王自章[1]2001年在《农杆菌介导海藻糖合酶基因遗传转化甘蔗研究》文中研究说明甘蔗是我国重要的工业原料作物，但85％左右的种植面积是旱地，而各蔗区每年或轻或重、或早或迟都要受到季节性干旱的影响，干旱是限制我国甘蔗生产的首要环境因素。甘蔗是高度杂合、遗传背景复杂的无性繁殖作物，常规的抗旱选育方法盲目性大，周期长，效果也有限。基因工程方法可以将外源的抗旱基因在人为调控操纵设计下导入优良品种，通过基因表达提高甘蔗的抗旱性，这就为甘蔗抗旱育种开辟了一条新的途径。 本研究将来自担子菌灰树花的海藻糖合酶基因TSase插入到中间载体pBBB双拷贝35s启动子下面构建植物表达载体pBBBT，然后导入超毒力农杆菌EHA105菌株。通过农杆菌介导法转化甘蔗的胚性愈伤组织，在PPT的选择压力下，筛选抗性植株，通过PCR和斑点Southern杂交鉴定海藻糖合酶基因的转化整合。同时，为了检验所使用基因在异位表达的功能还进行了烟草转化试验；为了比较不同类型启动子和不同海藻糖合成途径在甘蔗体内表达的效率，还克隆了拟南芥干旱诱导型启动子Prd29A及大肠杆菌海藻糖磷酸合酶基因OtsA，植物表达载体正在构建之中。 研究工作获得如下几个方面的结果： 1、构建了灰树花海藻糖合酶基因植物表达载体pBBBT。该载体的目的基因启动子为双拷贝的CaMV35s启动子，抗性选择标记为bar基因。 2、在国内首次获得农杆菌介导转化的甘蔗转基因植株。经过连续的PPT选择抗性筛选，获得了56株抗性植株，对其中8株进行PCR及斑点Southern杂交检测，有3株呈阳性反应，证明外源基因已整合到甘蔗基因组中。 3、建立一个可行有效而又较简捷的甘蔗农杆菌介导转化系统。以甘蔗胚性愈伤组织为受体细胞，并通过短时的亚培养及干燥处理提高其感受能力；采用超毒菌株EHA105介导；同时组合了各种便于Vir基因活化和T-DNA转移的转化条件，如附加AS及果糖和葡萄糖、酸性环境感染、较低温度共培养等；使用抗PPT的bar基因作选择标记基因，在0.75mg/L浓度下连续筛选。 4、观察不同培养龄期甘蔗愈伤组织的生长状态，并进一步观察胚状体的发生及分化，为甘蔗转化提供了可靠的受体细胞。 5、以农杆菌EHA105菌株介导将海藻糖合酶基因转化烟草叶盘，经分子检测证明，已获得了转基因烟草植株。 6、克隆了拟南芥干旱诱导型启动子Prd29A及大肠杆菌海藻糖磷酸合酶基因OtsA。 7、观察到部分甘蔗转化子形态上的改变，如植株生长慢，株型矮小纤细，叶片曲折长出或尖细直立，发根困难，根变粗短或且变纤细曲折，并常带有绿、褐等颜色。
孙敏善[2]2013年在《小麦籽粒中叁个淀粉代谢调控相关基因的克隆及其表达特性分析》文中进行了进一步梳理小麦籽粒发育过程是小麦产量和品质形成的关键时期,而胚乳中淀粉的代谢调控直接决定着小麦的千粒重和面粉的加工品质。本文在前期分析小麦种子发育过程中蛋白质组差异的基础上,克隆了3个可能参与小麦籽粒淀粉代谢调控的相关基因,并分析了它们在种子发育过程中的表达特性,为进一步探讨小麦淀粉代谢的分子调控机制提供了重要信息。已有研究发现,6-磷酸海藻糖在禾本科植物种子发育过程中可能参与淀粉代谢的调控,关于其在小麦籽粒淀粉代谢调控过程中的功能还知之甚少。本文首次克隆了普通小麦中海藻糖-6-磷酸合酶基因的3个转录本:Ta TPS-1.1、TaTPS-1.2和TaTPS-1.3,基因组结构分析显示,克隆片段区域包括大小不等的14个内含子序列。表达特性分析显示,在洛旱2号小麦籽粒发育过程中TaTPS-1的叁个转录本均呈单峰上调表达模式,授粉后15-25天期间的表达量较高。叁个转录本之间比较来看,TaTPS-1.1的总体表达量要远远高于其它两个转录本,推断TaTPS-1.1在种子发育过程中发挥主导作用。在中国春种子发育过程中,TaTPS-1的叁个转录具有不同于洛旱2号的表达模式;其中,TaTPS-1.1在种子发育前期的表达量较高,而在授粉25天后迅速下调表达;TaTPS-1.2在授粉后20天的表达量最高,TaTPS-1.3却呈单峰上调表达趋势。在矮抗58中,TaTPS-1.1和TaTPS-1.2在授粉后15天的表达量最高,而TaTPS-1.3呈下调表达趋势。综合分析发现,TaTPS-1.1可能在籽粒灌浆过程中发挥重要作用,TaTPS-1.2的作用较弱,而TaTPS-1.3的表达模式在品种间存在较大差异。淀粉酶抑制剂是一类在种子发育过程中大量积累的储藏蛋白,可能参与了小麦内源淀粉代谢的调控,有关该类蛋白在种子发育过程中的生物学功能仍不很清楚。本研究从普通小麦种子中克隆了α-淀粉酶抑制剂基因的3个转录本,分别命名为TaAAI-1.1、TaAAI-1.2和TaAAI-1.3。TaAAI-1.1和TaAAI-1.2包含152个氨基酸,而TaAAI-1.3则在编码区缺失了7个氨基酸,而这一缺失也导致该蛋白缺失了一个α-淀粉酶的结合位点(alpha-amylase bindingite)。表达特性分析显示,Ta AAI-1的叁个转录本在种子发育过程中呈现出相似的表达模式,其表达量与籽粒灌浆速率正相关,推测其在籽粒淀粉积累过程中发挥重要功能。不过,TaAAI-1.3的表达极低,推测其调控作用较微弱。h型硫氧还蛋白是一类在植物中广泛存在的氧化还原调控分子,在植物生长发育过程中发挥重要的调控功能。在前期的研究中发现,小麦的h型硫氧还蛋白基因TaTrx-h9抑制表达后籽粒淀粉的积累动态发生了显着的改变,并对面粉加工品质产生了一定的影响。本文克隆了包含完整编码区的小麦TaTrx-h9基因TaTrx-h9.1和TaTrx-h9.2。表达特性分析显示,TaTrx-h9在所检测的叁个小麦品种,均表现为籽粒发育早期(授粉后5天时)的表达水平最高,之后随着籽粒的不断发育其表水平有所下降;不过,在种子中的总体表水平很高,其表达丰度和内标基因actin相接近,这预示着该类基因在种子中发挥重要的调控功能。
侯健[3]2016年在《小麦蔗糖合酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在籽粒形成中的遗传效应及全球育种选择研究》文中研究表明在我国小麦产量的提升主要归因于单产的提升,单产主要依赖叁个因素,即亩穗数、穗粒数和千粒重。淀粉占到籽粒的65%到80%,因此淀粉合成在很大程度上影响小麦的千粒重。在籽粒中,淀粉合成途径上的蔗糖合酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是两个关键酶。本研究通过两个酶基因的单元型与产量性状(主要是千粒重)的相关性分析,寻找与高千粒重相关的单元型,并研究这些单元型在小麦育种过程中的变化情况。主要研究结果如下:1.同源克隆获得6个小麦蔗糖合酶基因Ta Sus2-2A/2B/2D和Ta Sus1-7A/7B/7D,其中Ta Sus2-2A、Ta Sus2-2B、Ta Sus1-7A、Ta Sus1-7B编码区存在多态性位点,分别形成2、2、5、2种单元型。针对这些单元型分别开发了有效分子标记,并扫描群体。在348份我国小麦育成群体中,单元型Ta Sus2-2A-Hap-A的叁年千粒重均极显着高于-Hap-G(P<0.001),Ta Sus1-7B-Hap-T的叁年千粒重极显着高于-Hap-C(P<0.001),这两个优异单元型在我国小麦60多年的育种过程中比例提升了40%。通过近等基因系检测,发现Ta Sus2-2B-Hap-H与Ta Sus1-7A-Hap-1/2为优异单元型。在地方品种到育成品种的演化过程中,这些优异单元型的比例均有不同程度的提高。在近等基因系中,Ta Sus2-2A和Ta Sus1-7A的优异单元型在花后15天的籽粒中相对表达量高于非优异单元型,这与酶活测定结果相吻合。Ta Sus1-7A-Hap-1/2在地方品种及育成品种中的比例都超过95%,其非优异单元型的连续两个氨基酸变异可能造成该酶结合底物能力的下降;该基因可能在四倍体中就受到选择作用。上述四个基因的优异单元型在全球6个小麦产区的比例都很高,表明全球小麦育种对Ta Sus优异单元型的正向选择。2.同源克隆获得9个小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶TaAGP-S1-7A/7B/7D、Ta AGP-S2-5A/5B/5D和Ta AGP-L-1A/1B/1D,其中Ta AGP-S1-7A和Ta AGP-L-1B编码区和启动子区均存在多态性位点,分别形成4种单元型。近等基因系检测发现Ta AGP-S1-7A-1/2和Ta AGP-L-1B-Hap-1/2/3与高千粒重关联,为优异单元型(-Hap-I)。开发了它们的有效分子标记,在我国微核心群体及育成群体中进行验证得到了相同的结论。Ta AGP-S1-7A非优异单元型的一个外显子突变造成了酶结合底物的不稳定;Ta AGP-L-1B非优异单元型-122处的SNP使启动子驱动能力下降,在转基因水稻中验证了该结论。在我国小麦育种过程中,两个基因优异单元型的比例均提升了50%以上,优异单元型组合也受到了显着的正向选择。Ta AGP-S1-7A可能在四倍体中受到选择作用。3.六种优异单元型(Ta Sus2-2A-Hap-A、Ta Sus2-2B-Hap-H、Ta Sus1-7A-Hap-1/2、Ta Sus1-7B-Hap-T、Ta AGP-S1-7A-1/2和Ta AGP-L-1B-Hap-1/2/3)组合在千粒重上具有明显的加性效应,优异单元型数随育种过程逐渐增多,但最优组合的比例与欧美群体还有一定差距,表明我国小麦育种在这些基因上还有选择空间。
唐先兵[4]2001年在《脱水素基因BDN1双元表达载体的构建与农杆菌介导叶盘法转化烟草》文中认为随着生物技术的迅速发展，特别是植物基因工程技术的飞速发展，植物耐旱研究已从传统的生理研究转向分子方向的研究。利用植物基因工程技术进行植物耐旱研究，包括耐旱相关基因的克隆、分离、鉴定以及通过遗传转化获得耐旱植株。 脱水素（dehydrins）是当前植物耐旱研究的一个热点，脱水素通常大量存在于复苏植物、植物种子、或水胁迫条件下的植物体内。在实验中，我们分别构建了以脱水素基因BDN1为目的基因、筛选基因为NPTⅡ的双元表达载体pBI121BDN1和Bar基因作为抗性筛选基因、在单子叶启动子Ubiquitin promoter启动下表达的基因枪表达载体pAHC25BDN1。以及利用6-磷酸-海藻糖合酶基因（TIS）作为目的基因，Bar基因作为抗性筛选基因，在单子叶启动子Ubiquitin promoter启动下表达的基因枪表达载体pAHC25TPS。将构建好的双元表达载体pBI121BDN1转入农杆菌中，用农杆菌介导叶盘燃化烟草W38。共获得20株具有Kan抗性的转化烟草。SDS法提取转化烟草植株的总DNA，并用PCR初步鉴定有8株烟草出现与目的基因大小相同的DNA条带（800bp左右）其余为Kan假阳性。进一步用DIG标记的Southern杂交进行检测，有两株烟草出现相应的杂交带。转化烟草耐旱能力的检测正在进行中。单子叶表达载体pAHC25BDN1、pAHC25TPS转化玉米、草坪草的工作也正在进行中。
黄春丽[5]2015年在《PEG-6000模拟干旱胁迫下小偃麦异附加系SN6306差异表达基因的筛选》文中提出在我国,小麦是主要的食物,也是食品工业的主要原料,种植面积及产量仅次于玉米与水稻,居于第叁。由于我国小麦的种植地区大部分分布在干旱、半干旱地区。因此,挖掘小麦抗旱新基因,选育和推行抗旱性强的小麦品种是促成我国农业可持续发展的有效途径之一。本研究以小偃麦异附加系SN6306(小麦品种烟农15和中间偃麦草杂交所得到的)为研究对象,利用GeneFishing技术对经20%PEG-6000模拟干旱处理后的SN6306上调表达基因进行筛选。所得结果如下:(1)SN6306萌发期抗旱性的鉴定利用SN6306,YN15(不抗旱对照)和洛旱2(抗旱对照))鉴定了SN6306萌发期和苗期的抗旱性。用去离子水或用20%PEG 6000溶液培养SN6306,YN15和洛旱2号的小麦种子,通过测量根长,芽长和胚芽鞘长以及计算伤害率和抗胁迫系数,发现SN6306与其亲本YN15相比,抗旱性较强。(2)SN6306苗期抗旱性的鉴定在苗期的抗旱鉴定中,通过计算复水6天中的小麦各个品种的存活率,得出:SN6306、YN15和洛旱2号的存活率明显不同,SN6306的存活率最高,洛旱2号的次之,YN15的存活率最低。截止到第6天,SN6306的存活率为52.5%,洛旱2号的存活率为43.13%,YN15的存活率为26.25%。(3)GeneFishing-PCR技术筛选差异基因利用GeneFishing技术获得SN6306干旱诱导后上调表达或新出现的差异表达片段(DEGs)111个。经过使用Blast2GO软件,参照大量文献,发现了42条与干旱胁迫有关的差异表达片段,分别参与光合作用,蛋白质的合成与降解,渗透调节和活性氧的清除,信号转导,胁迫相关蛋白转运和离子平衡等过程。(4)小麦TaXTH基因的克隆及生物信息学分析在得到的111个差异表达片段中,其中有一条大小约为600 bp的木葡聚糖转糖苷酶/水解酶基因的一段序列。经PC R扩增和测序得到长度为1049bp的c DN A序列和2337bp的DNA序列。TaXTH具有3个外显子(长度分别为306bp、209bp和421bp),2个内含子(长度分别为170bp和1118bp),包含936 bp的开放阅读框,共编码311个氨基酸残基。具有信号肽,相似性比对分析结果表明该蛋白与小麦的近缘物种二穗短柄草中的同源蛋白一致性达到79%。TaXTH蛋白含有XET/XTH所具有催化酶触反应的保守基序DEIDFEFLG。(5)小麦TaTPP基因的克隆及功能初步分析在GeneFishing的电泳结果中,得到大小约553bp小麦海藻糖6-磷酸磷酸酯酶基因的一段序列。经克隆测序得到编码区长度为1221bp,编码406个氨基酸。TaTPP不含信号肽,属于HAD蛋白超家族。Ta TPP蛋白质序列与其它物种的TPP蛋白质具有较高的相似性,并且与山羊草和二穗短柄草具有较近的亲缘关系。采用半定量RT-PCR分析对TaTPP在干旱处理下不同时间点的表达模式进行了分析。结果表明在干旱胁迫下,随着干旱胁迫时间的延长,TaTPP在0 h表达量很小,12 h时表达量达到了最大值,随后表达量又逐渐下降,直至48 h是达到基础表达水平。(6)构建转小麦和拟南芥的植物表达载体成功构建转小麦的植物表达载体pUbi-TPP和转拟南芥的植物表达载体pRTPP,拟通过小麦和拟南芥的转化进一步分析TaTPP基因的功能。
吴斌[6]2003年在《海藻糖合成酶基因克隆及其转化草莓的研究》文中指出干旱是影响植物生长发育和限制农作物产量提高的主要环境因子。利用传统的方法至今尚未培养出真正的耐旱、耐盐品种。植物耐旱分子机制的研究和生物技术的日臻完善，为培育高效耐旱植物迎来了曙光。 海藻糖是由两个葡萄糖分子以α、α1→1糖苷键结合的非还原性双糖，对许多生物的抗逆耐受性起着重要作用。酵母细胞中的海藻糖由TPS1、TPS2，TPS3和TSL1四个基因负责合成，其编码的多肽组成一个海藻糖合酶复合体。TPS1基因编码UDP-葡萄糖依赖性的海藻糖-6-磷酸合酶，TPS2基因编码海藻糖-6-磷酸酯酶，TPS3和TSL1两个基因的产物可能对复合体起稳定和调节作用。实验证实TPS1基因就可以使生物体获得产生海藻糖的能力，酵母的海藻糖合成酶复合体中6-磷酸-海藻糖的脱磷酸化作用是非特异性的，它可由生物体内的其它酯酶所代替。 提取酿酒酵母的总DNA，以此为模板，采用PCR的方法从酿酒酵母中克隆出了1.488kb的海藻糖合成酶基因TPS1片段，通过XbaⅠ和SmaⅠ双酶切，与同样经过XbaⅠ和SmaⅠ双酶切的pUC118载体质粒连接，转入大肠杆菌DH5α中，通过蓝白斑筛选重组子。经过酶切和PCR鉴定表明TPS1基因克隆进载体中。将克隆出的序列进行了测序。 通过同样方法将该片段连接到pBI121载体上，转化海藻糖合成酶基因缺失的大肠杆菌(菌株号FF4169，FF4169：MC4100 otsA1：：Tn10，MC4100为otsBA~+基因野生型菌株)。生长曲线表明，带有克隆片段的转化株在0.5mol／L NaCl的高渗透压培养基中生长良好，而作为对照的缺失株则几乎不能生长。这表明克隆所得到的片段具有海藻糖合成酶活性。 将带有TPS1基因的pBI121载体转入根癌农杆菌LBA4404中，构建了双元转化载体，经菌落原位杂交鉴定，证明TPS1基因已经转入农杆菌中。 采用叶盘法利用转化了的农杆菌对草莓进行侵染，用无菌滤纸吸干叶片上多余菌液，在培养基上共培养叁天，共培养后的叶片在附加40mg／L Kan和200mg／L Cef的再生培养基上选择培养，筛选出的不定芽在附加25mg／L Kan的草莓继代培养基上继续筛选培养并增殖，增殖后的草莓植株转入附加25mg／L Kan的生根培养基上生根，提取生根后抗性植株的DNA，经过PCR和点杂交鉴定，证实所获得植株为转化植株。
刘佳明[7]2017年在《小麦TaPPR4基因的克隆及其功能研究》文中研究说明PPR(pentatricopeptide repeats)基因组成陆生植物中最大的基因家族。真核生物的PPR基序由35个简并氨基酸序列串联阵列形成,并且通过序列特异的结合发挥修饰DNA或RNA的功能,大多数高等植物PPR基因定位在叶绿体和线粒体中,其功能主要是调节植物的叶绿体和线粒体基因的表达。有些PPR蛋白的C-末端存在额外的结构域,最普遍的就是E和DYW结构域,也包括一些DNA或RNA链接结构域,如Small Mut S-related(SMR)结构域。尽管成员很少,然而它们具有非常重要的生理功能,可是潜在的调节机制还不清楚。本研究克隆了一个小麦TaPPR4基因,该基因编码蛋白拥有2个PPR和1个SMR结构域。通过生化与遗传学的方法研究了TaPPR4基因对植物生长发育的影响,分析了该基因在小麦蔗糖信号传递过程中的作用。主要研究结果如下:1.系统进化分析表明TaPPR4的同源基因可以在苔藓(Physcomitrella patens)中找到,说明TaPPR4的同源基因出现在PPR蛋白家族早期的进化过程中。然而多重序列比对分析表明TaPPR4的同源基因仅仅在单子叶植物中是非常保守的。2.构建了亚细胞定位载体p16318-TaPPR4-GFP和p16318-pTAC2-mCherry,利用PEG介导的方法共同转化小麦原生质体,结果表明TaPPR4蛋白定位在叶绿体上,且GFP与mCherry信号能够完美迭加,说明TaPPR4与pTAC2可能拥有相似的功能。3.通过qRT-PCR,TaPPR4基因启动子GUS染色和mRNA原位杂交的方法研究TaPPR4基因组织特异性表达,结果表明TaPPR4基因在植物生长发育不同时期的不同组织中均广泛的表达。4.构建了TaPPR4基因过表达(TaPPR4-OX)和RNAi干扰(RNAi)植物表达载体,并通过基因枪转化方法,转化小麦愈伤组织得到TaPPR4-OX和RNAi株系。与野生型相比,RNAi株系没有明显的表型差异,但是TaPPR4-OX小麦株系生长发育提前,同时TaPPR4-OX株系的根长缩短,株高变高,分蘖数降低,穗长变长,穗粒数降低,种子也不饱满。5.通过qRT-PCR的方法检测了野生型、RNAi和TaPPR4-OX植株中叶绿体编码基因的表达情况。结果显示Ta PPR4基因干扰和过表达影响小麦叶绿体基因atpE的表达。6.利用酵母双杂交的原理,以TaPPR4蛋白为诱饵筛选小麦cDNA文库,找到TaPPR4可能的互作蛋白TaSnRK1。通过酵母双杂交、BIFC与CO-IP叁种方法分别验证了TaPPR4和TaSnRK1的互作情况,结果表明这两个蛋白在叶绿体上互作。7.TaPPR4基因受蔗糖诱导表达,同时该基因能够影响糖信号传导有关基因的表达,过表达小麦植株表现为对高浓度蔗糖不敏感。TaPPR4基因的过表达,能够调节TaTPS1基因的表达,从而改变T6P的含量影响TaSnRK1蛋白的活性,进而影响植物生长和发育。
林荆[8]2009年在《垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SpTPS1）的克隆及其功能分析》文中指出水是植物生命活动的物质基础,干旱对植物有广泛的影响。在干旱胁迫条件下,植物新陈代谢发生变化,生理活动受到阻碍,生长发育各阶段受到影响,植物出现萎蔫现象。垫状卷柏(Selaginella pulvinata Maxim),俗称“九死还魂草”,极耐干旱。它能经受脱水与再水化的循环,一旦获得水分,植物枯黄卷缩的部分可以迅速张开,重新复活。有研究表明垫状卷柏这类复苏植物体内含有大量的应激代谢物—海藻糖。海藻糖对生物体有特殊保护作用,它能使许多生物在高温、脱水和冷冻等异常条件下仍保持原活性。以UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖为底物的海藻糖合成途径广泛存在于细菌、真菌和植物体内,其中由TPS1基因编码的海藻糖-6-磷酸合成酶是合成途径的关键酶。研究人员已在植物体内克隆出了TPS1基因,但除了在复苏植物体内检测到大量海藻糖积累外,在其他植物体内没有检测到海藻糖的存在。国内外已有将酵母和大肠杆菌的TPS1基因对植物体进行遗传转化研究,转化植株体内海藻糖含量有所增加,抗旱性得到增强,但植株在生长发育和形态上有不同程度的改变。探索利用耐旱能力高,适宜玉米生理代谢机制与生产要求的耐旱基因,是转基因耐旱玉米培育的技术关键。本研究选择了极耐旱的垫状卷柏做为试验材料,采用RACE技术克隆海藻糖-6-磷酸合成酶基因(SpTPS1),全长3223 bp,包含一个2790bp的完整开放阅读框(ORF),并对SpTPS1基因进行核酸序列和成熟蛋白生物信息学的初步分析。为了研究垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因(SpTPS1)的功能,将SpTPS1基因的开放阅读框ORF亚克隆到载体pUC119中,构建载体OpUC119。然后选择适当的酶切位点分别酶切载体OpUC119和质粒载体pRS6/AtTPS1,将ORF片段与质粒载体骨架pRS6相连,最终得到真核表达载体OpRS6。用LiAc转化法将真核表达载体OpRS6和阳性对照质粒pRS6/AtTPS1转入缺失酵母菌株tps1△,YSH290中,转化混合液涂在缺失组氨酸的半乳糖培养基上培养。结果显示野生型菌株W303-1A和缺失酵母菌株tps1△不能在培养基上生长;转化了载体OpRS6和阳性对照质粒pRS6/AtTPS1的菌株能在缺失组氨酸的半乳糖培养基上生长。将培养基中的2%半乳糖换为2%葡萄糖,挑选阳性转化子划线于该培养基中。结果显示野生型菌株W303-1A和缺失酵母菌株tps1△不能在缺失组氨酸的葡萄糖培养基上生长;转化了载体OpRS6和阳性对照质粒pRS6/AtTPS1的菌株tps1△,由于恢复了功能,故能在含有葡萄糖的培养基上生长。提取阳性菌株质粒DNA,经PCR检测正确。通过酵母功能互补试验证明了SpTPS1基因具有编码海藻糖-6-磷酸合成酶的功能。本研究从垫状卷柏中克隆了具有抗旱耐盐的SpTPS1基因,它作为培育抗旱耐盐新品种的抗旱基因,具有广泛的应用价值。并为后续的抗旱耐盐转基因新品种的培育提供了耐旱能力更高,适宜玉米生理代谢机制与生产要求的耐旱基因。
罗音[9]2007年在《外源海藻糖提高小麦耐热性的生理机制研究》文中认为海藻糖(α-D-糖苷键,α-D-糖苷键)是由两个葡萄糖分子组成的二糖。十九世纪初在黑麦的麦角菌中首先发现它的存在。随后在细菌、真菌、真核微生物、昆虫和无脊椎动物中发现也都有海藻糖。对于植物而言,一直认为海藻糖只存在于复苏植物中起胁迫保护作用。但是,近年来的研究发现,海藻糖代谢在植物中也是普遍存在的。海藻糖因为没有还原端使得其非常耐热、pH变化和梅拉德褐变(碳水化合物与氨基酸之间的一种反应)。另外,海藻糖可以稳定生物膜和生物大分子,脱水后能形成玻璃状结构。因此,海藻糖被认为是一种有效的食品稳定剂、化妆品和药物的添加剂。过去,对于海藻糖的研究大多以微生物为实验材料,研究其对生物结构的保护作用,而以植物为实验材料的研究较少。随着大气中CO2浓度的增加,全球平均气温在今后会日趋升高。高温对植物的生长、生存及产量都会产生不利影响。尽管温度会通过许多因素影响作物产量,但高温对生理过程的直接影响起着主要作用,热胁迫诱导的光合作用的降低会降低作物的整体产量。因此,随着全球温度变暖,深入研究热胁迫影响光合作用的机制,探讨提高植物抵抗热胁迫的途径和方法显得尤为重要。鉴于此,在本课题研究了海藻糖对小麦耐热性的改善作用及其生理机制,尤其是海藻糖对光合作用的影响及对光合机构的保护。胁迫处理为在40℃下分别处理12、24和36小时,然后在室温下恢复12小时。选用0.5 mmol/L、1.0 mmol/L及1.5 mmol/L叁种海藻糖浓度根施处理小麦幼苗。主要结果与结论如下:1适量的海藻糖是小麦正常生长的基础。在正常生长条件下,1.5mM海藻糖预处理没有提高小麦叶片中海藻糖的含量。另外,低浓度的海藻糖预处理促进了小麦生长,而高浓度抑制了生长。在12 h和24 h热胁迫条件下,海藻糖对小麦生长没有显着影响。而随着海藻糖浓度的升高,在严重的36 h热胁迫条件下,小麦生长受到抑制。在恢复常温后,海藻糖预处理对小麦生长有一定的促进作用。然而,随着热胁迫处理时间的延长,小麦不能恢复正常生长,特别是在36h高温及其恢复过程中海藻糖预处理抑制了根系的伸长。2在36 h热胁迫处理及12 h和24 h高温胁迫后的恢复过程中,海藻糖预处理提高了叶片含水量,这可能与其对水孔蛋白的保护有关。3在36 h热胁迫后的恢复过程中,海藻糖在一定程度上缓解了光抑制。4海藻糖预处理可以通过降低光能的吸收、提高热耗散能力来保护光合机构,提高小麦的耐热性。热胁迫处理降低了叶绿素含量和(A+Z)/(V+A+Z)的比率,而对β-胡萝卜素含量几乎没有影响。当高温胁迫解除,恢复至常温后,叶绿素含量和β-胡萝卜素含量继续降低,而(A+Z)/(V+A+Z)的比值显着提高。然而,小麦幼苗经海藻糖预处理后,β-胡萝卜素含量和(A+Z)/(V+A+Z)的比值显着增加,叶绿素含量明显降低。恢复至常温后,叶绿素和β-胡萝卜素的含量在海藻糖预处理的植株中也比未经海藻糖预处理的要低。5 24 h热胁迫破坏了叶绿体超微结构,海藻糖预处理可以保护叶绿体超微结构,尤其是在恢复至常温后,与未经海藻糖预处理植株相比,海藻糖预处理能促进结构较为完整的叶绿体的形成。6热胁迫破坏了一些类囊体蛋白,而海藻糖预处理可以保护20～97kD多肽防止其解体。特别是,海藻糖预处理在热胁迫及恢复过程中可以保护D1蛋白,防止其降解,维持较高的PSⅡ光化学活性。7在高温及恢复常温期间,海藻糖预处理对类囊体膜脂的组成和含量有一定的影响。与对照相比,24 h热处理明显增加了IUFA。然而,在热胁迫及胁迫后的恢复过程中,与未经海藻糖处理相比,海藻糖预处理却显着降低了IUFA,表明脂肪酸的不饱和程度与环境温度有关。在恢复常温过程中,海藻糖预处理增加了PC和PG含量。这些变化对于稳定光合机构、防止热胁迫诱导的光抑制、加速PSⅡ蛋白复合体的恢复有利。8热胁迫引起膜脂过氧化,破坏膜的完整性。海藻糖预处理可以缓解高温对膜的伤害,表现为电解质外渗量、MDA含量降低,O2.-和H2O2的积累减少。海藻糖对膜的保护与其诱导的脂氧合酶活性的降低、对抗氧化酶的保护及清除活性氧有关。海藻糖可以直接清除活性氧,这对于在热胁迫及恢复过程中保护光合机构具有重要作用。
孟利娟[10]2015年在《一氧化氮和海藻糖对白灵侧耳高温响应抗氧化途径的影响研究》文中认为白灵侧耳兼具营养价值和药用价值,深受消费者青睐,需求量不断升高,农业生产方式栽培广泛。生产中的发菌期正值自然高温期,在农业栽培设施条件下,常发生烧菌而导致减产。因此,探索白灵侧耳菌丝体高温胁迫响应机理,将为白灵侧耳耐热新品种选育奠定理论基础,具有重要的科学意义和生产价值。一氧化氮和海藻糖分别作为气体信号分子和应激保护性物质,在生物体响应非生物胁迫,对抗不利环境条件中起着重要作用,其在抗高温胁迫方面的作用也受到越来越多的关注。本研究以白灵侧耳(Pleurotus eryngii var.tuoliensis)为材料,探索了高温胁迫下,白灵侧耳菌丝体内抗氧化酶类活性的变化以及外源一氧化氮和海藻糖对其在高温胁迫下对抗氧化酶类活性变化的影响。研究结果如下:高温胁迫引起白灵侧耳菌丝体质膜过氧化程度加剧,胁迫48 h时TBARS含量最高,为对照(0h)的4.48倍。在高温胁迫条件下,白灵侧耳菌丝体内抗氧化酶类的活性变化显着,但是对高温胁迫响应的时间表现不同。在高温胁迫72 h内,SOD酶活性在48 h之内无显着变化,48 h之后才显着升高,达到对照(0 h)的1.55倍;CAT酶活性在24 h后显着升高,达到对照(0 h)的5.07倍;POD酶活性在12 h后即表现出显着提高,并在48h达到最大值,为对照(0 h)的2.82倍;与之不同,GR酶活性呈现先升高后降低的趋势,并在24 h处达到最大值。可见,CAT酶是白灵侧耳高温胁迫响应最为敏感的抗氧化酶类。外源添加NO能够降低高温胁迫下菌丝体内的TBARS含量,缓解氧化损伤,外源NO处理对白灵侧耳菌丝体内抗氧化酶活性的影响不同。外源NO处理能够促进菌丝体内SOD,CAT,GR酶活性的提高,抑制POD酶的活性。外源NO通过提高SOD,CAT,GR酶活性,清除高温胁迫下体内产生的活性氧,缓解氧化损伤,提高菌丝体耐热性。特别是CAT活性以m M·min-1·mg-1 of protein单位呈现,是清除活性氧,缓解氧化损伤的主导酶。外源添加海藻糖能够显着降低由于高温胁迫菌丝体内TBARS的含量,缓解氧化损伤,提高菌丝体耐热性。外源添加海藻糖对白灵侧耳菌丝体内主要抗氧化酶类的作用不同。外源海藻糖可以提高SOD,CAT,POD酶的活性,抑制GR酶的活性。外源海藻糖通过提高SOD,CAT,POD酶的活性清除高温胁迫下菌丝体内的活性氧,缓解氧化损伤,提高菌丝体的耐热性。外源NO和海藻糖缓解氧化损伤的途径不完全相同,它们共同的途径是作用于SOD和CAT。对于其他抗氧化酶的作用则不同,NO还作用于GR,提高其活性;而海藻糖作用于POD,对GR效果不显着。
参考文献：
[1]. 农杆菌介导海藻糖合酶基因遗传转化甘蔗研究[D]. 王自章. 福建农林大学. 2001
[2]. 小麦籽粒中叁个淀粉代谢调控相关基因的克隆及其表达特性分析[D]. 孙敏善. 河南农业大学. 2013
[3]. 小麦蔗糖合酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在籽粒形成中的遗传效应及全球育种选择研究[D]. 侯健. 中国农业科学院. 2016
[4]. 脱水素基因BDN1双元表达载体的构建与农杆菌介导叶盘法转化烟草[D]. 唐先兵. 首都师范大学. 2001
[5]. PEG-6000模拟干旱胁迫下小偃麦异附加系SN6306差异表达基因的筛选[D]. 黄春丽. 山东农业大学. 2015
[6]. 海藻糖合成酶基因克隆及其转化草莓的研究[D]. 吴斌. 安徽农业大学. 2003
[7]. 小麦TaPPR4基因的克隆及其功能研究[D]. 刘佳明. 哈尔滨师范大学. 2017
[8]. 垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SpTPS1）的克隆及其功能分析[D]. 林荆. 四川农业大学. 2009
[9]. 外源海藻糖提高小麦耐热性的生理机制研究[D]. 罗音. 山东农业大学. 2007
[10]. 一氧化氮和海藻糖对白灵侧耳高温响应抗氧化途径的影响研究[D]. 孟利娟. 中国农业科学院. 2015