李云鹏[1]2004年在《鱼藤酮对大鼠多巴胺神经和PC12细胞毒性作用研究》文中进行了进一步梳理帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)是以中脑多巴胺神经元进行性退变为主要病理特征的老年性疾病。家族性PD与遗传因素有关,但大多数散在患者的病因迄今尚不明了,环境因素一直是人们关注的焦点。实验、临床、流行病学资料表明暴露于环境毒物是PD的病因之一。事实上,环境因素长期以来都是作为PD的致病因素而受到重视。本课题采用小剂量长期暴露鱼藤酮的整体动物模型,以生化分析法、高效液相色谱法、western blotting等方法研究鱼藤酮对DA神经系统的生物化学影响;并结合PC12细胞体外中毒模型,以MTT法、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术等方法研究鱼藤酮的毒理学作用特点及凋亡诱导作用,期望阐明鱼藤酮与PD的因果关系。本研究发现:1.大鼠接触小剂量鱼藤酮20d,纹状体内鱼藤酮 含量高达3.31ng/g,4～8h仍维持在0.7～0.9ng/g,消除速率较慢。2.鱼藤酮大鼠皮下中毒的LD50值为3.601mg/kg, LD50的95%可信限为2.771～4.678mg/kg。3.小剂量鱼藤酮注射30d、60d、90d,均可见大鼠纹状体DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量明显下降;纹状体一氧化氮含量及一氧化氮合酶活性升高及caspase-3蛋白表达增强。4.鱼藤酮中毒可引起PC12细胞线粒体膜电位降低、细胞色素C含量增高、细胞周期阻滞于G2-M期、caspase-3活性升高、PC12细胞培养上清液中NO2-水平升高及DNA梯状带形成。L-NAME对鱼藤酮中毒引起的PC12细胞存活率有一定的保护作用。以上结果表明:鱼藤酮是一种剧毒的化学物质,在纹状体内有一定量的蓄积,蓄积的鱼藤酮可持续地作用于线粒体复合物I,导致DA神经元损伤。其损伤机理可能是鱼藤酮中毒引起NO含量升高,持续长久的NO产生可以通过线粒体膜电位降低直接介导细胞色素C的释放,而胞浆内的细胞色素C可以活化caspase依赖的细胞凋亡信号通道,引起细胞凋亡。
彭凯歌[2]2017年在《线粒体质量控制在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大常见的与年龄相关的神经退行性疾病,是进行性发展的致死性复杂疾病。PD的病因学是多因素的,但是长期以来无论是家族性还是散发性PD,线粒体功能障碍一直被认为是PD发病最为重要的因素。鱼藤酮(rotenone)是一种从鱼藤及多种植物的根部提取的天然化合物,一直被视为安全有效的杀虫剂。大量的流行病学资料调查表明,长期慢性暴露于农药鱼藤酮的人群其PD的发病率高于普通人群。动物实验结果也提示长期接触鱼藤酮等线粒体复合物I抑制剂,可出现包括黑质纹状体多巴胺(dopamine,DA)神经元减少等类PD样病理学及行为学改变。我们前期的动物实验研究结果也显示大鼠长期慢性注射鱼藤酮可以诱导类PD病,体内和体外模型实验表明鱼藤酮可诱导神经元细胞中多巴胺分布和代谢的异常,促使神经元内发生氧化应激反应,导致线粒体功能障碍和细胞死亡。前期的研究也提示线粒体在鱼藤酮所致的多巴胺神经元变性损伤中发挥了核心作用,线粒体的动力学障碍可能参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元的变性损伤和PD的病程。调控线粒体动力学平衡,维持线粒体的稳态有可能是农药鱼藤酮所致多巴胺神经元变性损伤最重要的保护措施之一。因此,本课题通过建立鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤体内和体外类PD病模型,探讨多巴胺神经元线粒体分裂/融合、线粒体自噬、线粒体生物发生和线粒体ATP敏感性钾通道在鱼藤酮致多巴胺神经元变性损伤过程中的作用及机制,以期为人类帕金森病的治疗提供新的思路和方向。研究内容:1.线粒体生物发生及线粒体分裂融合在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用和机制研究建立鱼藤酮诱导的高分化PC12细胞体外染毒模型,使用细胞毒性检测试剂盒来评价鱼藤酮对PC12细胞的毒性效应,并在透射电子显微镜下观察分析鱼藤酮对线粒体形态学、线粒体的长度和嵴的数量的影响;利用荧光探针标记线粒体并在激光共聚焦显微11镜下观察线粒体的片段化及分析线粒体数量和质量的改变;同时,使用TMRM染料检测PC12细胞线粒体膜电位的改变。利用荧光实时定量PCR检测多巴胺神经元线粒体拷贝数;采用RT-PCR检测线粒体生物发生相关因子PGC-1α和mt TFA,线粒体融合相关因子MFN2和OPA1,和线粒体分裂相关因子Drp1和Fis1基因转录水平的表达变化;WB实验检测酪氨酸羟化酶(TH)及线粒体生物发生和分裂/融合相关蛋白的表达变化;分别使用线粒体融合促进剂M1和线粒体分裂抑制剂Mdivi-1确定线粒体分裂/融合在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用;通过免疫荧光实验确定磷酸化Drp1蛋白的表达及其线粒体的转位作用。另外,通过si RNA转染和慢病毒感染构建低表达和过表达PGC-1α基因的PC12细胞模型,确定PGC-1α在多巴胺神经元线粒体生物发生和分裂/融合中的调控作用。2.PINK1/Parkin在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用及机制研究通过检测LC3-GFP荧光强度以及WB实验检测LC3和p62蛋白的表达水平观察鱼藤酮染毒神经元后细胞自噬的发生。同时,WB实验进一步检测了PINK1和Parkin及其磷酸化蛋白分别在PC12细胞及线粒体中的表达变化。利用LC3自噬腺病毒Ad-GFP-LC3与线粒体荧光探针Mito-tracker Red染色共定位情况以及线粒体荧光探针Mito-tracker Green与溶酶体荧光探针Lyso-tracker Red共染色两种方法在激光共聚焦显微镜下观察分析PC12细胞的线粒体自噬水平。分别采用si RNA转染和慢病毒感染构建低表达和过表达PINK1基因PC12细胞模型,检测线粒体DNA拷贝数,PGC-1α和mt TFA的蛋白表达以确定PINK1/Parkin通路对线粒体生物发生的作用;同时检测MFN2、OPA1、Drp1和Fis1的蛋白表达水平以确定PINK1/Parkin通路对线粒体分裂/融合的作用。另外,分别构建PGC-1α低表达和过表达细胞模型,检测PINK1、Parkin和p-Parkin的蛋白表达水平和线粒体的自噬水平以确定PGC-1α对PINK1/Parkin通路的调控作用。3.线粒体ATP敏感性钾通道在鱼藤酮诱导多巴胺神经元变性损伤中的作用及机制研究构建鱼藤酮诱导的SD大鼠类PD病模型和细胞模型,并在鱼藤酮染毒前分别给予线粒体ATP敏感性钾通道开放剂二氮嗪或抑制剂5-HD,评价线粒体ATP敏感性钾通道在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用。采取大鼠神经行为学实验(旷场试验,转棒式疲劳仪实验)和小动物核磁共振扫描观察大鼠中脑基底神经节结构和功能的变化,高效液相色谱法观察神经元多巴胺的释放分泌,以及WB和免疫组化实验检测多巴胺神经元的标志性蛋白酪氨酸羟化酶的表达,以进一步验证鱼藤酮诱导的大鼠类PD病模型的建立。在激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜下观察分析多巴胺神经元线粒体质量,数量及形态的变化,高效液相色谱法分析ATP的含量,检测大鼠多巴胺神经元ROS水平和线粒体呼吸链复合物I的活性。RT-PCR和WB实验检测了多巴胺神经元中PGC-1α、mt TFA、MFN2、OPA1、Drp1和Fis1的m RNA及蛋白的表达水平变化。分离多巴胺神经元的线粒体蛋白和胞质蛋白后,WB分别检测了Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2A和SUR2B的蛋白表达。此外,通过si RNA转染构建Kir6.1低表达的PC12细胞模型,检测线粒体DNA损伤、线粒体片段化以及线粒体分裂融合的改变。4.二氮嗪在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元急性损伤及慢性损伤中的作用效应研究通过构建鱼藤酮急性损伤和慢性损伤动物模型,并在染毒前予以同剂量二氮嗪或5-HD预处理,分别检测SD大鼠的生存率,纹状体组织的ATP、DA含量,ROS水平,线粒体呼吸链复合物I的活性,以及血液中尿酸,血糖以及超敏C-反应蛋白的变化。研究结果:1.PGC-1α介导的线粒体生物发生与分裂/融合之间的交互作用参与调节了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤作用建立了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤细胞模型,结果显示:鱼藤酮可以导致多巴胺神经元细胞活性降低,TH蛋白的表达下调,分泌释放多巴胺的能力降低;线粒体膜电位降低,活性氧的生成增加等。透射电镜下可见大量的小圈状或点状的碎片化线粒体,同时线粒体的长度、面积以及线粒体嵴的长度明显减小,因此鱼藤酮可诱导多巴胺神经元线粒体形态结构和功能的异常,进而导致多巴胺神经元的变性损伤。同时,RT-PCR和WB实验结果显示,线粒体生物发生相关因子(PGC-1α和mt TFA)及线粒体融合分裂相关因子(MFN2、OPA1、Fis1)的基因转录和蛋白表达水平在鱼藤酮的作用下均出现不同程度的降低,而磷酸化Drp1蛋白却出现表达上升的趋势,与对照组比较具有显着性差异。进一步利用线粒体分裂抑制剂M1和融合促进剂Mdivi-1干预鱼藤酮染毒的多巴胺神经元,结果显示M1和Mdivi-1可以提高细胞活性、增加线粒体DNA拷贝数以及TH蛋白的表达,减少线粒体DNA的片段化,具有改善的线粒体质量和形态的作用。过表达PGC-1α可显著抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞的死亡,提高线粒体质量和线粒体DNA拷贝数,升高了MFN2的蛋白表达并显着降低了p-Drp1的蛋白表达水平,因此,过表达PGC-1α对鱼藤酮诱导的多巴胺神经毒性有显著的保护作用。而低表达PGC-1α可加剧鱼藤酮诱导的PC12细胞的神经毒性作用,MFN2的蛋白表达水平显着下降,p-Drp1的蛋白表达水平显着上升。另外,免疫荧光实验的结果也进一步提示提示鱼藤酮可促使p-Drp1蛋白表达升高并从胞浆向线粒体转位。体自噬在鱼藤酮诱导的多巴胺神经变性损伤中的作用在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤的细胞模型中,LC3-2/LC3-1比例增加,p62的表达降低,提示鱼藤酮可诱导PC12细胞自噬。进一步的研究显示,鱼藤酮可以诱导多巴胺神经元PINK1/Parkin蛋白的表达水平升高,并促使PINK1/Parkin由细胞质向线粒体的转位,同时线粒体标记蛋白Mito-Tracker Red和自噬标记蛋白LC3-GFP共定位结果显示鱼藤酮可以诱导线粒体的自噬。进一步研究结果表明,PINK1、Parkin和p-Parkin的蛋白水平与PGC-1α的表达水平呈负相关;低表达PINK1能够上调PGC-1α及其靶基因mt TFA的蛋白水平,同时可显着增加线粒体DNA拷贝数。反之,过表达PINK1则导致PGC-1α及其靶基因mt TFA表达下调,线粒体DNA的拷贝数减少。因此,PINK1/Parkin通路与线粒体的生物发生有关,干预PINK1/Parkin通路可以调控线粒体的生物发生。同时研究发现PGC-1α的表达改变时,可以影响PINK1/Parkin蛋白的表达和线粒体的自噬水平。因此,PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬和PGC-1α介导的线粒体生物发生之间存在相互作用。进一步的实验结果显示,MFN2的蛋白表达与PINK1基因的表达水平呈负相关,而磷酸化Drp1蛋白的表达与PINK1基因则呈正相关。结合PGC-1α对MFN2和Drp1的调控作用,我们推测,MFN2和Drp1可能位于PINK1和PGC-1α蛋白的下游,PINK1和PGC-1α的相互拮抗调控着线粒体自噬,线粒体生物发生以及线粒体的分裂/融合作用,调控线粒体的质量和维持着线粒体稳态。3.线粒体ATP敏感性钾通道通过调控线粒体的质量参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤我们建立了鱼藤酮诱导的类PD病的动物模型和细胞模型,研究mito KATP通道与线粒体的质量控制关系在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用。首先通过神经行为学实验、病理学实验、多巴胺神经元特异性标志蛋白TH的表达以及神经元释放分泌多巴胺的能力,证实鱼藤酮诱导的类PD损伤动物模型的建立。在二氮嗪预处理组中SD大鼠神经行为障碍及大脑基底神经节的结构异常比鱼藤酮染毒组更加严重,而5-HD预处理对鱼藤酮引起大鼠神经行为障碍及大脑基底神经节的结构异常具有显着的保护作用。进一步研究结果显示,mito KATP通道的开放剂二氮嗪会加重鱼藤酮的神经毒性,包括大鼠的生存率降低,ATP生成减少,线粒体复合物I活性和多巴胺的浓度降低,大鼠纹状体线粒体形态与超微结构异常,线粒体ROS蓄积,线粒体DNA拷贝数减少,线粒体片段化增加等,而mito KATP通道抑制剂5-HD阻断状态可逆转上述指标的改变,对鱼藤酮诱导的多巴胺能神经退行性性变具有显着的保护作用。进一步研究结果显示,体内和体外模型中mito KATP通道构成亚基蛋白都是2.PINK1/Parkin与PGC-1α相互作用调控的线粒体生物生成、分裂/融合以及线粒Kir6.1/SUR2B,而且鱼藤酮可以导致Kir6.1亚基的表达降低,对SUR2B亚基蛋白表达无显着性的作用。同时,低表达Kir6.1蛋白对鱼藤酮诱导的多巴胺神经毒性有显着的保护作用:细胞活性显着性提高,线粒体DNA拷贝数增加,线粒体片段化减少和改善线粒体质量。与此同时,沉默Kir6.1可以使线粒体生物发生相关因子PGC-1α和线粒体融合蛋白MFN2的蛋白表达水平表达升高,磷酸化Drp1的蛋白表达水平降低。因此,mito KATP通道构成亚基蛋白Kir6.1能够通过调节线粒体生物发生和线粒体分裂融合参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤。4.二氮嗪在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元急性损伤和慢性损伤中的效应不同结合鱼藤酮诱导的类PD病慢性损伤动物模型的实验结果,我们进一步研究了二氮嗪在鱼藤酮诱导多巴胺神经元急性损伤中的作用。结果表明,二氮嗪对鱼藤酮诱导的SD大鼠急性损伤有明显的保护作用,二氮嗪预处理可以显着改善鱼藤酮引起的SD大鼠生存率降低、线粒体功能障碍以及大鼠血糖代谢紊乱等,而5-HD对鱼藤酮引起的急性损伤并无显着作用。研究结论:1.鱼藤酮长期的慢性暴露可以诱导大鼠出现类PD病的神经行为学与病理形态学的改变。2.鱼藤酮暴露可以引起多巴胺神经元线粒体生物发生障碍、线粒体分裂/融合失衡、线粒体自噬失调,进而导致多巴胺神经元线粒体质量、数量和功能的异常。3.一方面PGC-1α调控着线粒体的生物发生,另一方面PGC-1α又可以通过MFN2和p-Drp1影响多巴胺神经元线粒体分裂与融合的动态平衡;同时干预线粒体分裂与融合又可以影响PGC-1α和线粒体的生物发生;因此,PGC-1α通过调控线粒体生物发生与分裂/融合的交互作用在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元的变性损伤中发挥了重要作用。4.PINK1/Parkin通路参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元线粒体的自噬;PINK1基因可以影响线粒体生物发生以及分裂、融合相关蛋白的表达,同时PGC-1α又可以反过来影响PINK1/Parkin通路蛋白的表达,因此,PINK1/Parkin通路和PGC-1α通过相互拮抗作用进一步调控多巴胺神经元线粒体生物发生,分裂/融合和自噬,控制线粒体的质量和维持线粒体的稳态,进而在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中发挥了关键作用。5.mito KATP在多巴胺神经元中的组成亚基为Kir6.1/SUR2B,其通过调控线粒体的生物发生和分裂/融合作用的关键调控蛋白参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元的变性损伤,Kir6.1亚基在该过程中发挥了主要作用。在鱼藤酮诱导的类PD病动物模型中开放mito KATP通道会加重鱼藤酮的神经毒性,而阻断mito KATP通道对鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤具有显着的保护作用。6.mito KATP通道开放剂二氮嗪对鱼藤酮诱导的急性损伤和慢性损伤的作用机制可能是完全不同的。在鱼藤酮诱导的急性损伤中,二氮嗪预处理对鱼藤酮导致的线粒体功能障和血糖代谢紊乱有显着的保护作用,而5-HD预处理对鱼藤酮的毒性损伤并无显着作用综上所述,鱼藤酮可以通过引起线粒体动力学失衡,包括生物发生、线粒体分裂/融合、线粒体自噬等导致线粒体的功能障碍,破坏线粒体稳态和质量,诱导多巴胺神经元的变性损伤。在此过程中,PGC-1α与PINK1/Parkin通路通过相互拮抗作用对多巴胺神经元线粒体生物发生,分裂/融合和自噬进行交互调控,进而维持线粒体的稳态和质量;另外,线粒体ATP敏感性钾通道在多巴胺神经元中的的组成亚基为Kir6.1/SUR2B,其关键的功能基团Kir6.1通过调控线粒体的生物发生和分裂/融合作用的关键调控蛋白,影响线粒体的质量控制,参与了鱼藤酮诱导的多巴胺神经元的变性损伤。
赛燕[3]2006年在《多巴胺代谢功能障碍在鱼藤酮多巴胺神经元毒性中作用研究》文中研究说明帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是主要发生在中老年人锥体外系统的选择性进行性神经系统退变性疾病。遗传及环境因素是帕金森病的两大病因,尤其是环境因素在散发性PD发病机制中具有重要作用。农药暴露成为近年来研究PD病因的热点。大量的流行病学和小动物实验研究发现长期以来被认为安全有效广泛使用的农药杀虫剂鱼藤酮与PD的发病相关,但是其具体的作用机制不详。因此,从分子水平上揭示鱼藤酮所致PD发生的机制与病理变化的关系对PD的防治具有十分重要的意义。多巴胺内源性毒性和PD发病已成为近年研究的热点。多巴胺不仅可以在细胞质中形成,而且也可以在胞质中氧化。其氧化产物对多巴胺神经元具有毒性作用。生理状态下,多巴胺储存于突触囊泡,从而可以避免多巴胺的自氧化损伤作用。我们怀疑在鱼藤酮所致PD动物模型黑质纹状体系统中,多巴胺和它氧化形式的自然平衡出现了问题;多巴胺神经元特有的神经递质多巴胺的代谢功能障碍导致的多巴胺内源性毒性可能参与了鱼藤酮的黑质纹状体系统的选择性毒性作用。为此本实验进行了相关研究,以寻找鱼藤酮多巴胺能神经元选择性毒性作用机制,藉以探讨多巴胺代谢功能障碍所致多巴胺内源性毒性在PD发病机制中的作用。方法:1:离体PC12细胞鱼藤酮染毒模型:光镜和电镜观察PC12细胞形态学和超微结构变化;生化分析检测PC12氧化应激损伤;RT-PCR、Western blot和免疫组织化学检测TH, DAT, VMAT2基因和蛋白表达;钙离子成像分析系统监测PC12细胞[Ca2+]i动态变化;激光扫描共聚焦显微镜观察PC12细胞突触囊泡和神经突起生长的变化;抗氧化剂GSH,MAO抑制剂L-deprenyl,DAT抑制剂GBR-12909和VMAT2抑制剂利血平对鱼藤酮染毒PC12细胞活性和ROS形成的干预作用。2:SD大鼠皮下注射鱼藤酮28天,建立鱼藤酮大鼠PD损伤模型:利用光镜和电镜观察大鼠黑质组织病理损伤和超微结构改变,生化分析检测黑质组织氧化应激损伤;RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测TH, DAT, VMAT2和D2R的表达。
真国辉[4]2006年在《菟丝子中黄酮类提取物的神经保护活性研究》文中指出菟丝子(Cuscuta chinensis Lam)为旋花科植物,是中国传统重要的补益药之一,具有补阳益阴、固精缩尿、明目止泻的功效。 选用神经细胞的模式细胞株PC12细胞作为实验对象,利用H_2O_2对细胞进行损伤,造成直接的氧化损伤模型。利用MTT法检测菟丝子黄酮类提取物对损伤细胞的细胞活力的影响;采用流式细胞仪技术分析DNA的含量、Hoechst33258荧光染色观察细胞形态变化检测菟丝子黄酮类提取物对细胞凋亡率的影响;利用DPPH法检测不同浓度提取物体外的清除自由基能力。结果表明,100mg/l和200mg/l的提取物具有明显的保护活性,可以显着提高细胞存活率,减少凋亡细胞数量;菟丝子黄酮类提取物能够剂量依赖地清除DPPH自由基。初步确立菟丝子黄酮类提取物具有抗氧化活性。 利用鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞凋亡建立帕金森病(PD)体外细胞模型,考察鱼藤酮对线粒体凋亡通路的调节作用。结果表明,应用鱼藤酮24小时后,细胞活力下降,凋亡细胞数量显着增加。进一步的机制研究表明,细胞内ROS水平上升,线粒体膜电位下降,谷胱甘肽(GSH)和Bcl-2蛋白水平下降。推断鱼藤酮损伤机制为细胞内ROS大量产生,谷胱甘肽大量消耗,氧化应激加强;同时线粒体膜电位下降,细胞启动凋亡程序。 利用鱼藤酮模型对菟丝子黄酮类提取物的神经保护活性进行了探讨。通过细胞活力分析、LDH释放率测定及AV-PI检测凋亡细胞数量,发现菟丝子黄酮类提取物能够提高鱼藤酮损伤细胞的存活率,减少凋亡,具有明显的神经保护作用。进一步的机制研究表明,菟丝子黄酮类提取物降低了细胞内ROS水平和线粒体膜电位,提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并提高受损细胞GSH蛋白水平。推断其保护作用是通过提高细胞抗氧化能力,降低细胞氧化应激水平,维持线粒体膜电位,抑制凋亡实现的。
胡丹[5]2008年在《鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集及其机制的研究》文中研究说明第一部分鱼藤酮对大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12的毒性作用目的:探讨鱼藤酮对多巴胺能细胞的毒性作用及其机制。方法:采用不同浓度鱼藤酮处理PC12细胞24小时,用噻唑蓝比色法检测细胞活性,Hoechst 33258染色观察细胞核形态,流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞内活性氧水平和线粒体膜电位,比色法检测细胞内谷胱甘肽水平,荧光底物酶活性法检测caspase 3活性;此外,采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸预处理30分钟,检测上述指标。结果:与正常组相比,10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L和10μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞24小时后,细胞活力和细胞凋亡率呈剂量依赖性下降(P<0.05),其中1μmol/L组MTT吸光度为正常组的42.1%,凋亡率为41.9%。Hoechst 33258染色可见鱼藤酮组具有不同时期凋亡核特征的细胞。鱼藤酮处理后,除10nmol/L组细胞内DHE荧光强度与正常组无显着差异外(P>0.05),余各组细胞内活性氧水平均增高,线粒体膜电位下降及caspase 3活性增高(P<0.05),其变化程度亦呈药物剂量依赖性。谷胱甘肽水平在10nmol/L、100nmol/L鱼藤酮组分别为正常的144%和117%(P<0.05),1μmol/L和10μmol/L组分别下降15%和42%(P<0.05)。N-乙酰半胱氨酸(500μmol/L和2.5mmol/L)预处理30分钟,可部分抑制1μmol/L鱼藤酮所致的上述效应(P<0.05)。结论:鱼藤酮处理可诱导多巴胺能细胞凋亡,其机制与氧化应激和线粒体膜电位下降有关;而且PC12细胞凋亡率具有鱼藤酮剂量依赖性;采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸预处理,可通过抗氧化应激抑制鱼藤酮的毒性效应,该药物对细胞具有保护作用。第二部分鱼藤酮诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白聚集目的:探讨鱼藤酮对多巴胺能细胞α-突触核蛋白表达和聚集的影响。方法:采用不同浓度鱼藤酮(10nmol/L、100nmol/L和1μmol/L)处理PC12细胞24小时,Western印迹法检测α-突触核蛋白表达水平;免疫荧光共聚焦法观察胞浆内α-突触核蛋白聚集物的形成,及硫磺素S染料染色初步了解聚集物的结构性质。此外,采用N-乙酰半胱氨酸预处理(在鱼藤酮作用前30分钟开始预处理),与1μmol/L鱼藤酮组比较α-突触核蛋白表达水平有无变化,以及该抗氧化剂对α-突触核蛋白聚集物形成的影响。结果:Western印迹法显示,鱼藤酮组胞浆内α-突触核蛋白表达水平较正常组显着升高(P<0.05),而且升高的程度呈剂量依赖性;其中,1μmol/L组采用N-乙酰半胱氨酸(500μmol/L)预处理后,α-突触核蛋白表达水平明显下降(P<0.05),但仍高于正常组(P<0.05)。免疫荧光共聚焦结果显示,正常组细胞胞浆内α-突触核蛋白散在分布,1μmol/L鱼藤酮组可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集物形成,呈硫磺素S染色阴性;采用N-乙酰半胱氨酸(500μmol/L)预处理后,聚集物数量减少,体积缩小。结论:鱼藤酮处理可诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白的表达,促进α-突触核蛋白聚集物的形成;而且上述过程均与氧化应激有关。第叁部分鱼藤酮诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白表达上调机制研究目的:探讨鱼藤酮诱导多巴胺能细胞α-突触核蛋白表达上调的机制。方法:采用不同浓度鱼藤酮(10nmol/L、100nmol/L和1μmol/L)处理PC12细胞24小时及N-乙酰半胱氨酸(500μmol/L)预处理30分钟,实时荧光定量PCR法检测细胞内α-突触核蛋白mRNA水平。于1μmol/L鱼藤酮处理的不同时间点(2、6、12、18、24小时),收集细胞,采用荧光底物酶活性法检测20S叁种酶水解活性(胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽基谷氨酰基水解酶);同时Western印迹法观察α-突触核蛋白表达与时间的相关性。结果:采用鱼藤酮处理PC12细胞24小时后,α-突触核蛋白mRNA水平较正常组显着升高(P<0.05),升高的程度呈剂量依赖性;1μmol/L鱼藤酮组采用N-乙酰半胱氨酸预处理30分钟,该指标较鱼藤酮组显着下降(P<0.05)。1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞,于2小时20S蛋白酶体酶水解活性开始显着下降(P<0.05),下降的程度具有时间依赖性;而α-突触核蛋白表达水平于6小时开始升高(P<0.05)。N-乙酰半胱氨酸预处理可部分抑制1μmol/L鱼藤酮诱导的蛋白酶体酶活性损伤(P<0.05)。结论:鱼藤酮可诱导α-突触核蛋白转录水平升高及20S蛋白酶体酶水解活性下降,从而促进α-突触核蛋白表达水平的提高;其机制均与氧化应激有关。第四部分多巴胺介导鱼藤酮的细胞毒性和α-突触核蛋白聚集目的:探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮的细胞毒性和α-突触核蛋白聚集过程中的作用。方法:采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,噻唑蓝比色法检测细胞活性,流式细胞术检测DHR123荧光强度(即细胞内活性氧水平);Western印迹法检测胞浆内α-突触核蛋白表达;免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集物。并采用多巴胺耗竭剂—利血平预处理3小时,观察上述指标。结果:1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞24小时,导致细胞活力较正常组显着下降(P<0.05),吸光度为0.730±0.01(正常组为1.112±0.025);利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后再给予鱼藤酮,孵育24小时后,吸光度分别为0.945±0.02和1.06±0.03,细胞活力较鱼藤酮组显着升高(P<0.05)。鱼藤酮处理24小时,过氧化物水平升高至正常组的281%,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,分别降至正常组的248%和232%,与鱼藤酮组比较有显着差异(P<0.05)。鱼藤酮处理后,α-突触核蛋白表达水平显着升高,胞浆内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集物形成;采用上述浓度利血平预处理,α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显着下降(P<0.05),α-突触核蛋白聚集物数量减少。结论:多巴胺介导了鱼藤酮对多巴胺能细胞的毒性作用,并可促进α-突触核蛋白聚集物的形成;对于鱼藤酮选择性损伤多巴胺能细胞的机制具有重要意义。
刘辉[6]2007年在《鱼藤酮对星形胶质细胞谷氨酸转运系统的作用及其机制研究》文中研究说明鱼藤酮(rotenone)是由醉鱼科植物毛鱼藤(derris)的胶状液汁提取的化学物质,自20世纪40年代以来一直被视为安全有效的杀虫剂而广泛应用于农业除害。但是近年来发现,这个既往被认为对人畜毒性低的农药,对机体的神经系统功能可产生一定影响,特别是它对中枢神经的毒性作用以及可能与帕金森病(Parkinson disease,PD)存在着的潜在联系更是人们关注的焦点。帕金森病的主要病理学特征是黑质致密部多巴胺神经元的丢失以及Lewy小体(Lewy body)的形成。给予鱼藤酮后大鼠能产生这些病理变化,并出现类帕金森病的症状,很好地模拟了人类PD的特征改变。但迄今为止,鱼藤酮与PD发病的相关作用机制仍不十分清楚。因此,从分子水平上揭示鱼藤酮所致PD发生的机制与病理变化的关系对PD的防治具有十分重要的意义。兴奋毒性作用与PD等神经退变性疾病的关系已成为近年研究的热点之一。目前公认,谷氨酸(glutamate, Glu)引起的兴奋毒性是中枢神经系统出血、创伤和神经退行性疾病等神经元死亡的重要机制。大量的研究证据也表明,多种原因所致的过度释放的谷氨酸,可通过其相关受体介导的兴奋性神经毒作用,导致黑质纹状体DA能神经元变性或坏死。分布于星形胶质细胞的高亲和力谷氨酸转运体对谷氨酸的再摄取,是谷氨酸递质灭活的主要途径。再摄取功能障碍无疑能加重谷氨酸及其受体介导的兴奋性神经毒作用,导致神经退行性病变的发生与发展。由此推测,鱼藤酮对黑质纹状体多巴胺神经元选择性毒性作用,可能与其破坏星形胶质细胞的谷氨酸转运系统功能有某种关系。为此,本实验围绕谷氨酸代谢相关酶类及其转运体进行了深入研究,以寻找鱼藤酮多巴胺能神经元选择性毒性作用机制,藉以为PD等神经退变性疾病的防治研究提供新的思路。方法:1:鱼藤酮大鼠PD损伤模型:建立SD大鼠皮下注射鱼藤酮与Alzet微泵恒流给药两种模型,染毒时间为28 d。利用光镜和免疫组织化学方法观察大鼠纹状体病理损伤、神经元变性改变以及星形胶质细胞增生反应;HPLC与同位素标记法检测纹状体胞外谷氨酸浓度和突触体谷氨酸转运能力;RT-PCR、Western Blot及生化分析测定GLAST,GLT-1,GS基因表达和蛋白活性。2:离体星形胶质细胞鱼藤酮染毒模型:观察鱼藤酮对星形胶质细胞的毒性作用;RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学检测GLAST, GLT-1, GS基因和蛋白表达;GLT-1特异性抑制剂DHK,GLAST非特异性抑制剂PDC和GS特异性抑制剂MSO对鱼藤酮染毒星形胶质细胞Glu转运的干预作用;钙离子成像分析系统监测星形胶质细胞[Ca2+]i动态变化;并探讨CaMKⅡ在鱼藤酮致星形胶质细胞谷氨酸转运功能障碍中的作用。结果:一、鱼藤酮染毒动物模型1.大鼠自主活动减少,出现类帕金森病症候群特征;微泵给药高剂量组症状较皮下注射大鼠出现更早且更为严重,部分动物陆续出现典型的阵挛性惊厥,前肢、头面肌阵挛发作,全身肌紧张等现象。2.大鼠纹状体组织形态学发生改变:神经元层次减少,细胞间隙增宽,神经纤维排列紊乱,结构疏松,部分神经细胞丧失典型的多角形状而变为圆形。3.大鼠纹状体组织出现FJB染色阳性神经元,说明鱼藤酮染毒诱导中脑神经元变性损伤。4.大鼠纹状体GFAP阳性细胞数量明显增多,染色加深,胞体增大增粗,GFAP蛋白表达与对照组比较显着增强(P<0.01),提示鱼藤酮诱导星形胶质细胞增生化反应。5.大鼠纹状体细胞外液Glu浓度升高,鱼藤酮浓度为1.2mg/kg时,Glu浓度与对照组比较有显着差异(P <0.05)。6.大鼠纹状体突触体Glu摄取功能降低,鱼藤酮浓度为2.0mg/kg和4.0mg/kg时,摄取能力与对照组比较非常显着地降低(P <0.01)。7.大鼠纹状体GLAST基因和蛋白表达随着鱼藤酮浓度的增加而降低,0.6mg/kg和1.2mg/kg鱼藤酮染毒组与对照组比较差异显着(P <0.05)和非常显着(P <0.01)。8.大鼠纹状体GLT-1基因和蛋白表达随着鱼藤酮浓度的增加而增加,1.2mg/kg鱼藤酮染毒组与对照组比较具有非常显着的统计学意义(P <0.01)。9.大鼠纹状体GS基因表达随着鱼藤酮浓度的增加而增加, 0.6mg/kg和1.2mg/kg鱼藤酮染毒组GS活性与对照组比较非常显着的升高(P <0.01)。二、鱼藤酮染毒星形胶质细胞模型1.细胞形态学发生明显改变,细胞间距增大,数目减少,部分细胞圆缩肿胀,甚至脱壁呈悬浮状态生长。2.细胞活性显着降低,LDH释放量增加。但与PC12细胞比较,星形胶质细胞对同等剂量的鱼藤酮染毒具有更强的耐受能力。3.染毒细胞增殖受到明显抑制,细胞缝隙连接蛋白CX43表达降低,以此结构为基础的细胞缝隙连接受到影响。4.鱼藤酮显着降低体外培养的星形胶质细胞Glu摄取功能,导致胞外Glu浓度明显升高。5.星形胶质细胞Na+/K+_ATP酶活性随着鱼藤酮浓度的增加而降低,具有剂量依赖趋势。6.染毒星形胶质细胞GLAST深染细胞数量减少,基因和蛋白表达随着鱼藤酮浓度的增加而明显降低(P<0.01);GLT-1深染的细胞数量明显增加,基因和蛋白表达随着鱼藤酮浓度的增加而显着增强(P <0.01)。7.染毒星形胶质细胞GS基因表达随着鱼藤酮浓度的增加而增强,GS活性升高,与对照组比较具有非常显着的统计学意义(P <0.01)。8.与单纯鱼藤酮中毒比较,PDC显着抑制星形胶质细胞Glu摄取功能,而DHK抑制作用并不明显,提示GLAST可能在鱼藤酮所致星形胶质细胞Glu转运功能障碍中占主要地位。9.与单纯鱼藤酮中毒比较,MSO显着抑制星形胶质细胞Glu摄取功能,说明GS参与了鱼藤酮所致星形胶质细胞Glu转运功能障碍。10.鱼藤酮可明显促进星形胶质细胞钙离子浓度的升高。且随着鱼藤酮浓度的增加,胞内钙离子浓度增高的趋势更为明显。钙离子浓度出现增高所需的时间也随着鱼藤酮浓度的增加而缩短。细胞外液钙离子内流与胞内钙库释放均参与了细胞内钙离子浓度的增加。11.鱼藤酮中毒引起星形胶质细胞磷酸化CaMKⅡ蛋白表达增强,从而导致胞内Ca2+依赖的CaMKⅡ活性明显降低。12.使用KN-62保护CaMKⅡ活性后,星形胶质细胞谷氨酸转摄取功能较单纯鱼藤酮组明显增强(P <0.05),说明CaMKⅡ参与谷氨酸摄取过程并具有促进作用。结论:1、成功建立了鱼藤酮背部皮下注射和微泵恒流给药两种动物模型。研究发现,鱼藤酮对大鼠纹状体组织具有毒性作用,可使神经元发生形态学改变并发生变性损伤,星形胶质细胞出现增生化反应,后者可能参与了鱼藤酮的神经毒性作用。2、鱼藤酮显着降低纹状体突触体Glu摄取功能,造成组织间隙Glu浓度明显升高,这可能是鱼藤酮致多巴胺神经元损伤的重要原因之一。3、鱼藤酮对体外培养的星形胶质细胞具有明显的毒性作用。主要表现为细胞形态发生明显改变,活力降低,胞膜受损,引起细胞活力改变的最小暴露剂量高于引起细胞形态改变的最低剂量,说明体外培养细胞对毒物敏感程度较高,细胞容易脱壁,虽然细胞形态有明显改变,但细胞仍具活力;与神经元PC12细胞比较,星形胶质细胞对同剂量鱼藤酮染毒的耐受能力更强;此外,染毒细胞增殖分化受到抑制,以CX43为结构基础的细胞缝隙连接受到明显破坏。4、鱼藤酮染毒细胞和组织谷氨酸转运体GLAST基因表达下调,蛋白活性显着降低,可能是引起鱼藤酮所致Glu摄取功能下降的主要原因之一。5、鱼藤酮染毒细胞和组织谷氨酸转运体GLT-1基因表达增强,蛋白活性显着升高。两种转运体在中毒后出现不同的反应,提示它们的功能活性在胞内可能受不同机制调控,GLT-1表达上调可能是机体对Glu浓度升高作出的代偿性保护反应。6、鱼藤酮染毒细胞和组织Na+/K+_ATP酶活性随着鱼藤酮浓度的增加而降低。Na+/K+_ATP酶活性的降低一方面使依赖于ATP的GLAST和GLT-1转运功能障碍,影响谷氨酸摄取和转运,造成中枢神经元的兴奋性损伤;另一方面可导致离子交换功能障碍,引发细胞内Ca2+超载。7、鱼藤酮染毒细胞和组织GS基因和活性表达随着鱼藤酮浓度的增加而增加。此变化有助于加快突触间隙Glu合成为谷氨酰胺(Gln),可能是星形胶质细胞为保护神经元作出的反应。8、在GLT-1特异性抑制剂DHK干预处理组,星形胶质细胞Glu转运能力略有下降,但与单纯鱼藤酮中毒组比较无统计学意义。提示GLT-1于此浓度鱼藤酮染毒条件下,在星形胶质细胞谷氨酸转运功能降低过程中,并非占据主导地位。9. GLAST非特异性抑制剂PDC干预处理后,星形胶质细胞Glu转运能力下降,与单纯鱼藤酮中毒组比较有显着的统计学意义。提示与GLT-1相比,GLAST的下调是星形胶质细胞谷氨酸转运功能降低的主要因素。10.采用谷氨酰胺合成酶特异性抑制剂MSO干预处理后,染毒星形胶质细胞Glu转运能力下降,与单纯鱼藤酮中毒组比较有显着的统计学意义。提示GS亦参与了鱼藤酮致星形胶质细胞谷氨酸转运功能障碍。11、鱼藤酮诱导星形胶质细胞[Ca2+]i增加,且随着鱼藤酮浓度的增高,[Ca2+]i增高的趋势更为明显;在无钙缓冲液环境下,可见曲线平缓,峰值下降,峰值时荧光强度增加值?F显着降低;细胞内钙库释放抑制剂TMB-8显着抑制鱼藤酮引起的[Ca2+]i升高,但与无钙环境比较,其抑制作用的发生时间稍迟。上述结果提示细胞外钙的内流与细胞内钙的释放均参与了峰值的形成。细胞分别用尼莫地平与MK-801预处理后,[Ca2+]i上升变的缓和,?F显着降低。但无论是峰值还是观察结束时的钙水平,MK-801预处理组都未达到尼莫地平预处理组的抑制水平,表明鱼藤酮引起的细胞外钙的内流主要是通过电压门控钙通道进行的。12、鱼藤酮诱导的胞内钙超载,使CaMKⅡThr286发生自身磷酸化,从Ca2+依赖形式转变为非Ca2+依赖而活化,活性持续存在,而Ca2+依赖活性显着下降。KN-62能抑制Glu介导的CaMKⅡ自身磷酸化,从而保护Ca2+依赖活性。将星形胶质细胞用KN-62预处理后,发现鱼藤酮中毒后星形胶质细胞谷氨酸摄取功能较单纯中毒组有显着提高,提示CaMKⅡ可能参与了谷氨酸转运体摄取功能的调节。综上所述,鱼藤酮通过影响星形胶质细胞GluTs的表达及GS活性,增加脑内Glu释放,可能是其发挥神经毒性的重要机制之一。其结果提示:探索在线粒体抑制类农药中毒条件下,如何保护受损的星形胶质细胞(如加入外源性神经保护因子、BDNF等),进而持续提高GluTs及GS的表达和功能活性,对于保护中枢神经元可能具有重要意义。
赵黔鲁[7]2005年在《鱼藤酮损伤PC12细胞的机制研究》文中认为1 鱼藤酮致PC12细胞线粒体功能及超微结构的影响 目的：线粒体是动物细胞能量代谢的主要场所，线粒体功能障碍在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)发病过程中发挥重要作用。鱼藤酮，一种亲脂性杀虫剂，是线粒体复合物Ⅰ抑制剂，本部分实验通过检测鱼藤酮对细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)，线粒体跨膜电位(用~△Ψ_m表示)及其超微结构的影响，拟探讨鱼藤酮损害线粒体的可能机制。 方法：采用体外培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(adyeno chromaffinoma，PC12)细胞株，设对照组1组，实验组4组，待细胞生长良好时，对照组换新鲜培养液，实验组加入鱼藤酮使其终浓度分别为0.1、1.0、2.0和3.0μmol／L，孵育24h，吸弃培养液，用1μmol／L DHR~(123)荧光探针标记后，应用流式细胞仪检测鱼藤酮对体外培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞活性氧的影响，相同浓度鱼藤酉同干预24h，罗丹明~(123)荧光探针标记后，应用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)检测线粒体跨膜电位及透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察低、中、高浓度鱼藤酮对其超微结构的影响。 结果：0.1、1.0、2.0和3.0μmol／L不同浓度鱼藤酮诱导细胞产生ROS，其荧光强度值分别为：1.55±0.17、2.16±0.10、1.77±0.20和1.41±0.12，相同浓度鱼藤酮干预可损坏~△Ψ_m，其荧光强度分别为：93.86±10.12、119.43±7.09、102.71±9.36和83.14±10.70，分别与各自的对照组比较具有显着性差异(P＜0.01)，以上实验组中以1.0μmol／L鱼藤酮作用最显着(P＜0.01)。当鱼藤酮浓度大于1.0μmol／L时，其作用呈现剂量依赖性递减。电镜下观察到多数细胞线粒体超微结构发生异常，表现为：局部水肿、部分线粒体嵴排列紊乱，线粒体髓样变及空泡样变性等。 结论：鱼藤酮通过诱导线粒体产生大量ROS、破坏线粒体跨膜电位
崔群力[8]2010年在《姜黄素对多巴胺能细胞的保护作用及其机制的实验研究》文中认为目的探讨姜黄素(Cur)对鱼藤酮(Ro)致PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法用鱼藤酮建立PC12细胞损伤模型；姜黄素进行干预。用四氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖活力；苏木素、伊红染色观察细胞形态学变化；比色法检测细胞内总超氧化物歧化酶(SOD)的活性；DCFH--DA染色检测细胞内活性氧类物质(ROS)水平；流式细胞术(Annexin-FITC／PI双染法)检测PC12细胞的凋亡。结果0.5μmol/L—1.0μmol/L姜黄素均可减轻0.1μmol/L鱼藤酮对PC12细胞增殖活力的抑制；明显减轻了细胞损伤的形态学改变；明显增加了PC12细胞内SOD的活性；明显降低了PC12细胞内ROS的含量、明显抑制了鱼藤酮对PC12细胞凋亡的诱导作用。结论：姜黄素可拮抗鱼藤酮致PC12细胞的损伤,其机制可能与清除细胞内ROS,诱导抗氧化酶的活性有关。目的：探讨姜黄素(Curcumin)对α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集的影响,及其拮抗鱼藤酮(Ro)诱导的PC12细胞损伤的作用机制。方法：选用大鼠嗜铬细胞瘤株PC12细胞,利用鱼藤酮诱导其损伤建立帕金森病细胞模型,利用姜黄素进行干预；采用MTT法检测细胞活力、荧光酶标仪检测蛋白酶体水解酶活性、Western blotting法检测α-突出核蛋白表达、免疫荧光法检测细胞内α-突出核蛋白聚集、流式细胞仪检测PC12细胞凋亡。结果：鱼藤酮组PC12细胞活力及蛋白酶体水解酶活性明显降低,α-突出核蛋白表达和聚集以及细胞凋亡率明显增加；经0.5、1.0、5.0、10μmol/L各浓度姜黄素预处理4h后与0.1μmol/L鱼藤酮共同孵育PC12细胞24h,0.5和1.0μmol/L的姜黄素使细胞活力以及蛋白酶体水解酶活性明显升高、α-突出核蛋白的表达和聚集明显减少、细胞凋亡率明显降低；5.0和10μmol/L姜黄素对鱼藤酮的拮抗作用明显减弱,细胞活力和蛋白酶体水解酶活性、以及细胞凋亡率与鱼藤酮组比较均无明显差异。结论：低浓度姜黄素能够通过诱导PC12细胞蛋白酶体水解酶活性、抑制α-突出核蛋白的表达和聚集,从而拮抗鱼藤酮诱导的PC12细胞的损伤。目的：探讨姜黄素(curcumin,Cur)通过诱导热休克蛋白(Hsp70)高表达、抑制α-突触核蛋白的异常表达和聚集、促进蛋白酶体系统降解异常α-突触核蛋白(a-synuclein)对多巴胺能细胞的保护作用方法：选用大鼠嗜铬细胞瘤株PC12细胞,利用鱼藤酮诱导其损伤建立帕金森病细胞模型,利用姜黄素进行干预；采用MTT法检测细胞活力、荧光酶标仪检测蛋白酶体水解酶活性、Western blotting法检测Hsp70和α-突出核蛋白的表达、免疫荧光法检测细胞内Hsp70的表达和α-突出核蛋白的聚集。结果：鱼藤酮组PC12细胞活力及蛋白酶体水解酶活性明显降低,Hsp70的表达轻度增加、α-突出核蛋白表达和聚集明显增加；经不同浓度姜黄素预处理4h后与0.1μmol/L鱼藤酮共同孵育PC12细胞24h,与鱼藤酮组比较,0.5μmol/L和1.0μmol/L的姜黄素使细胞活力以及蛋白酶体水解酶活性明显升高、Hsp70表达明显升高,α-突出核蛋白的表达和聚集明显减少；5.0μmol/L和10μmol/L姜黄素对鱼藤酮的拮抗作用明显减弱,细胞活力与鱼藤酮组比较均无明显差异(P<0.05),胰蛋白酶、多肽-谷氨酰多肽水解酶活性与鱼藤酮组比较均无明显差异(P<0.05)、10μmol/L姜黄素组糜蛋白酶样水解酶活性进一步降低,与鱼藤酮组比较有极显着性差异(P<0.01)。结论：低浓度姜黄素能够通过诱导PC12细胞表达Hsp70、诱导蛋白酶体水解酶活性、进而抑制α-突出核蛋白的表达和聚集,从而拮抗鱼藤酮诱导的PC12细胞的损伤。目的：探讨小胶质细胞在多巴胺能细胞损伤中的作用,以及姜黄素通过抑制小胶质细胞反应保护多巴胺能细胞的机制。方法：选用大鼠嗜铬细胞瘤株PC12细胞,利用鱼藤酮诱导其损伤建立帕金森病细胞模型,用姜黄素预处理4h的BV-2细胞再经鱼藤酮处理4h后的细胞上清作为条件培养液(Microglia conditioned medium with Curcumin,MCMC),处理PC12细胞,并设空白对照组。应用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活力；DCFH-DA染色检测BV-2细胞内活性氧类物质(ROS)水平；磷脂结合蛋白(Annexin V)-碘化丙啶(PI)双染色流式细胞仪检测PC12细胞凋亡。Western blotting法检测NADPH氧化酶P47-phox亚基蛋白在BV-2细胞膜上的表达。结果：与对照组组相比,姜黄素预处理的BV-2细胞,其ROS水平降低(P<0.01)；受MCMC处理的PC12细胞,细胞活力增加,细胞凋亡率降低(P<0.01)。而单独用5nM鱼藤酮作用于PC12细胞,其存活率及凋亡率与空白组相比无明显差别(P>0.05)。鱼藤酮诱导BV-2细胞激活后,结合与BV-2细胞膜的NADPH氧化酶P47-phox亚基蛋白明显增加(P<0.01),姜黄素预处理使结合与BV-2细胞膜的NADPH氧化酶P47-phox亚基蛋白明显降低(P<0.05)。结论：鱼藤酮激活小胶质细胞NADPH氧化酶产生ROS,损伤多巴胺能细胞。姜黄素通过抑制小角质细胞内NADPH氧化酶的激活,减少ROS的产生,从而保护多巴胺能细胞。
熊佩[9]2013年在《黄芩苷对帕金森病大鼠多脑区铁积聚及黑质DMT1、FP1的影响》文中进行了进一步梳理目的帕金森病（Parkinson`s disease, PD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病。越来越多的研究提示过渡金属铁与帕金森病发生密切相关[1]。脑铁的异常增加会启动大量自由基生成和促进氧化损伤引起细胞死亡，可能是神经变性性疾病神经元死亡的原因之一[2]。但铁积聚与帕金森病演进性发展的关系还远未阐明。课题组前期的研究表明，黄芩苷可明显抑制鱼藤酮PD大鼠黑质（Substatialnigra，SN）铁的积聚，降低SN内二价金属离子转运体1(divalent metal transporter1, DMT1)的表达，同时升高膜铁转运蛋白1（ferroportin1, FP1）的表达，体现了黄芩苷的多巴胺能神经元的保护作用。同时，在细胞水平上也证明黄芩苷可通过与铁螯合，调节DMT1和FP1的表达抑制细胞内铁的积聚。本课题用黄芩苷对鱼藤酮PD模型大鼠进行治疗给药，应用免疫组织化学法(IHC)、高频电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-AES）、高效液相色谱法（HPLC）和蛋白质印迹法（Western Blot）等观察不同脑区以及多脏器铁代谢的变化；检测纹状体DA及其代谢产物和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量，测定黑质中酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）、DMT1、FP1的表达。研究PD大鼠中脑黑质DA神经损伤、铁积聚、铁转运蛋白表达之间的关系，认识鱼藤酮PD大鼠不同脑区铁的分布、积聚和多脏器铁代谢的特点，黄芩苷对铁积聚和多脏器铁代谢的影响。探讨脑内铁病理性沉积与PD的关系以及黄芩苷保护DA能神经、抑制铁积聚的机理。方法实验用雄性Wistar大鼠，除随机选取11只为正常组动物外，其余大鼠均颈背部皮下注射鱼藤酮(2mg kg~(-1)d~(-1))油乳液4-6周制备PD模型，按照本室所建立的神经行为学记分标准记分，取2分模型用于本实验。随机分为3组：①模型组；②黄芩苷组；③去铁胺组。⑴斜板实验观察PD大鼠肌强直及耐力变化；⑵免疫组织化学方法观察PD大鼠纹状体、中脑黑质TH的改变以及海马、黑质中DCX（Doublecortin）表达的变化；⑶铁染色组织化学法检测PD大鼠纹状体、海马、黑质、小脑铁含量的变化；⑷尼氏染色法检测PD大鼠海马尼氏小体的表达；⑸高频电感耦合等离子法测定PD大鼠黑质、肝、肾、心脏、小脑中铁含量的改变；⑹酶标法测定PD大鼠小脑、心脏、肾脏、肝脏中MDA的含量；⑺高效液相色谱法测定纹状体内DA及其代谢产物HVA,DOPAC含量。结果1黄芩苷对鱼藤酮PD大鼠黑质多巴胺能神经的保护作用（1）大鼠造模成功时，表现为体重明显减轻（P<0.01），拒捕行为减弱，竖毛，毛色变脏变黄，弓背，主动活动减少，动作迟缓，并有震颤或步态不稳等状态。模型组造模成功后2w内，除竖毛外上述表现加重，给药组大鼠神经行为学症状有所改善。（2）斜板实验中：模型大鼠斜板下滑次数在模型建成时、建成5w、8周时均较正常组显着增加（P<0.01）；与模型建成5w相比，黄芩苷、去铁胺治疗5w大鼠斜板下滑次数均明显减少（P<0.01）；与模型8w相比，黄芩苷、去铁胺治疗8w大鼠斜板下滑次数仍呈现显着性差异（P<0.01）。（3）模型大鼠纹状体、黑质DA能神经元均显着脱失（P<0.01）；黄芩苷、去铁胺治疗8w均可显着减少黑质DA能神经元（TH阳性细胞）脱失（P<0.01），体现了黄芩苷、去铁胺对黑质DA神经细胞有保护作用；而黄芩苷、去铁胺组纹状体TH染色无明显变化（P>0.05）；（4）各组大鼠纹状体DA及其代谢物HVA,DOPAC含量均无显着性变化；（5）模型大鼠海马尼氏小体染色积分光密度值（IOD）较正常组显着减少（P＜0.01），黄芩苷和去铁胺给药治疗8w后，海马尼氏小体染色IOD较模型组显着增加（P＜0.01或P＜0.05）（6）模型大鼠海马区DCX （Doublecortin）染色IOD较正常组明显减少（P＜0.01），而黑质部位DCX染色IOD较正常组显着性增加（P＜0.01）。黄芩苷和去铁胺给药治疗8w后，黄芩苷组海马区IOD均显着性增加（P＜0.01）,去铁胺组无明显变化；黄芩苷组、去铁胺组黑质DCX染色IOD均显着性降低（P＜0.01）2黄芩苷对鱼藤酮PD大鼠不同脑区铁积聚以及多脏器铁代谢的影响（1）模型大鼠纹状体苍白球、黑质致密部、海马齿状回颗粒细胞层、小脑齿状—间位核及小脑面神经核中铁染色积分光密度值较正常组明显增多(P＜0.01)；黄芩苷、去铁胺给药治疗8w组大鼠上述脑区铁染色积分光密度值均显着减少(P＜0.01)。（2）模型大鼠肝脏铁含量较正常组大鼠有显着性增加(P<0.01)，肾脏铁含量显着减少（P<0.05）；黄芩苷组、去铁胺组治疗8w组大鼠肝脏铁含量显着降低(P<0.01或P<0.05)。而肾脏中铁含量无显着性变化。（3）模型组大鼠肝脏脂质过氧化水平显着增加（P<0.05），心脏、肾脏、小脑MDA含量均无明显变化；黄芩苷组和去铁胺给药治疗8w组大鼠上述脏器组织脂质过氧化水平无明显变化。3黄芩苷对鱼藤酮PD大鼠中脑黑质铁积聚及转运相关蛋白表达的影响（1）电感耦合等离子发射光谱法检测模型大鼠中脑黑质铁含量较正常组大鼠有显着性增加(P<0.01)，黄芩苷组和去铁胺组治疗8w组大鼠黑质铁含量显着降低(P<0.01)。（2）模型大鼠黑质DMT1蛋白表达较正常组显着性增加（P＜0.01），FP1蛋白表达较正常组显着减少（P＜0.01）；给药治疗8w后，黄芩苷组、去铁胺组DMT1蛋白表达显着下调（P＜0.01），去铁胺组FP1蛋白明显上调（P＜0.05），黄芩苷组无显着性变化。结论(1)鱼藤酮PD大鼠脑内纹状体苍白球，黑质致密部，海马齿状回颗粒细胞层，小脑齿状-间位核，小脑面神经核区域均存在铁的异常积聚，此一发现未见报道。PD大鼠肝铁升高，肾脏铁降低，可能存在多脏器铁代谢紊乱。人们已经明确认识到帕金森病患者的运动障碍是以锥体外系功能障碍为主的复杂症候群。铁的异常积聚可能不止存在对纹状体-黑质-多巴胺能系统的损伤，还可能存在对多脑区的影响，从而引发脑内多核团的退行性病变，提示抑制铁积聚在治疗PD中可能是药物作用的重要环节。(2)电感耦合等离子光谱法亦证明鱼藤酮PD大鼠中脑黑质铁含量显着升高，印证了铁染色的结果。同步发现DMT1表达增加、FP1表达降低，证明铁转运蛋白DMT1和FP1参与了黑质铁积聚的发生与发展，并进一步促进了DA能神经细胞损伤和帕金森病的发展。(3)黄芩苷能调节DMT1的表达，抑制不同脑区铁的异常积聚，降低肝脏铁含量调节多脏器铁代谢，减少细胞死亡，这可能是其保护DA神经的机制之一。与黄芩苷相比，去铁胺也表现出明显的DA能神经元保护作用，并且可同时调节DMT1、FP1的表达，减少中脑黑质铁的积聚。(4)黄芩苷、去铁胺可抑制鱼藤酮PD大鼠脑内纹状体苍白球，黑质致密部，海马齿状回颗粒细胞层，小脑齿状-间位核，小脑面神经核区域铁的异常积聚，还可降低肝脏铁含量调节多脏器铁代谢。此结果提示：黄芩苷、去铁胺的作用与螯合体内的铁有关。(5)鱼藤酮PD模型纹状体、黑质DA能神经元显着缺失，黄芩苷、去铁胺保护DA神经的作用机制可能主要与抑制多脑区铁积聚、从而抑制了铁转运蛋白DMT1、FP1表达改变有关。
姜新[10]2017年在《虫草素对鱼藤酮诱导的PD模型多巴胺能神经元的保护作用及其抗凋亡机制研究》文中指出目的:探讨虫草素(Cor)对鱼藤酮(Rot)诱导的PD模型多巴胺(DA)能神经元的保护作用及其抗凋亡机制。方法:1.体内实验:大鼠皮下注射(s.c.)Rot 1.0 mg/kg/d,早晚各一次,共给药30天制备PD大鼠模型。实验分为对照组(i.g.生理盐水)、模型组和Cor低剂量组(2.5 mg/kg)、Cor中剂量组(5.0 mg/kg)和Cor高剂量组(10.0mg/kg)。Cor提前3天i.g.给药,每天一次,共33天。以评分法和网格实验考察大鼠行为学变化,HE染色观察黑质DA能神经元形态,TH免疫组织化学检测黑质致密部TH免疫阳性细胞数目,HPLC-ECD法测定纹状体DA、5-HT及其代谢产物的含量。2.体外实验:1.0 μmol/L Rot作用PC 12细胞48h制备PD细胞模型。实验分为对照组(0.01%DMSO)、模型组和Cor给药组(0.4×10-6、2.0×10-6、8.0×10-6μmol/L)。Cor预先加入一定时间后再加入Rot,共同作用48h。MTT法测定细胞存活率,AnnexinV/PI流式细胞仪测定细胞凋亡比率,DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量,罗丹明123染色检测细胞线粒体膜电位,RT-qPCR 和 Western blotting 测定细胞内 Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Cleavedcaspase-9、Fas 和胞浆中 Cyt-c 的表达。结果:1..Cor对Rot诱导的PD大鼠黑质DA能神经元的保护作用给药30天后,模型组大鼠出现震颤,单侧旋转,少数出现单侧瘫痪等现象,与对照组相比,行为学评分显着增多(P<0.01),网格实验中移动潜伏期明显延长(P<0.01)。黑质神经元细胞稀疏、胞体小、核变大、轮廓模糊,胞内有气泡形成,有的出现嗜酸性细胞,TH免疫阳性神经元的数目较对照组明显下降(P<0.01),纹状体中DA、DOPAC、HVA、和5-HT、5-HIAA的含量也均显着降低(P<0.01)。Cor预处理后,大鼠上述运动障碍得到明显改善,行为学评分显着下降(P<0.01),移动潜伏期明显缩短(P<0.01),黑质中存活神经元细胞数目明显增加,嗜酸性细胞消失,神经元细胞的形态得到改善,TH免疫阳性神经元数目较模型组明显增多(P<0.05,P<0.01),纹状体中上述神经递质及其代谢产物的含量均显着增高(P<0.01),作用随剂量的增加而增强。结果提示Cor具有保护PD大鼠DA能神经元的作用。2.Cor抑制Rot诱导的PC12细胞凋亡作用的机制研究(1)对细胞损伤及凋亡的影响:与对照组相比,Rot使PC12细胞存活率明显下降(P<0.01),细胞早、晚期凋亡以及总凋亡率显着上升(P<0.01),同时细胞内Caspase-3 mRNA和蛋白的表达量明显升高(P<0.01)。不同浓度Cor分别预处理12h,24h和36h后,细胞存活率较模型组相比均有显着提高(0.4×106μmol/LCor预处理12h组除外),预处理24h作用最好。Cor干预后,细胞早期及晚期凋亡细胞明显减少,总凋亡率显着下降(P<0.01)。与模型组比较,Caspase-3 mRNA和蛋白表达量未有明显变化(P>0.05),但Cleaved caspase-3的表达量显着降低(P<0.01),Cor上述作用随剂量增加而增强。提示Cor能够抑制Rot诱导的细胞凋亡。(2)对细胞内ROS含量的影响:与对照组比较,模型组细胞ROS比值显着升高(P<0.01),Cor预处理24 h后,ROS比值明显下降(P<0.01),剂量越大作用越强。表明Cor能够降低细胞内ROS的含量,抑制Rot诱导的氧化应激反应。(3)对介导细胞凋亡的线粒体途径研究:与对照组相比,模型组细胞中Bax、Caspase-9 mRNA和蛋白表达均显着增加(P<0.01),而Bcl-2 mRNA及其蛋白表达明显降低(P<0.01),Bcl-2/Bax比值显着下降(P<0.01);同时检测到MMP下降(P<0.01),胞浆中Cyt-c蛋白水平也显着增加(P<0.01)。Cor预处理24 h后,细胞内Bax表达量明显下降(P<0.01),Bcl-2表达量显着升高(P<0.01),Bcl-2/Bax比值也随Cor浓度增加而上升。同时,Cor还使MMP显着升高(P<0.05,P<0.01),胞浆中Cyt-c蛋白水平明显降低(P<0.01),Cor浓度越大作用越强。此外,Cor的干预对Caspase-9的表达没有明显影响(P>0.05),但能显着降低细胞内Cleaved caspase-9的表达量(P<0.01)。提示Cor可能是通过线粒体途径发挥抑制细胞凋亡的作用。(4)对介导细胞凋亡的死亡受体途径研究:模型组细胞内Caspase-8、Fas mRNA及其蛋白表达量与对照组比较均明显升高(P<0.01)。Cor预处理后,细胞内Caspase-8、Fas表达量与模型组相比明显降低(P<0.05,P<0.01),8.0×10-6μmol/LCor作用最明显。提示Cor对Rot诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用与死亡受体途径有关。结论:Cor对Rot诱导的PD大鼠DA能神经元损伤具有保护作用,这一保护作用可能与减少氧化应激损伤,改善线粒体功能障碍,并通过线粒体途径和死亡受体途径共同发挥抑制细胞凋亡作用有关。
参考文献：
[1]. 鱼藤酮对大鼠多巴胺神经和PC12细胞毒性作用研究[D]. 李云鹏. 第叁军医大学. 2004
[2]. 线粒体质量控制在鱼藤酮诱导的多巴胺神经元变性损伤中的作用及机制研究[D]. 彭凯歌. 第叁军医大学. 2017
[3]. 多巴胺代谢功能障碍在鱼藤酮多巴胺神经元毒性中作用研究[D]. 赛燕. 第叁军医大学. 2006
[4]. 菟丝子中黄酮类提取物的神经保护活性研究[D]. 真国辉. 大连理工大学. 2006
[5]. 鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集及其机制的研究[D]. 胡丹. 华中科技大学. 2008
[6]. 鱼藤酮对星形胶质细胞谷氨酸转运系统的作用及其机制研究[D]. 刘辉. 第叁军医大学. 2007
[7]. 鱼藤酮损伤PC12细胞的机制研究[D]. 赵黔鲁. 河北医科大学. 2005
[8]. 姜黄素对多巴胺能细胞的保护作用及其机制的实验研究[D]. 崔群力. 华中科技大学. 2010
[9]. 黄芩苷对帕金森病大鼠多脑区铁积聚及黑质DMT1、FP1的影响[D]. 熊佩. 首都医科大学. 2013
[10]. 虫草素对鱼藤酮诱导的PD模型多巴胺能神经元的保护作用及其抗凋亡机制研究[D]. 姜新. 扬州大学. 2017
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