郝永清[1]2004年在《鸡毒支原体的分离鉴定及基因免疫的研究》文中提出鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum， MG)感染也称为鸡败血霉形体感染或慢性呼吸道病(Chronic Respiratory Disease， CRD)。随着养鸡集约化程度的提高，饲养方式的改变以及饲养密度的提高，在通风不良、空气中氨和灰尘增加或气温骤变等环境中极易诱发本病；甚至接种鸡新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎等活疫苗后也都可能诱发本病。鸡感染MG后临床上主要表现为咳嗽、流鼻涕、呼吸时发出啰音，严重时张口呼吸。本病分布于世界各地，可通过水平和垂直方式传播，因此该病在鸡群中可长期存在和蔓延。根据血清学调查，鸡群的感染率平均在50%～80%之间。据统计，鸡毒支原体感染鸡群后，雏鸡的弱雏率增加10%左右，蛋鸡的产蛋率下降10%～20%，肉鸡的体重减少38%，出栏期延长，饲料转化率降低20%，并可间接的引起大量的药费开支，同时造成禽产品中药物残留，所以该病是危害养鸡业的重要疾病之一 。因此，多年来许多国家对该病的防制（治）非常重视，但迄今为止仍未找到理想的防治方法。分子生物学技术的发展为该病的防治提供了新的手段和途径，虽然鸡毒支原体分子生物学研究也取得了一定进展，但对其免疫保护性抗原及其基因的克隆和表达的研究在国内报道很少,对该病进行基因免疫的研究至今未见报道。我区虽有用凝集试验和病理剖解方法诊断有鸡毒支原体病的报道，但迄今尚未见到鸡源支原体的分离、鉴定及分子生物学方面的研究报道，因此，在该病的防治中存在着很大的盲目性。针对目前我区及国内、外鸡毒支原体病的研究现状和实际需要，我们进行了“鸡毒支原体的分离鉴定及基因免疫的研究”，通过该课题的研究，取得以下结果：对内蒙古呼和浩特和包头地区四个鸡场的部分鸡用平板凝集试验检查鸡毒支原体的感染情况，结果MG平均阳性率为84.6%，表明MG感染在我区鸡群中广泛存在。本研究从上述地区四个鸡场的39只鸡中分离到3株支原体，经鉴定两株为鸡毒支原体，分别命名为H3株和BR1株，另一株初步判定为鸡支原体，命名为BR2株。通过攻毒试验证明，H3株和BR1株均为强毒株。通过自制油乳剂灭活苗免疫SPF鸡证明，H3株具有较好的免疫原性。通过PCR扩增，成功克隆了H3株TM-1基因，通过DNA序列测定和比较分析，发现H3株的TM-1基因与S6株的核苷酸差异率为3.435%，氨基酸差异率为4.581%。通过PET-30a原核表达载体表达证明，TM-1基因可以在大肠杆菌中表达，且表达产物具有免疫反应性。成功构建了TM-1基因真核表达质粒。<WP=3>通过对SPF鸡的免疫，然后经ELISA和流式细胞术对免疫鸡进行检测，结果表明所构建的真核表达质粒既可诱导机体产生体液免疫，也可以产生细胞免疫。攻毒试验证明，我们所构建的TM-1基因DNA疫苗的免疫效果与油乳剂灭活苗相当。
齐冬梅[2]2002年在《鸡毒支原体H_3株TM-1基因的克隆与序列分析》文中研究说明鸡毒支原体是鸡慢性呼吸道病的病原体，因其在鸡群中广泛存在而造成很大的经济损失。现在使用的弱毒苗和灭活苗都存在着一些难以克服的缺点，基因免疫和基因工程疫苗等生物技术疫苗的研制已势在必行。而研制基因工程疫苗和基因免疫的关键是免疫保护性抗原基因克隆。为此本实验对鸡毒支原体内蒙古分离株H_3株的TM-1基因进行克隆和序列分析。根据已发表的MG S_6株TM-1蛋白基因序列分析设计了一对引物，以H_3株DNA为模板进行PCR扩增，得到约0.8Kb的片段，将该产物克隆到PUCm-T载体上，得到重组质粒。经Kieser法、质粒PCR法、PstⅠ单酶切等方法鉴定后，测定H_3株TM-1基因序列。并与已知S_6株TM-1基因序列进行比较，结果表明，MG H_3株与S_6株TM-1基因核苷酸序列同一性为96.57％，氨基酸同一性为95.42％。本研究结果为进一步研究MG H_3株的基因免疫和基因工程疫苗等奠定基础。
郭志刚[3]2006年在《鸡白细胞介素2基因与鸡毒支原体H3株TM-1基因的串联及原核表达》文中认为为了提高鸡毒支原体DNA疫苗的免疫效果,本研究运用分子克隆技术,获得了鸡白细胞介素2基因,然后将其与鸡毒支原体H3株TM-1基因进行串联构建了融合基因,并在原核细胞中进行了表达。首先,根据GenBank中已登录的鸡白细胞介素2 cDNA序列以及原核表达质粒pET-30a的多克隆位点,自行设计引物,为了便于基因的克隆和表达,我们在引物的5’端和3’端设计了相应的酶切位点、保护位点、连接臂、起始密码和终止密码。应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从经ConA诱导培养6h的鸡脾淋巴细胞中扩增获得了大小约为460bp的DNA片段,将其连接到pMD19-T质粒上,经蓝白斑筛选、质粒PCR和双酶切鉴定后,筛选获得阳性重组克隆pMD19-T-IL-2。核苷酸序列测定分析表明,与GenBank中登录的鸡白细胞介素2 cDNA序列一致,这表明已成功克隆了鸡白细胞介素2基因。其次,运用DNA重组技术将鸡白细胞介素2基因和鸡毒支原体H3株TM-1基因进行串联,插入到pET-30a质粒的EcoRⅠ和Hind III多克隆位点之间,经质粒PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定,结果表明已成功构建了含鸡毒支原体H3株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的融合基因,并将含有此融合基因的重组质粒命名为pET-30a-TM-1-IL-2。最后,将此重组质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株。经IPTG 37℃诱导表达4h后,SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白得到了表达,分子量约为43kDa,主要以包涵体形式存在。表达产物在尿素存在下经超声波处理,获得了纯化的融合蛋白。这为为进一步研究鸡白细胞介素2及鸡毒支原体的生物学活性奠定了基础。综上所述,本研究成功地构建了含鸡毒支原体H3株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的重组表达质粒,并将其导入原核细胞进行了表达。这为进一步研究鸡毒支原体DNA疫苗奠定了实验基础。
王秀青[4]2004年在《鸡毒支原体H_3株TM-1基因的原核表达与基因免疫的研究》文中研究表明鸡毒支原体（Mycoplasma Gallisepticum，MG）感染，也称为鸡败血霉形体感染或慢性呼吸道病（Chronic Respiratory Disease,CRD）,因其在鸡群中广泛存在而造成很大的经济损失。现在使用的弱毒苗和灭活苗都存在着一些难以克服的缺点，基因免疫和基因工程疫苗等生物技术疫苗的研制已势在必行。为此本实验对鸡毒支原体内蒙分离株H3株的具有免疫保护性的TM-1基因进行了原核表达，通过West—blotting和ELISA实验证明表达产物（29kDa的多肽）具有免疫反应性。在此基础上构建了MG的基因疫苗，动物实验表明，本研究构建的基因疫苗即可诱导产生体液免疫，也可产生细胞免疫，攻毒试验证明保护率达到79.5%。
任娟[5]2009年在《间接夹心ELISA检测鸡毒霉形体研究》文中进行了进一步梳理鸡毒霉形体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是鸡慢性呼吸道病(Chronicrespiratory disease,CRD)和火鸡传染性窦炎(Infectious sinusitis)的主要病原菌。该病的实验室诊断方法主要有病原的分离鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等,病原的分离鉴定是诊断MG感染最可靠的方法,但病原分离存在操作复杂、工作量大、时间长等缺点。免疫学方法有血清平板凝集试验(SPA)、血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体技术等。这些方法虽然简便易行,但大多只是对抗体做出检测,不能用于MG早期感染和隐性感染的检测,且存在非特异性反应和交叉反应性,所以并不能对MG感染做出快速准确的诊断。聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针等分子生物学方法可检测抗原,但这些方法对试验设备和人员素质有很高的要求,目前还难以广泛推广和应用。本研究制备了鼠抗MG单克隆抗体和兔抗MG多克隆抗体,建立了针对MG抗原的间接夹心ELISA检测技术,为鸡毒霉形体病的快速诊断提供了一种新的检测方法,取得了如下结果。1.兔抗MG多克隆抗体的制备将经纯化的MG-HS菌液接种于FM-4固体平板上,37℃培养7～10d,取出后在40×显微镜下观察其菌落形态,呈典型的荷包蛋状菌落,将MG-HS菌液扩大培养并离心,洗涤沉淀4次,制成100倍浓缩菌悬液,测定蛋白浓度为18mg/ml,所得悬液与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,得到兔抗MG的高免血清,其琼扩效价达到1:32,经饱和硫酸铵粗提、G-200过柱纯化后,经SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,呈典型的IgG条带,为MG抗原检测间接夹心ELISA诊断方法的建立奠定了基础。2.MG单克隆抗体的制备与纯化将制成的100倍浓缩菌悬液调节浓度至2mg/ml,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,待小鼠血清的ELISA抗体效价达1:10000以上时,将小鼠脱颈椎处死制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过2轮细胞融合、多次筛选和克隆,最后获得2株针对MG的且能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞(287和6G9)。染色体数目分别为86.6和86.9;经小鼠腹腔接种后收获腹水,287细胞株的间接ELISA效价为1:5.12×10~5,6G9株的间接ELISA效价为1:2.56×10~5,且均不与其它禽类呼吸道病原发生交叉反应;用间接ELISA方法对2株单抗的相对亲和力进行鉴定,结果表明287的亲和力高于6G9。说明这2株单抗特异性强,灵敏度高,可用于MG抗原的ELISA检测。3.检测MG抗原的间接夹心ELISA方法的建立以纯化的兔抗MG IgG为第一抗体包被酶标板,鼠抗MG单克隆抗体为第二抗体,结合羊抗鼠IgG-HRP,通过对ELISA反应条件的优化选择,建立了检测MG抗原的间接夹心ELISA法。方阵滴定的结果表明,兔抗MG IgG的最佳工作浓度为1μg/mL,鼠抗MG单克隆抗体的最佳工作浓度为5μg/mL;用所建立的间接夹心ELISA方法对30份健康鸡气管拭子材料进行了检测,将阴性样品取平均OD_(450)值,再加上3倍标准差即OD_(450)+3S(0.054+3×0.023=0.123)定为阴、阳结果判定临界值。但考虑到临界值与阴性值太接近,故最终将阴、阳性结果的临界值定为0.2;对已知的不同浓度梯度的MG培养液进行检测,结果表明该方法所能够检测的MG抗原的浓度下限为5×10~1cfu/ml,即待检样本中含有50个菌体既能被检测为阳性;板内变异系数为0.41%～6.72%;板间变异系数为0.88%～10.72%。说明该方法的敏感性高,重复性好,很有可能成为鸡毒霉形体感染的一种常规的快速检测方法。
参考文献：
[1]. 鸡毒支原体的分离鉴定及基因免疫的研究[D]. 郝永清. 内蒙古农业大学. 2004
[2]. 鸡毒支原体H_3株TM-1基因的克隆与序列分析[D]. 齐冬梅. 内蒙古农业大学. 2002
[3]. 鸡白细胞介素2基因与鸡毒支原体H3株TM-1基因的串联及原核表达[D]. 郭志刚. 内蒙古农业大学. 2006
[4]. 鸡毒支原体H_3株TM-1基因的原核表达与基因免疫的研究[D]. 王秀青. 内蒙古农业大学. 2004
[5]. 间接夹心ELISA检测鸡毒霉形体研究[D]. 任娟. 华中农业大学. 2009