（湖北省第三人民医院肿瘤科；湖北武汉430030）
摘要：目的：检测胃癌中母系印记基因3(MEG3)长链非编码RNA的表达，探讨其与肿瘤发展的关系。方法应用实时荧光定量PCR的方法检测87例胃癌及其配对癌旁正常胃粘膜组织中MEG3的表达，统计学分析其表达与肿瘤临床分期的关系。结果统计学分析表明胃癌组织与配对癌旁正常组织比较MEG表达都有显著降低(P<0.01)。结论MEG3在胃癌发生发展过程中表达有明显降低，与胃癌的发生有密切的关系。
关键词：胃癌；长链非编码RNA；MEG3
Expression of MEG3 long non-coding RNA in Gastric Carcinomas and Its Clinical Significancy*
LIU Li，WEI Wu-jie，LI Li，SUN Jian-hai
The Department of Oncology,The third people's Hospital of Hubei Provincel,Wuhan 430030,Hubei Province,China
[Abstract]:Objective :To examine the MEG3 lncRNA expression in gastric carcinomas(GC)and correlate it with patient clinical status.Methods: Expression levels of MEG3 lncRNA were quantitated with stem-loop quantitative reverse transcription-PCR in 87 GC patients and paired adjacent normal tissues(ANTs),and correlated to the pathoclinical status of the patients.Results: Expression of MEG3 lncRNA was markedly decreased in GC tissues compared with ANTs(P<0.01).Conclusion:Expression of MEG3 lncRNA was attenuated in GCs and correlated closely with cancer progression.
[Key words]:gastric carcinoma;long non-coding RNA;MEG3
前言
胃癌(gastric carcinoma,GC)是发生在消化道的恶性肿瘤，近年来在中国发病率排名第一[1]。引起胃癌发生的因素很多，一些最新的研究表明某些长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达异常可能参与了胃癌的发生发展过程[2]。IncRNA是一类长度在200-100000 nt之间，不编码蛋白质的分子。母系表达基因3(materally expressed gene 3，MEG3)是第一个被发现有肿瘤抑制功能的lncRNA，表达于多种正常组织中，然而在脑癌及一些肿瘤细胞株中不表达[3]，在中国人群胃癌中的表达目前尚无报道。本研究应用荧光定量PCR方法在收集的胃癌组织和配对正常组织中检测MEG3的表达，并分析其与肿瘤发生的关系。
1材料与方法
1.1实验材料
1.2.1临床样本采集 87例胃癌标本均取自2012年9月~2015年1月湖北省中山医院普外科进行手术治疗的患者，所有患者已了解样本采集意义并签署知情同意书。病理均确诊为胃癌；既往无免疫缺陷、自身免疫疾病、肝炎、HIV和其它已知感染性疾病；所有病例均为腺癌，其他病理类型已排除。每一例样本都含原发灶和距癌缘5cm以上的癌旁正常组织。样本采集后立即放入液氮，后置于RNA保存液中低温贮藏。
1.2.2试剂和仪器mirVana?miRNA Isolation Kit cat#1560(Ambion)、M-MLV逆转录酶和M-MLV 5×buffer(Promega)、RNA酶抑制剂(鼎国)、Taq DNA聚合酶及Taqman MicroRNA Assay试剂盒(Takara)、dNTPs(Takara)、常规试剂由中山医院中心实验室提供。Real-time PCR仪(Bio-rad Icycler)、普通PCR仪(MD Research)、低温超速离心机和超低温冰箱等由武汉大学医学院生物化学与分子生物学实验室提供。
1.2实验方法和步骤
1.2.1总RNA提取和纯化 使用Total RNA Isolation Kit(Ambion)提取、纯化储存于RNA保存液中的87例胃癌标本、配对癌旁组织标本中的总RNA，后溶于DEPC水中，立刻保存于-70℃低温冰箱，详细提取步骤严格按照产品说明书执行。
1.2.2逆转录和实时荧光定量PCR 首先将提取的总RNA逆转录成cDNA，使用random hexmar引物进行cDNA的逆转录。逆转录反应体系包含：10 ng总RNA样本、50 nM逆转录引物、1×RT buffer、0.25 mM dNTPs,3.33U/μl MMLV逆转录酶和0.25 U/μl Rnase抑制剂；逆转录反应条件为：16℃30 min；42℃，30 min；85℃，5 min。第二步实时荧光定量PCR应用Bio-rad Icycler real-time PCR仪按照说明书进行操作，在96孔专用板中进行，每一孔中10μl反应体系包含1.3μl逆转录得到的cDNA产物,1X TaqMan Universal qPCR Master Mix、1μl上述以及Taqman MicroRNA Assay试剂盒中的定制探针引物。反应条件为：95℃10min；95℃15s，60℃10s，40循环。域设置采用程序缺省值。
1.2.3数据分析 目的基因量=2-△Ct，2-△Ct表示的是实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。在目的基因与内参基因扩增效率相同的情况下可以直接得到目的基因相对于内参基因的定量。△Ct=Ct目的-Ct内参，把所得到的Ct值还原为目的基因的量，然后用GraphPad软件（Version 5.0）绘制成散点图。
1.2.4统计学分析 采用随机区组设计的两因素方差分析法（Two-way Repeated Measures ANOVA）分析胃癌组织与癌旁正常组织中MEG3的表达差异。检验水准是p<0.05。
2结果
Graphpad软件分析实时定量PCR结果
图2为GraphPad分析实时定量PCR的图，数据以MEG3 lncRNA与内参ACTB mRNA的比值计。结果表明胃癌组织中MEG的含量较配对癌旁正常粘膜组织中高（p<0.001）。
图1 GraphPad软件绘制的Real-time PCR结果散点图
Fig.1 Scatter diagram representing the results of real-time PCR amplification
3讨论
胃癌是消化道的主要恶性肿瘤，胃癌的发生发展与多种癌基因和抑癌基因的表达异常有关[4]。近年来，随着lncRNA功能的发现，其在人类多种肿瘤细胞中表达异常与肿瘤的发生、发展的关系成为新的研究热点[5]。目前，已有文献报道在胃癌中表达异常的lncRNA包括HOTAIR、CCAT1等[6-7]。但在国内胃癌人群中缺少MEG3表达的相关报道，因此本研究主要在国内胃癌患者组织中检测这种抑癌lncRNA的表达，探讨其与胃癌发生发展的关系。
母系印记基因MEG3位于染色体14q32,是一种潜在的肿瘤抑制基因，本研究首次选取较大样本量的中国胃癌病例监测MEG3 lncRNA的表达，结果发现其在胃癌中表达明显下调，证实其可能参与了胃癌的病理过程。然而MEG3 lncNRA在胃癌发病及进程中的作用和机制还有待于进一步探索。MEG3可能通过调控编码基因的表达、MicroRNA的表达和直接与功能蛋白交互影响肿瘤的生物学特性，最终达到抑制癌症发生的目的，深入研究lncRNAs与胃癌发展的机制，对于改善胃癌的诊治水平和预后具有重要的临床意义。
参考文献
[1]Zhu X,Li J:Gastric carcinoma in China:Current status and future perspectives(Review).Oncology letters 2010,1(3):407-412.
[2]Song H,Sun W,Ye G,Ding X,Liu Z,Zhang S,Xia T,Xiao B,Xi Y,Guo J:Long non-coding RNA expression profile in human gastric cancer and its clinical significances.Journal of translational medicine 2013,11:225.
[3]Balik V,Srovnal J,Sulla I,Kalita O,Foltanova T,Vaverka M,Hrabalek L,Hajduch M:MEG3:a novel long noncoding potentially tumour-suppressing RNA in meningiomas.Journal of neuro-oncology 2013,112(1):1-8.
[4]Phan AT,Ajani JA:Gastric carcinoma.Current oncology reports 2004,6(3):192-198.
[5]Gutschner T,Diederichs S:The hallmarks of cancer:a long non-coding RNA point of view.RNA biology 2012,9(6):703-719.
[6]Ma MZ,Chu BF,Zhang Y,Weng MZ,Qin YY,Gong W,Quan ZW:Long non-coding RNA CCAT1 promotes gallbladder cancer development via negative modulation of miRNA-218-5p.Cell death&disease 2015,6:e1583.
[7]Lee NK,Lee JH,Park CH,Yu D,Lee YC,Cheong JH,Noh SH,Lee SK:Long non-coding RNA HOTAIR promotes carcinogenesis and invasion of gastric adenocarcinoma.Biochemical and biophysical research communications 2014,451(2):171-178.
*基金项目：2014年武汉市中青年骨干科研项目
论文作者:刘莉,魏武杰,李黎,孙建海通讯作者
论文发表刊物:《医师在线》2016年7月第14期
论文发表时间:2016/9/21
标签：胃癌论文; 逆转录论文; 基因论文; 目的论文; 组织论文; 肿瘤论文; 定量论文; 《医师在线》2016年7月第14期论文;