外泌体生物学功能及其应用专利技术综述
吴丹阳 张 强（等同第一作者）
（国家知识产权局专利局专利审查协作天津中心，天津 300300）
摘 要： 针对外泌体的国内外专利文献进行检索、收集、统计及分析综述了外泌体生物学功能及其应用的专利申请量、申请人分布及国别分布的特点，详细分析了外泌体免疫功能的主要技术路线，并对干细胞外泌体的应用、外泌体作为药物载体以及进行疾病诊断的专利申请进行分析，对其技术发展脉络和技术研发的热点进行介绍。
关键词： 外泌体；诊断；载体；干细胞；治疗肿瘤
外泌体（exosome）亦称为胞外体、外源体，是一种来源于晚期内涵体的直径 20-170nm的小囊泡。外泌体是由多囊泡体与细胞膜融合后向胞外分泌的囊泡，具有脂质双分子层结构。外泌体不仅携带自身的标记蛋白，同时也拥有反映细胞来源的组织/细胞类型特异性蛋白，此外还含有各种mRNA、microRNA及siRNAs等。近年来，因其在疾病诊断和治疗等领域的潜力而受到研究者的广泛关注。
1 专利申请趋势分析
为了研究外泌体生物学功能以及研究进展的专利技术的发展情况，结合实际审查工作经验，综合使用多种检索策略，利用S系统的统计命令和Excel对该领域的专利申请数据进行统计分析，本次专利分析的检索数据包括截止到2017年12月31日公开的专利申请。
1.1 国内历年专利申请数量趋势分析
从外泌体在中国历年专利申请量情况可以看出，外泌体进入中国是1998年，1998年至2008年这段期间主要是国外PCT进入中国申请专利研究，是属于外泌体发展的一个萌芽期，而随着2009年到2013年开始国内的高校和生物技术公司介入对外泌体的功能研究，从2014年到2017年是国内外泌体的一个爆发期，这种现象通过市场分析可以看出一些医院开始介入对外泌体的疾病诊断以及治疗疾病作为研究对象，在外泌体的诊断试剂相关的专利申请量增加，因此从上述国内历年专利申请量的趋势图可以看出外泌体的申请量仍会在最近几年持续增长。
当前，我国的农业技术推广在农业经济发展中已取得了明显成效，但与发达国家相比还是存在不小的差距。就科技成果而言，其推广力度不够、效率不高、实践性不强，需要进一步加大宣传。
1.2 国内主要申请人及申请人类型、技术构成分析
通过对国内申请人进行统计分析，可发现排名前十位中，有三家中国人民解放军医院，对其的技术构成分析发现其主要申请与外泌体作为生物标记进行疾病的早期诊断试剂的相关专利，可见在生物医学相关的生化和分子生物学检测在外泌体分析的层面上开启一个全新的维度。其次，在前十位申请人中有三家生物生物技术公司，主要研发干细胞来源的外泌体的应用。此外还有三家国内高校，申请主要为外泌体的免疫功能以及相关的分子标记物。从申请人类型分析企业占据着42%的申请量，高校以及科研单位占比32%，机关团体占比18%，而该领域也存在一些个人申请，占比8%。
2 专利技术发展
2.3.1 HCC 结果(表2、表3)显示：388例HCC患者中，肿瘤大小、肿瘤数目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦与否)是影响术后总体生存的独立因素(P<0.05)；肿瘤数目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦与否)是影响术后复发的独立因素(P<0.05)。
通过对国内外泌体专利申请的分析，发现国内专利申请主要分布五个方面，其中利用外泌体中作为疾病诊断的标记物申请量最多，其次，干细胞来源的外泌体的申请量排列第二，随后，对外泌体的制备方法申请量紧随对干细胞来源的外泌体的申请量，外泌体在免疫功能的研究以及作为药物载体靶向细胞运输药物的申请量偏少。对外泌体的免疫功能申请量最少，这可能因为不同肿瘤细胞来源的外泌体是增强免疫还是引起耐受，是促进增殖还是诱发凋亡，其内在机制仍需要深层次研讨。下面对外泌体的免疫功能、干细胞来源的外泌体，作为药物载体靶向细胞，疾病早期诊断进行重点分析。
2.1 外泌体的免疫功能
外泌体作为药物载体，可防止其在传递过程中被环境中的酶类物质分解或破坏，具有较强的免疫原性，不会引起排斥反应，不易受损，可以定向地将活性分子运送到特定的细胞中，可以高效地通过细胞膜屏障将携带的活性分子运送到发挥生物学作用的靶位点。迄今为止，通过专利分析，利用用外泌体作为药物载体所载运的药物主要包括基因类药物例如干扰RNA，还有一些抗肿瘤、抗癌的化学药物以及能增强免疫的抗原、或杀伤肿瘤的抗体。据统计，外泌体承载的基因类药物占比50%，对于承载免疫原性的抗原或抗体占比30%，利用外泌体承载化学药物占比20%。CN201080066281公开了一种由于含有干扰核糖核酸的细胞微粒子能够稳定、高效、特异性地输送干扰核糖核酸，因而可用于治疗相关疾病。外泌体不仅可以有效转运miRNA，还可以承载其他抗癌、抗病毒药物的潜能，例如CN201110321620公开了以外泌体为基础的运送疏水性抗癌药物制剂，CN201510015644公开了跨膜蛋白包装的外泌体制备抗登革病毒感染药物。此外，外泌体的递送为高免疫原性疫苗的发展开创了新的平台，CN201480017087公开了利用动物囊泡呈递与靶向疾病相关的抗原进行特异性的适应性免疫应答，由此可见以外泌体作为药物载体进行体内肿瘤治疗具有诱人的应用前景。
2.2 干细胞外泌体的治疗
干细胞主要包括胚胎干细胞、诱导性多能干细胞以及成体干细胞，其中成体干细胞中的间充质干细胞的外泌体进行专利申请的数量最多，占比81%。进一步地，对间充质干细胞来源的外泌体在疾病类型进行分析得出利用间充质干细胞来源的外泌体可以用于治疗多种疾病，例如视网膜病变、肝脏衰竭、皮肤病、心血管病、肺纤维化、脊椎炎等。如CN200980114014公开了间充质干细胞来源的外泌体可以用于治疗心力衰竭,CN201010226049公开了脐带间质干细胞来源外泌体可用于临床治疗肝、肾及皮肤损伤。CN201280019239公开了利用人间充质干细胞外来体用于治疗肺部疾病。CN201710346752公开了利用间充质干细胞的外泌体能够促进损伤皮肤组织的结构重建与再生修复，促进创面愈合。由于现有技术中间充质干细胞移植存活率低及长期临床应用存在致瘤隐患等不足使得其临床应用受到限制，因此，利用间充质干细胞的外泌体相比利用间充质干细胞治疗操作更加简单、安全有效。
2.3 药物载体
肿瘤细胞胞外体呈递抗原用于治疗癌症，而近年来却有相关实验显示，一些肿瘤来源的exosomes可以抑制在肿瘤中发挥作用的免疫细胞，在肿瘤的免疫治疗中起到一些负面作用，因此，如何提高肿瘤细胞来源exosomes的免疫刺激能力，而减少它的免疫抑制能力在肿瘤的免疫治疗中有重大的实际意义。CN2014100759248利用普鲁卡因联合MS-275处理肝癌细胞系H22细胞获得其分泌的exosomes，该药物组合物处理肝癌细胞系H22细胞分泌的exosomes能显著改善对淋巴细胞增殖功能的抑制作用。渐渐，研究人员发现不成熟DC的外泌体可以用于移植排异或者自身免疫性疾病的治疗，CN2014102296931公开了将髓源性DC用microRNA-146a mimics干扰其成熟，能用于移植排异或者自身免疫性疾病的治疗。进一步，CN201510072238发现了粒细胞样髓源性抑制细胞可以用于抑制自身免疫性疾病，这为外泌体用于治疗自身免疫疾病提供了新的细胞来源。
目前花椒精油的提取方法已有多种，常见的不仅有传统的水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法和超声辅助萃取法，而且还有新发展及改进的水蒸气蒸馏法、超临界萃取法等。由这些方法得到的花椒精油的主要成分虽然大致相同，但因提取方法的差异和研究材料的不同，都导致了最终精油的提取效率、化学成分和其含量具有一定的差异[8，9]。同时，通过对提取工艺进行优化，还可以明显提高花椒精油的产量。
2.4 外泌体与疾病的诊断
外泌体不仅可以反映来源细胞的内容物，还可体现来源细胞的生理病理状态，因而利用外泌体作为生物标记物不仅来源易得、检测方便、变化较早、伤害较小，且由于外泌体膜与来源细胞的细胞膜具有同源性，故利用细胞膜上大量富集的蛋白进行免疫分选能提高诊断率。外泌体可以作为癌症以及其它疾病的肿瘤标志物，从患者血清或尿液中分离外泌体用于早期临床诊断，其中癌症包括卵巢癌，胶质瘤，乳腺癌，肝癌，食管癌，肺癌，直肠癌，胃癌为主，除了上述肿瘤标记物，对其他疾病类型例如内分泌疾病，神经系统疾病，心血管疾病都可以早期临床诊断。
3 总结与展望
在各种生理和病理过程中，外泌体通过与受体细胞特异性结合并传递各种信息从而发挥了重要的生物学作用，进一步深入研究外泌体独特的生物学功能和应用，不仅为各种疾病提供了一种安全便捷的早期诊断标记物，也为个体生物学治疗提供了一种靶向性策略。但是，对于外泌体的免疫功能研究主要集中在研制具有特定靶向的抗肿瘤疫苗，但其抗肿瘤作用具体是增强免疫还是引起耐受，是促进增殖还是诱发凋亡，其内在的机制仍需深层次探讨。虽然外泌体作为药物载体具有独特优势，但作为载体的靶向性较弱，如何在外泌体表面表达特异性肽需要更深层次研究。尽管利用外泌体作为生物标记物具有诸多可喜的优势，但仍需要注意，由于外泌体内载物含量较少，因此有效内容物的富集度决定了外泌体作为生物标记物的可行性，此外由于体液样本自身存在蛋白和RNA，以及体液中各种类型细胞来源外泌体也会成为混杂因素，因此外泌体的分离和纯化，外泌体来源细胞的筛选也非常关键。
参考文献
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中图分类号： Q25,N18
文献标识码： A
文章编号： 2096-4390（2019）14-0049-02
标签：外泌体论文; 诊断论文; 载体论文; 干细胞论文; 治疗肿瘤论文; 国家知识产权局专利局专利审查协作天津中心论文;