李艳琴, 申泉[1]2004年在《利用II型机制组成型分泌表达Harpin的生防工程菌的构建》文中提出基因工程生防菌的应用为植物病虫害的综合治理提供了一项具有广阔前景的重要手段。本文将梨火疫欧文氏杆菌中,利用III 型机制分泌的植物抗性诱导蛋白Harpin 克隆于诱导表达载体pExSec1 的金黄色葡萄球菌蛋白A 信号肽及ZZ 片段的后面,通过II 型机制在大肠杆菌中表达和分泌ZZ::Harpin 融合蛋白,为了使工程菌在植物表面能表达分泌Harpin,又将表达融合蛋白的基因克隆到组成型表达载体pKK233-2 上,并转化经典的生防菌成团泛菌308R,观察了重组生防工程菌的分泌表达、过敏反应活性以及遗传稳定性问题。
申泉[2]2004年在《利用Ⅱ型机制组成型分泌表达Harpin的生防工程菌的构建》文中指出基因工程生防菌的应用为植物病虫害的综合治理提供了一项具有广阔前景的重要手段。本文将梨火疫欧文氏杆菌中，利用Ⅲ型机制分泌的植物抗性诱导蛋白Harpin克隆于诱导表达载体pExSec1的金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽及ZZ片段的后面，通过Ⅱ型机制在大肠杆菌中表达和分泌ZZ：：Harpin融合蛋白，为了使工程菌在植物表面能表达分泌Harpin，又将表达融合蛋白的基因克隆到组成型表达载体pKK233-2上，并转化经典的生防菌成团泛菌308R，观察了重组生防工程菌的分泌表达、过敏反应活性以及遗传稳定性问题。 首先，根据GenBank中登录的hrpN序列设计引物，以携带着hrp基因簇的质粒pCPP430为模板扩增、克隆出植物抗性诱导蛋白Harpin的结构基因hrpN，与pGEM-T载体连接得到重组质粒pGEM-T-hrpN，酶切分离hrpN片段，克隆到利用Ⅱ型分泌机制分泌目的蛋白的诱导型表达型载体pExSec1上，得到重组质粒pExSec1-hrpN，采用CaCl_2化学转化法转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过IPTG诱导培养，制备CFEP和胞外无细胞培养上清液，观察重组菌的分泌表达及过敏反应活性。结果表明：利用Ⅲ型机制分泌的Harpin蛋白，其N端连接上信号肽和ZZ片段后，不仅在E．coli BL21(DE3)中能利用Ⅱ型机制表达分泌，而且在Harpin前加一段164个氨基酸的SZZ序列或ZZ：：Harpin融合蛋白依然有活性。 其次，以pExSec1-hrpN为模板扩增SZZ-hrpN基因，PCR产物克隆于pGEM-T载体，得到重组质粒pGEM-T-SZZ-hrpN，酶切分离SZZ-hrpN片段，克隆于组成型表达载体pKK233-2的trc启动子之后，并由此获得重组质粒pKK233-2-SZZ-hrpN。最终采用电击转化法导入成团泛菌308R。结果表明：重组生防工程菌308R(pKK233-2-SZZ-hrpN)可组成型表达ZZ：：Harpin融合蛋白，并能够在信号肽序列的带动下分泌到细胞外，且有过敏反应活性。 在构建生防工程菌的过程中，重组质粒的遗传稳定性和工程菌在植物表面的定殖能力是影响生防效果的重要因素之一。我们将重组生防工程菌308R(pKK233-2-SZZ-hrpN)在无抗生素的LB培养基中连续传代，检测其质粒遗传稳定性，并将工程菌喷洒于植物叶面，连续取样检测其定殖能力。结果表明：308R(pKK233-2-SZZhrpN)的质粒稳定性均比308R(pCPP430)略高，但是远低于带有parDE序列的308R(pRTnp)。因此，进一步提高308R(pKK233-2-SZZ-hrpN)的遗传稳定性可以为将来在没有抗生素标记选择压力下，生防工程菌的大规模发酵制备和在田间长期稳定发挥抗病效果奠定基础。
白艳[3]2007年在《胡萝卜软腐欧氏杆菌Harpin的基因克隆与表达》文中进行了进一步梳理植物过敏素Harpin为一种植物病原菌产生的蛋白质，能够在非寄主植物上诱导过敏反应，从而提高植物自身的系统抗病性，抵抗病原物引起的病害，所以可以作为一种重要的植物病害绿色防治农药。本文研究了胡萝卜软腐欧氏菌(Erwiniacarotovora)中的Harpin，构建基因工程生防菌，防治植物病害。首先克隆出胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜亚种Erwinia carotovora subsp．carotovora的菌株SE9中编码HarpinEcc9的基因hrpNEcc9，测序后利用相关生物学软件分别预测了HarpinEcc9的分子量和二级结构。结果显示：HarpinEcc9中不含半胱氨酸；疏水氨基酸和亲水氨基酸分布均匀；存在大量的无规则卷曲区域。因此，推测它具有一个简单并且柔韧性很强的开放式结构。同时，将HarpinEcc9与其他Harpin蛋白的核苷酸和氨基酸序列进行同源性比对，得出序列间差异，为以后研究Harpin的结构和功能关系奠定了基础。其次，将基因hrpNEcc9克隆到Ⅱ型分泌机制的诱导表达载体pExSecⅠ的金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽及ZZ片段后，得到重组质粒pES-hrpN，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌BL21(DE3)(pES-hrpN)。Harpin的N端连接ZZ序列后，形成ZZ-Harpin融合蛋白，在BL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达，信号肽引导，以Ⅱ型分泌机制分泌到胞外。过敏反应检测说明：ZZ序列不会影响Harpin蛋白的活性；融合蛋白对蛋白酶K敏感，对热不敏感，这与Harpin蛋白的特性是一致的。为了避免Harpin蛋白诱导表达对于生防工程菌田间应用的限制，从而持续诱导植物抗性，大大提高防病、抗病效果，本文尝试构建不需要诱导的组成型表达Harpin的重组菌。将pES-hrpN中的基因SZZ-hrpNEcc9，克隆到酶切后的组成型表达载体pCPP2139中，得到重组质粒pCS-hrpN，转化至大肠杆菌Ecoli DH5a，获得重组菌DH5a(pCS-hrpN)。通过研究发现重组菌可以在不需要诱导的情况下表达融合蛋白ZZ-Harpin。由于重组菌表达的融合蛋白ZZ-Harpin以包涵体形式存在于细胞内，上清CFEP和胞外均无目的蛋白，无法诱导植物过敏反应，所以将进一步研究构建合适的组成型表达Harpin的重组菌。
王钰[4]2009年在《表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌生防菌的构建》文中提出生物防治是植物病害综合治理体系中的一个重要组成部分,植物同病原菌互作的进化过程中形成的过敏反应是自然界中植物抵抗病原菌侵染的最有效方式。Harpin是一类植物病原细菌分泌的蛋白质,能诱导非寄主植物产生过敏反应,这种防卫反应的产生,可以抵抗多种多样的病原物对植物的第二次侵染,类似于人或动物的免疫系统。枯草芽孢杆菌本身无毒,对多种植物病原菌具有拮抗作用,是一种天然的植病生防菌。利用Harpin的诱导抗病性和生防菌的拮抗作用开发新型的生物农药具有重要的理论意义和应用价值。本实验将利用枯草芽孢杆菌来表达Harpin蛋白,期望获得一种既能诱导植物抗性又能与植物病原菌竞争、拮抗的多功能生防菌。为了能使Harpin蛋白分泌到培养基中,与植物细胞直接作用,诱导植物的防卫反应。首先,我们以枯草芽孢杆菌168总DNA为模板扩增组成型强启动子P43和分泌效率较高的nprB信号肽,通过重组PCR连接两片段,克隆至大肠杆菌和芽孢杆菌的穿梭载体pUBC19,构建组成型表达分泌载体pUBC-PS。其次,以新鲜制备的胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora subsp. carotovora)Se9总DNA为模板,设计引物扩增hrpNECC9基因,PCR产物克隆于表达载体pUBC-PS,获得重组质粒pUBC-PSh2,将重组质粒转入大肠杆菌DH5α,在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子-DH5a(pUBC-PSh2)。小量提取pUBC-PSh2质粒,采用碱金属转化法转入缺失8种蛋白酶基因的枯草杆菌WB800,在含有卡那霉素20μg/mL的LB平板上筛选工程菌,对其酶切、PCR验证结果表明：生防工程菌WB800(pUBC-PSh2)构建成功。SDS-PAGE分析表明：工程菌培养到72 h时,表达产物Harpin蛋白被分泌到细胞培养液中,表达量约占菌体蛋白总量的15%。由此证明,工程菌中的hrpNECC9基因在枯草杆菌P43启动子和nprB信号肽元件的带动下,不需诱导,实现了表达,并且,表达产物被分泌到胞外。生物活性检测和诱导植物抗病性分析结果表明：工程菌能够诱导烟草叶片产生过敏反应,并能提高番茄对早疫病菌的抗性。
李艳琴, 申泉, 白艳[5]2006年在《利用Ⅱ型机制分泌Harpin的生防工程菌的构建》文中提出植物对病原侵染形成过敏性反应是植物本身的一种主动反应,是自然界中植物抵抗病原侵染的最有效方式。植物病原细菌表达的Harpin蛋白是一类能够引起植物产生过敏反应的激发子,并诱导其获得对后接病菌的系统抗性。本文将梨火疫欧文氏杆菌中,利用Ⅲ型机制分泌的植物抗性诱导蛋白Harpin克隆于诱导表达载体pExSec1的金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽及ZZ片段的后面,通过Ⅱ型机制在大肠杆菌中表达和分泌ZZ::Harpin融合蛋白,为了使工程菌在植物表面能表达分泌Harpin,又将表达融合蛋白的基因克隆到组成型表达载体pKK233-2 上,并转化经典的生防菌一成团泛菌308R,验证了重组生防工程菌的分泌表达和过敏反应。
参考文献：
[1]. 利用II型机制组成型分泌表达Harpin的生防工程菌的构建[C]. 李艳琴, 申泉. 第叁届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第二届全国生物农药研讨会论文集. 2004
[2]. 利用Ⅱ型机制组成型分泌表达Harpin的生防工程菌的构建[D]. 申泉. 山西大学. 2004
[3]. 胡萝卜软腐欧氏杆菌Harpin的基因克隆与表达[D]. 白艳. 山西大学. 2007
[4]. 表达Harpin蛋白的枯草芽孢杆菌生防菌的构建[D]. 王钰. 山西大学. 2009
[5]. 利用Ⅱ型机制分泌Harpin的生防工程菌的构建[C]. 李艳琴, 申泉, 白艳. 第十届全国杀虫微生物学术研讨会暨全国生物农药与化学生物学研究与产业化会议论文摘要集. 2006