控相应的信号通路。最近很多的研究表明β-arrestin2在很多病理过程中发挥重要作用,尤其是广泛参与很多恶性肿瘤的演进过程。Mistre Alemayehu等研究发现β-arrestin2直接调节乳腺癌MDA-MB-231细胞中LPA诱导的侵袭和迁移过程。Buchanan等也发现β-arrestin2可以调节大鼠结肠癌的转移过程。此外,在乳腺癌中,β-arrestin2也可以通过caspase-8通路发挥抗凋亡作用。我们最近的研究发现,β-arrestin2还可能参与调节乳腺癌中MDR1/p-gp介导的多药耐药。我们发现在乳腺癌临床标本中β-arrestin2与MDR1/p-gP的表达密切相关。同时,我们检测了β-arrestin2在乳腺癌敏感细胞系ADM以及耐药细胞系MCF-7和MDA-MB-231中的表达,发现其在耐药细胞中的蛋白和mRNA水平均高于敏感细胞。因此我们推测β-arrestin2可能参与乳腺癌的多药耐药过程,从而干扰β-arrestin2可以逆转乳腺癌化疗过程中出现的多药耐药。[研究方法]1.分别用Q-PCR及Western blot的方法检测3种乳腺癌细胞系ADM,MCF-7以及MDA-MB-231中β-arrestin2与MDR1/p-g的表达情况。2.乳腺癌敏感细胞MCF-7及MDA-MB-231分别给予浓度为0,1μmol/L, 2.5μmol/L,和5μmol/L的阿霉素作用72h后提取细胞总蛋白进行western blot检测β-arrestin2及MDR1蛋白水平表达的改变。3.收集临床乳腺癌标本进行β-arrestin2与MDR1/p-gp的免疫组化染色,并分析两者之间的关联性。4.设计并合成针对β-arrestin2基因的双链干扰RNA序列以及非靶向性干扰序列作为阴性对照,将其定向插入到质粒载体pSUPER.neo+GFP中,构建稳定表达载体pSUPER-sip-arrestin2和pSUPER-siNC;pCDNA3.1-β-arrestin2-GFP全长表达载体由美国东田纳西大学尹德领教授惠赠。5.上述质粒载体分别转染3种乳腺癌细胞,继续培养48-72小时后,分别用Q-PCR和Western blot检测各组细胞中β-arrestin2与MDR1/p-gp在mRNA和蛋白水平的表达情况。应用MTS法检测各组细胞对阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、顺铂的半数细胞致死量的改变。[实验结果]1.对3种乳腺癌细胞系检测发现β-arrestin2在耐药细胞ADM中无论mRNA水平还是蛋白水平均较2种敏感细胞明显升高,而4DR1/P-gp仅在ADM细胞中高表达,敏感株中几乎不表达。2.MCF-7及MDA-MB-231细胞经阿霉素诱导后通过、检测发现,vestem blot的蛋白水平呈浓度依赖性升高。β-arrestin2及MDR13.对临床收集的106例乳腺癌样本,用免疫组织化学染色检测和β-arrestin2的表达,经过分析二者MDR1/P-gp相关系数为0.227,呈低度相关性且有Pearson显着意义P=0.016。4.转染48h后,应用Q-PCR检测各组细胞中β-arrestin2和MDR1 mRNA水平的表达情况,结果显示：与对照组相比,β-arrestin2干扰组的β-arrestin2及MDR1 mRNA水平均明显降低。Western blot检测结果表明β-arrestin2干扰组细胞2种蛋白的表达水平也明显降低。5.MTS法检测各组乳腺癌细胞对4种化疗药物的耐受性,发现β-arrestin2干扰组细胞对阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和顺铂的半数细胞致死量(IC50值)明显降低,耐药性被不同程度逆转。[结论]β-arrestin2与MDR1在乳腺癌细胞及组织中的表达具有一定的相关性,提示β-arrestin2可能通过调控MDR1的表达间接影响乳腺癌的多药耐药。干扰或过表达β-arrestin2可以抑制或促进MDR1的表达,从而影响细胞对化疗药物的耐受性。提示β-arrestin2有可能成为逆转多药耐药的靶点。
柴洁[8]2012年在《乳腺癌多药耐药与HER-2基因表达相关性研究》文中研究说明目的探讨乳腺癌组织中多药耐药指标P-糖蛋白(P170)、胚胎性谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)和DNA拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)与人表皮生长因子受体2(HER-2)基因表达的相关性及临床意义。方法乳腺癌组织48例。采用荧光原位杂交法(Fluorescence in situ hybridization, FISH)检测HER-2基因的表达；采用免疫组化法(Immunohistochemistry, IHC)检测已知HER-2基因表达情况的乳腺癌病例标本中P170、GST-π和TOPOⅡ的表达情况；分析叁者与临床病理因素(年龄、原发肿瘤大小、有无淋巴结转移)的关系及与HER-2基因的相关性。应用SPSS13.0统计学软件行X~2检验及Spearman相关性检验,显着性检验水准α=0.05(双侧)。结果48例乳腺癌中HER-2基因表达者阳性为22例(45.8%)。P170、GST-π、TOPOⅡ阳性表达率分别为43.8%(21/48)、39.6%(19/48)、56.3%(27/48)。P170、GST-π、TOPOⅡ表达与年龄、原发肿瘤大小、淋巴结转移无关(P>0.05)。P170、GST-π、TOPO表达率在HER-2阳性病例中明显高于HER-2阴性的病例(P<0.05)。P170、GST-π、TOPO表达与HER-2基因表达存在相关性(P<0.05)。结论P170、GST-π、TOPOⅡ表达与HER-2呈正相关,均可作为临床上检测及指导治疗的重要指标。
张海嫦[9]2012年在《P-gp参与耐药乳腺癌细胞侵袭与转移的分子机制研究》文中提出目的：越来越多的证据表明在肿瘤的发生发展过程中,耐药和转移的发生可能不是两个孤立的过程,两者之间存在一种功能上的联系。前期实验发现应用RNA干扰技术降低Anxa2的表达量后耐药乳腺癌细胞的转移能力明显降低。说明Anxa2表达升高可能是耐药乳腺癌细胞转移能力增强的重要原因。众所周知,肿瘤耐药的发生80%是由P-glycoprotein(P-gp)介导的。我们实验室前期实验表明在乳腺癌耐药细胞中,Anxa2的表达随着MDR1的升高而同步升高,免疫荧光检测也证实两种蛋白之间存在良好的共定位,我们推测P-glycoprotein和Anxa2的相互作用促进耐药乳腺癌细胞的转移。本研究应用免疫共沉淀、免疫荧光、Westren blotting、ShRNA等多种实验技术,研究P-glycoprotein的表达和活性改变对Anxa2的表达和酪氨酸磷酸化的影响,并深入探讨这种协同作用促进耐药肿瘤细胞转移能力的分子机制。方法：1.采用RNA干扰技术使人多药耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞中P-glycoprotein蛋白的表达水平下降,并用Westren blotting技术验证其表达水平。2.应用噻唑蓝(MTT)比色法实验检测P-glycoprotein降表达对MCF-7/ADR细胞增殖能力的影响,以及细胞对阿霉素的敏感性。3.流式细胞术用来检测P-glycoprotein抑制剂是否对P-glycoprotein泵的活性有效。4.应用体外迁移和侵袭实验检测P-glycoprotein表达水平下降后对多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR体外迁移和侵袭能力的影响。5.免疫共沉淀技术用来检测P-glycoprotein和Anxa2的相互作用,同时采用免疫荧光技术来观察二者在细胞内的共定位情况,再结合划痕实验进一步分析二者对细胞迁移的影响6.应用Westren blotting和免疫共沉淀技术来研究ERK1/2信号通路和Anxa2的酪氨酸磷酸化的变化,从而探讨这种协同作用促进耐药肿瘤细胞的转移能力增强的分子机制。结果：1.应用RNA干扰技术,按照转染试剂的说明书转染MCF-7/ADR细胞后,筛选到叁株稳定的P-glycoprotein降表达的单克隆细胞。2. P-glycoprotein降低表达后MCF-7/ADR的增殖能力无明显改变,但其耐药能力都有明显的下降。3.体外侵袭实验结果表明P-glycoprotein蛋白表达水平下降后MCF-7/ADR的迁移和侵袭能力明显被抑制。4.免疫共沉淀技术发现P-glycoprotein和Anxa2在MCF-7/ADR细胞中存在相互作用,应用免疫荧光技术发现二者在细胞膜上存在良好的共定位。划痕实验也表明二者共定位于划痕边缘的细胞膜上。5. Westren blotting实验结果显示在MCF-7/ADR细胞中无论是降低P-glycoprotein的表达还是抑制其活性,都影响了阿霉素诱导的ERK1/2的磷酸化。6.免疫共沉淀检测发现P-glycoprotein能调节Anxa2的酪氨酸磷酸化水平。结论：1.在多药耐药MCF-7/ADR细胞中,P-glycoprotein和Anxa2存在相互作用并且在细胞膜上存在良好的共定位。2. P-glycoprotein表达水平降低和抑制其活性后,MCF-7/ADR细胞的迁移能力明显下降,体外侵袭能力也明显减弱。3.进一步的机制研究结果显示：在多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR中P-glycoprotein通过调节Anxa2的酪氨酸磷酸化和激活ERK1/2通路来促进肿瘤细胞的体外迁移和侵袭能力。进一步说明肿瘤耐药和转移的发生不是一个孤立的事件,两者之间存在功能上的相关性。
张慧[10]2012年在《干扰FZD1逆转Wnt/β-catenin通路介导的乳腺癌细胞多药耐药的研究》文中研究表明[研究背景]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,且发病率仍在不断升高,严重危害世界女性健康。作为对化疗比较敏感的实体瘤之一,化疗是其不可替代的治疗手段,然而乳腺癌多药耐药的出现成为导致乳腺癌化疗失败的重要原因。多药耐药也称交叉耐药,即肿瘤对一系列结构、靶点和作用机制不同的药物均产生耐药性,其发生涉及多重机制。MDR1基因编码的P-糖蛋白(MDR1/P-gp),作为ATP结合盒膜转运蛋白超家族的成员,可通过水解ATP获得能量将进入细胞内的药物泵出,降低药物的浓度及毒性,介导多种肿瘤的多药耐药。P-糖蛋白介导的多药耐药约占乳腺癌多药耐药的55%,因此对MDR1/P-gp进行干预成为逆转乳腺癌的化疗耐药的重要途径。尽管已开发了多种针对MDR1/P-gp的抑制剂及调节剂,但治疗浓度的毒性及副作用限制了其应用；免疫学治疗、中药等天然药物治疗以及基因治疗也未能完全逆转耐药。近年的临床前研究中基于调控P-糖蛋白转录的信号通路的分子靶向治疗崭露头角。Yamada等在结肠癌中的研究表明,人类MDR1基因启动子区包含多个Tcf4/LEF:结合基序,MDR1是β-catenin/Tcf4/LEF转录复合物的直接靶基因,抑制Wnt/β-catenin信号传导通路可下调MDR1的表达。Wnt/β-catenin信号通路对多种肿瘤发生发展均起重要调控作用,其中包括乳腺癌。β-catenin蛋白是通路的核心,Wnt信号蛋白与膜表面的Frizzled受体结合使通路活化,大量β-catenin进入细胞核内,与TCF/LEF结合形成β-catenin/TCF/LEF转录复合物,从而调节下游靶基因的转录。研究者已发现Wnt蛋白的受体Frizzled (FZD)1/2在乳腺浸润性导管癌中过表达,作为Wnt/β-catenin通路必不可少的组成元件,其表达的改变可影响通路的调控。近年有报道证实,FZD1在神经母细胞瘤中可通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控MDR1的表达影响神经母细胞瘤化疗耐药。我们检测了FZD1在乳腺癌敏感细胞MCF-7和MDA-MB-231以及多药耐药细胞MCF-7/ADM中的表达,发现其在多药耐药的ADM细胞中无论mRNA水平还是蛋白水平均显着高于敏感株。对敏感株给予不同浓度阿霉素进行诱导,72h后检测FZD1及MDR1mRNA水平的表达,发现在低至中浓度阿霉素诱导下二者均明显升高,提示FZD1及Wnt/β-catenin通路在乳腺癌细胞获得性多药耐药的发生发展中的潜在作用。因此在本研究中我们设计小干扰RNA (siRNA)载体转染乳腺癌耐药细胞后沉默FZD1以期下调MDR1/P-gp1的表达、逆转多药耐药性并探讨Wnt/β-catenin通路在其中的调控作用。[研究方法]1.分别用RT-PCR及Western blot方法检测实验室培养的3种乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及多药耐药细胞MCF-7/ADM中FZD1及MDR1基因的表达情况。并分别将敏感细胞MCF-7、MDA-MB-231转染含MDR1全长cDNA序列的载体SF91m3PRE以获得耐药细胞MCF-7/MDR、MDA-MB-231/MDR。2.敏感细胞MCF-7及MDA-MB-231分别给予浓度为0,0.2,1,5μM的阿霉素作用72h后提取细胞总RNA进行实时荧光定量PCR检测FZD1及MDR1mRNA水平表达的改变。3.分别设计并合成针对FZD1基因的双链干扰RNA序列以及作为对照的非靶向性干扰序列,将其定向插入到质粒载体pSUPER.neo+GFP中,构建稳定表达载体pSUPER-siFZD1和pSUPER-siNotarget。酶切及测序鉴定正确后,大量扩增。4.上述干扰质粒载体分别转染3种多药耐药细胞中,培养48h后,通过RT-PCR检测各组细胞中FZD1mRNA和MDR1mRNA的表达情况,应用Western blot检测FZD1蛋白和P-糖蛋白表达情况,应用罗丹明外排实验流式细胞术检测P-糖蛋白外排功能,应用MTT法检测各组细胞对阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和顺铂的半数细胞抑制浓度(ICso)及相对耐药指数(RR)的改变,评价FZD1干扰对细胞多药耐药性的影响。分别提取细胞浆蛋白及核蛋白,应用Western blot方法检测胞浆及胞核中β-catenin蛋白的表达情况,揭示Wnt/β-catenin通路在其中的调控作用。5.对转染后的ADM siFZD1细胞以G418筛选培养出稳定表达细胞后再转染MDR1全长载体SF91m3PRE,观察由FZD1干扰所致的耐药性改变能否被逆转。[实验结果]1.对本实验室培养的3种乳腺癌细胞系检测发现FZD1在耐药细胞ADM中无论mRNA水平还是蛋白水平均较2种敏感细胞明显升高,而MDR1/P-gp仅在ADM细胞中高表达,敏感株几乎不表达。2.MCF-7及MDA-MB-231细胞经阿霉素诱导后检测发现,在MCF-7细胞中,低中浓度(0.2μM,1μM)阿霉素作用下FZD1及MDR1mRNA水平均呈浓度依赖性升高；在致死剂量(5μM)作用下,FZD1水平下降而MDR1继续升高；MDA-MB-231细胞中,FZD1及MDR1水平则一直呈浓度依赖性升高。3.转染48h后,应用半定量RT-PCR检测各组细胞中FZD1和MDR1mRNA水平的表达情况,结果显示：与转染非靶向性siRNA的对照组相比,FZD1干扰组的FZD1及MDR1mRNA水平均明显降低。Western blot检测结果表明FZD1干扰组细胞2种蛋白的表达水平均明显降低,而胞浆及胞核中β-catenin蛋白也较对照组有明显降低。罗丹明外排实验显示,耐药细胞中罗丹明荧光含量均远低于对应的敏感细胞,而FZDl干扰后荧光含量与对照组相比均显着升高,荧光强度曲线峰值明显右移,P-gp外排功能降低。MTT法检测细胞对4种化疗药物的耐受性,发现FZD1干扰组细胞对阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和顺铂的IC50明显降低,相对耐药指数显着下降,耐药性被不同程度逆转。而ADM siFZD1稳定表达细胞转染SF91m3PRE重新过表达MDR1后这一逆转又被颠覆,敏感性再次下降,证明FZD1干扰后发生的上述耐药性改变确为下调MDR1所致。[结论]1.FZD1与MDR1在乳腺癌多药耐药细胞中均呈高表达且阿霉素诱导可致二者均升高,提示FZD1与MDR1介导的获得性多药耐药相关。干扰FZDl可以抑制MDR1的表达,从而显着降低细胞多药耐药性。2.干扰FZD1后细胞浆、细胞核中β-catenin蛋白表达降低,表明Wnt/β-catenin通路被抑制,提示FZD1干扰对乳腺癌细胞耐药性的逆转是由Wnt/β-catenin通路介导的。3.FZDl可通过调控Wnt/β-catenin信号通路介导乳腺癌多药耐药,并有望成为潜在的提示乳腺癌化疗敏感性的指标及逆转耐药的靶点。
参考文献：
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[4]. RY10-4逆转乳腺癌多药耐药性及其抗肺腺癌活性研究[D]. 薛娉娉. 华中科技大学. 2016
[5]. Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌多药耐药中的作用及机制研究[D]. 王学东. 中南大学. 2011
[6]. 环氧合酶-2在乳腺癌组织中的表达及其与肿瘤多药耐药关系的研究[D]. 张玲. 苏州大学. 2008
[7]. β-arrestin2通过调控多药耐药基因1（MDR1）的表达影响乳腺癌多药耐药的相关性研究[D]. 景璇璇. 山东大学. 2015
[8]. 乳腺癌多药耐药与HER-2基因表达相关性研究[D]. 柴洁. 青岛大学. 2012
[9]. P-gp参与耐药乳腺癌细胞侵袭与转移的分子机制研究[D]. 张海嫦. 天津医科大学. 2012
[10]. 干扰FZD1逆转Wnt/β-catenin通路介导的乳腺癌细胞多药耐药的研究[D]. 张慧. 山东大学. 2012
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