马常升[1]2002年在《室管膜与脑功能关系的形态学研究》文中进行了进一步梳理目的 室管膜是衬覆在脑室内面的单层纤毛立方上皮，是脑-脑脊液屏障，血-脑脊液屏障的主要组成部分，在脑脊液的产生，脑内信息的转导，维护脑的微环境等方面具有重要的作用，也是脑内给药和脑疾病治疗新途径开发关注的焦点之一；室管膜在一些部位可能是由于功能的需要其细胞和组织结构发生了特化，在二十世纪五十年代人们将这些特化的室管膜称为室周器官。在哺乳动物，目前被公认的室周器官有穹隆下器，终板血官器，正中隆起，连合下器，松果体隐窝，旁室器官(位于第叁脑室侧壁的中央，前连合和乳头体后缘的连线上，室管膜细胞呈多层排列，室管膜下层神经胶质细胞较少，神经细胞的树突穿过室管膜细胞之间，直接突入脑室中)，最后区等。但有人把神经垂体，松果体，脉络丛等也列为室周器官。在鱼类还有血管囊(位于神经垂体的紧后方，漏斗茎的后端。该处的室管膜细胞由王冠细胞和支持细胞构成)和脊髓尾部垂体(位于脊髓尾部中央管腹侧，呈半球形的一个隆起，Urophyse)。以及鸟类的腰髓隆起(位于腰骶髓后正中沟中，含有大量的糖元和明胶样组织块，Lumbalwulst)。目前，人们对室管膜以及由室管膜特化形成的室周器官的功能认识的还很浮浅，在二十世纪九十年代以前，对室周器官维持内环境稳定的神经内分泌调节功能研究很多；在二十世纪九十年代以后，开始关注室周器官在神经免疫调节中的作用。而有关室管膜上细胞，室管膜上纤维以及接触脑脊液神经元在神经体液调节以及神经-内分泌-免疫调节网络中的作用，目前越来越受到人们的重视，由于室周器官处于血液-神经-脑脊液叁种信息流的交汇处，特殊的位置决定了它在神经-内分泌-免疫调节中可能起着举足轻重的作用。所以，本文对第四脑室外侧隐窝，第叁脑室的正中隆起，在幼年，成年，老年动物上用光镜，电镜进行了系统的研究。 材料与方法正常SD雄性大鼠，分幼年组，成年组，老年组，用光镜，扫描电镜，透射电镜进行实验。光镜样品的制备：动物腹腔内注射 中文摘要6％水合氯醛（0．5ml／1009体重）麻醉，经心灌注37’C生理盐水50－100ml，再灌注4％多聚甲醛m．IM，pH7．2）磷酸缓冲液100400m，30分钟灌注完毕，取出整脑，在上述固定剂＊oC）内后固定12小时。切取观察部位脑块，然后，进行梯度酒精脱水，浸蜡，包埋，修块，石蜡连续切片 （德国LEICA石蜡切片机人 切片厚度still，Zlllll，蛋自甘油载片捞片，60C烤箱过夜，二甲苯脱蜡，梯度酒精置换，浸水，H六染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。室温风干后，显微镜观片，OLYMPUS万能显微镜照相。扫描电镜样品的制备：动物腹腔内注射6％水合氯醛 （0．5ml／1009体重）麻醉，经心灌注37oC生理盐水50一100。1，再灌注4％多聚甲醛和 2．5％戊二醛（0．IM，pH7．2）磷酸缓冲液 100 一400＊1，30分钟灌注完毕，取出整脑，在上述固定剂KoC）内后固定12小时，切取观察部位脑块，将切块收入0．IM、pH7．2磷酸缓冲液中过夜后，再用上述磷酸缓冲液冲洗切块叁遍，然后梯度酒精脱水，醋酸乙戊酯置换，二氧化碳临界点干燥，真空喷金，日历S七500N观察、照像。透射电镜样品的制备：动物腹腔内注射 6％水合氯醛门．sml／100g体重）麻醉，经心灌注37℃生理盐水100M，再灌注49多聚甲醛和2．5％戊二醛①．IM，pH7．2）磷酸缓冲液350ml，30分钟灌注完毕，取出整脑，在上述固定剂NC）内后固定12小时，经正中线切开整脑，从背侧去除小脑，暴露出第四脑室底，切取外侧隐窝人日处脑块3X3XZn，磷酸缓冲液冲洗叁次，梯度酒精脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片，日历透射电镜观察，照相。 结果1．大鼠第四脑室外侧隐窝扫描电镜观察 a人 室管膜上结构：本研究系统的观察了大鼠第四脑室底外侧隐窝的室管膜，发现在外侧隐窝入曰处，与邻近的室底相比为一少纤毛区，有较多的室管膜上结构，纤毛稀疏或缺如，在纤毛稀疏区内可以观察到分布疏密程度不一的微绒毛，该区域的面积为 200十00 o＼室管膜上纤维有两种类型，一种纤维粗细不匀，长短不一，多交织成网状。另一种纤维，呈圆柱状，粗细均匀，直径0．10．spe长度30千0po，纤维之间无交织现象；室管膜上细胞可见两种类型，一种吞噬细胞样细胞，具有放射状的突起，被盖于纤毛簇的上方，此种细胞胞体圆形或椭圆形，直经8l6 w，表面光滑，该类细胞突起较多，每一细胞皆有6l 个，且从胞体呈放射 2 中文摘要 状发出，突起呈圆柱状，根部粗大，多有分枝，末梢尖细，且贴附于室 管膜表面。突起的长度多为 20ed0 o。另一种室管膜上细胞为神经元样 细胞，该类细胞的胞体呈圆形或椭圆形，直径 810 o，表面凹凸不平， 且多有圆形或椭圆形分泌颗粒，颗粒直径0．5l．spe，该类细胞的突起 较少，每个细胞多有卜 个，突起呈圆柱状，且根部与末梢粗细一致， 直径 0．3个．6 w，突起长度 5
王金立[2]2011年在《实验性蛛网膜下腔出血对侧脑室脉络丛和海马组织结构的影响》文中提出蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH),是一种常见的急性出血性脑血管病变。目前在我国,其发病率约为10.5/10万人年,约占脑血管病总发病率的9.0%-22.4%。SAH的死亡率高达40%-50%,而存活者中46%有明显的认知功能障碍,严重影响正常生活。SAH可引起多种并发症,其中出血后再出血、脑血管痉挛和脑积水最为常见,且能造成严重的脑损害。近年来人们通过大量的动物实验和临床观察,对SAH后叁大并发症的发生机制,以及它们造成脑损害的机制进行研究,并得出了较多的假说,但是,目前尚无统一的假说能解释SAH后的所有事件。脑脊液(cerebralspinal fluid,CSF)循环,素有人体第叁循环之称。目前在研究脑积水,颅高压、颅内出血、蛛网膜下腔出血等中枢神经系统器质性疾病的发生机制和防治上均有重要意义。众所周知,脉络丛存在于脑室内,是产生脑脊液的主要结构,产生的脑脊液约占其总量的80%～85%。脉络丛的结构以毛细血管网为中心,周围为结缔组织,外层覆以室管膜上皮即脉络丛上皮,后者具有活跃的分泌功能。脉络丛的结构改变,会直接影响脑脊液的产生,从而造成CSF循环障碍。海马位于侧脑室下角的底和内侧壁,与脑脊液仅有一层室管膜相隔。其与下托、齿状回和海马残件共同构成海马结构。海马结构与学习、记忆、认知功能有关,尤其是短期记忆与空间记忆,此外还具有控制感情、行为及神经内分泌的功能。而且与Alzheimer病(AD)、颞叶癫痫、某些精神疾病等密切相关。它们都与脑脊液有着紧密的关系,SAH后大量血液进入蛛网膜下腔或脑室内,势必影响正常的CSF循环,进而CSF的改变可能会对脉络丛和海马的组织结构造成影响。目的：近年来,人们比较注重于脑血管痉挛在SAH发病急性期造成脑损害的研究,但是,很少有人关注其它并发症以及SAH急性发病后期所造成的脑损害。所以,本实验通过对实验性蛛网膜下腔出血后期的大鼠,侧脑室脉络丛和海马细微和超微结构特点的形态学观察,为实验性蛛网膜下腔出血对脉络丛和海马的损害机制的研究,提供形态学实验证据。方法：1实验动物与取材选用成年SD大鼠35只,体重300-400g,雌雄不拘,由河北医科大学动物实验中心提供。实验动物随机分为预实验组(手术5只)、实验组(手术20只)和对照组(假手术10只)；预实验组和实验组大鼠用6%水合氯醛(0.5m1/100g)腹腔注射麻醉后,于枕大池注入其自体动脉血0.3ml,制作模拟蛛网膜下腔出血的实验动物模型。术后的预实验组大鼠,24小时后取材用于评估模型情况；实验组和对照组大鼠常规喂养,两个月后经主动脉灌注固定取材,用于光镜和电镜组织样品的制备。2光镜样品制备与观察将醛类固定液固定好的完整的大鼠脑,’经从低至高浓度梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,组织切片,再行常规HE染色和光镜观察；以显示侧脑室脉络丛和海马的细微结构特点。3扫描电镜样品制备与观察将固定的脉络丛和海马组织标本,进行常规扫描电镜样品制备。通过扫描电镜观察,以揭示脉络丛和海马表面结构特点,以及实验性蛛网膜下腔出血对其表面结构的影响。4透射电镜样品制备与观察醛类固定液固定的脉络丛和海马组织标本,行常规透射电镜样品制备,超薄组织切片,进行透射电镜观察；揭示脉络丛和海马组织的超微结构特点,以及实验性蛛网膜下腔出血对其超微组织结构的影响。结果：1大体观察结果显示大鼠苏醒后精神萎靡、反应迟钝、嗜睡,呈头低位蜷缩状,饮水和摄食量减少,毛发杂乱,自结性差,并与7天左右逐渐恢复。在预实验组大鼠的脑标本,均见血液或血凝块分布于蛛网膜下腔,血凝块多沉积于脑干背侧、颅底以及基底池；大脑半球表面也可见到血液沉积。2石蜡包埋组织切片HE染色光镜观察显示(1)预实验组：蛛网膜下腔变宽,其内可见大量的红细胞。(2)实验组：脉络丛的毛细血管未见异常改变,周围结缔组织间隙略有增宽,脉络丛上皮细胞内出现大量的空泡,胞体形状不规则,细胞之间界限不清晰。海马表面的室管膜结构未见改变。在海马槽和多形细胞层,可见到小血管周隙明显增宽。锥体细胞层明显变薄,细胞数量减少,而且细胞排列紊乱、间隙增宽。3扫描电镜观察显示脉络丛上皮细胞表面,出现大量的火山口样的凹陷,还可见凹陷周围有些正常上皮细胞上出现大量的分泌泡,而另一些细胞的微绒毛萎缩、扭曲甚至脱落。在衬覆海马的室管膜,其细胞表面纤毛未发现异常,而其微绒毛大量减少甚至缺如。4透射电镜观察显示脉络丛上皮细胞内可见大量的吞饮泡,胞体和胞核均不规则,核内异染色质增多,胞质内可见大量的初级和次级溶酶体,可偶见肿胀的线粒体。海马室管膜细胞表面的微绒毛减少,未见到分泌泡。大量的脂质蛋白沉积于血管周隙、神经纤维、胶质细胞和锥体细胞间隙,锥体细胞内的脂质蛋白沉积较为少见。锥体细胞层的锥体细胞之间间隙增宽,细胞密度减少。结论：1枕大池单次注血法可以成功建立SAH模型,并且模型病理改变较为一致,可以较为真实的模拟SAH的病理过程。2实验性SAH造成了侧脑室脉络丛的空泡样变,其原因考虑为CSF障碍所致,然而,脉络丛的结构改变势必会影响CSF循环。3实验性SAH引起海马CAl区的脂质蛋白沉积,以及锥体细胞的减少。前者可能与脑脊液运行不畅,致使海马CAl区细胞代谢产物转运障碍有关,后者考虑为缺血所引起的细胞凋亡加速。这些结构改变会对海马的功能造成影响。
李力燕[3]2007年在《人胚胎脊髓发育过程中NTs家族及其受体的表达及变化》文中研究说明目的探讨神经营养素家族及其受体与人胚胎脊髓发育的关系。方法应用免疫组织化学、原位杂交、蛋白质印迹和逆转录酶多聚酶链反应等方法系统研究神经营养素家族及其受体在人胚胎3w～8m脊髓内的表达及变化。结果1．NGF蛋白在3w末和4w的神经管上皮中已有表达，在5～7w，随胚胎发育在套层、基板、翼板的神经细胞前体表达，阳性反应随胚龄增加。8～9w，套层大量的阳性细胞，翼板较基板更为密集。逐渐出现分化中的各种形态的成神经细胞。3m后，阳性细胞密度下降，但灰质内可见形态逐渐趋于成熟的神经细胞，数量逐渐增加。6m后脊髓形态趋于成体化，灰质内阳性神经细胞的形态更趋典型。6w时边缘层可见阳性纤维，3m时白质内可见少量阳性胶质细胞，6m时增多。通常胶质细胞的分化晚于神经细胞，白质内阳性纤维的出现早于胶质细胞；Western blotting蛋白定量分析显示：6～8w，蛋白含量随胚龄逐渐增加，8、9w时达到高峰(P＜0.05)，3m后下降(P＜0.05)，6m后又有所增加，并保持相对平稳。蛋白含量测定的结果与免疫组化定位表达的变化相吻合；原位杂交显示NGFmRNA在4w的神经管上皮呈弱阳性，晚于蛋白表达出现的时间。之后随脊髓的发育，阳性表达增加，至8w、9w时，可见分化中各种形态的成神经细胞，3m时，细胞密度下降。至4m时，可见阳性的多极神经元。6～8m，阳性神经细胞形态更趋成熟。白质内纤维和胶质细胞的阳性反应晚于神经细胞，表达模式与NGF蛋白的相似；RT-PCR的结果显示，NGFmRNA的表达在6～8w是逐渐上调的，8w时达到峰值(P＜0.05)，从第9w后表达下调，在第4m时下调到最低值(P＜0.05)，以后又逐渐上调。NGFmRNA含量测定的结果与原位杂交定位表达的变化相吻合；2．TrkA蛋白在3w末4w的神经管上皮、内界膜表达阳性，5～7w随神经管的发育相继在套层、基板、翼板的部分细胞胞浆表达，8～9w，套层阳性细胞密集，翼板较基板更多，细胞核膜和核仁明显，逐渐出现分化中的各种形态的阳性成神经细胞。10w～3m，多突起的大神经元逐渐增多，白质内胶质细胞阳性。4～5m，背角、腹角内较多阳性神经元，白质内可见阳性胶质细胞和纤维。6m后趋于成熟；Western blotting显示：TrkA蛋白在6w已有一定的含量，但比较低，6w到3m之间含量缓慢增加，4m时明显增加(P＜0.05)，5m，含量有所下降，7m略有升高。与免疫组化定位表达的变化基本吻合：原位杂交显示TrkAmRNA在4w的神经管上皮呈弱阳性，晚于蛋白表达出现的时间。之后相继在套层、基板、翼板表达，阳性反应逐渐增加，阳性神经细胞从以幼稚的无极成神经细胞为主转为以多种形态为主，9w可见少数多极成神经细胞，3～4m逐渐增多，并渐趋成熟。表达模式与TrkA蛋白的相似：RT-PCR的结果显示：9w起可检测到TrkAmRNA的表达，3m时达到最高(P＜0.05)，从4m时开始下调，但幅度不大；3．BDNF蛋白在3w末4w的神经管内界膜、外界膜表达，阳性反应较强，随脊髓的发育，BDNF表达的部位与NGF的相似，但早期在神经上皮细胞突起的表达较为明显，晚期，在6m时除在灰质内见到各种形态的神经细胞外，还可见深染的白质纤维束；Western blotting显示：BDNF蛋白含量测定的结果与免疫组化定位表达的变化基本相吻合，变化曲线与NGF的相似；原位杂交显示BDNFmRNA在3w末4w的神经管上皮即有明显表达，表达模式与蛋白的相似，阳性反应较NGF强；BDNFmRNA含量测定的结果与原位杂交定位表达的变化相吻合；4．免疫组化显示TrkB蛋白在5w时的神经管内界膜、神经上皮和套层呈弱阳性反应，之后在发育中脊髓的表达部位与BDNF蛋白的相似，但阳性反应明显弱于BDNF；蛋白定量显示：TrkB从第6w至4m呈现逐渐上调的趋势，但未见明显上调的时间段，4m后下调，6m后略有上调，总体水平很低。与免疫组化定位表达的变化相吻合；原位杂交显示TrkBmRNA在5w的神经管有表达，表达模式与TrkB蛋白的表达相似。RT-PCR结果显示，早期TrkBmRNA随发育逐渐上调，8w时达到峰值，从9w开始表达下调，类似于BDNF的变化；5．NT-3蛋白的表达很具特征性，阳性表达以细胞突起和纤维最为突出。NT-3在第3、4w的神经管上皮即呈强阳性反应，各期细胞的阳性突起呈放射状，5～8w，神经上皮层及套层大量放射状纤维，8～11w，阳性神经细胞前体也较丰富。阳性反应出现的部位与NGF和BDNF相似；Westernblotting分析显示：NT-3从第6w开始即达一定水平，并且逐渐上升到第9周达峰值(P＜0.05)，之后下降并维持在一定水平，与定位表达的变化吻合；原位杂交显示NT-3mRNA在4w的神经管上皮呈弱阳性反应，晚于蛋白的表达，且阳性弱。表达模式与蛋白的相似，但在细胞突起内的表达不如蛋白的突出；RT-PCR的结果显示，NT-3mRNA的变化与定位的表达变化相吻合；6．免疫组化定位表达显示TrkC蛋白在3w末的神经管内界膜呈弱阳性反应，表达模式与NT-3相似，但在细胞突起内的表达不如NT-3那么突出，但较其它两种受体TrkA和TrkB的明显；Western blotting的测定结果与定位表达的变化相符；TrkCmRNA的定位表达：在4w的神经上皮部分细胞表达，5w起其表达部位与TrkC蛋白的相似，但阳性较弱；RT-PCR结果显示：TrkCmRNA含量的变化与定位表达的相符；7．NT-4蛋白在3w末的神经管上皮呈弱阳性反应，表达模式与NGF、BDNF相似，但6m时，腹角神经元非常明显，中间带、后角各板层均可见阳性神经元。白质的后索、外侧索比前索的阳性胶质细胞多：Western blotting结果显示：NT-4于第6w已存在，之后缓慢升高到第8w后快速增加，第9w达高峰(P＜0.05)，以后又缓慢下降，第5、6m在一定水平保持平稳。NT-4蛋白含量的变化基本与免疫组化显示的形态学变化一致；NT-4mRNA的定位表达于4w的神经管上皮可见，其表达模式与蛋白的相似；RT-PCR的实验结果显示，NT-4mRNA含量的变化基本与原位杂交显示的形态学变化相似；8．在检测时段内，神经管上皮不同细胞周期的室细胞或室管膜上皮细胞始终有部分表达各种因子。结论1．神经营养素家族各因子(NGF、BDNF、NT-3、NT-4)广泛分布于人胚胎脊髓发育各个时期的各种结构中，并且在早期脊髓的表达更强，各因子的表达既有重迭又有差异，提示神经营养素家族在人胚胎脊髓发育的各个阶段特别是胚期脊髓的发育中发挥着重要的作用，但在不同的区域和细胞又各自发挥着不同的作用；2．神经营养素家族各因子的mRNA广泛地存在于各个发育时期神经细胞和胶质细胞中，提示胚胎发育时期，神经管或脊髓的神经细胞和胶质细胞具有自身合成神经营养素的功能；3．神经营养素家族的高亲和受体广泛分布在人胚胎发育的各个时期的神经细胞和胶质细胞，提示人胚胎脊髓发育时期神经营养素家族各因子还可通过自分泌和旁分泌方式发挥其各种生理功能；4．神经营养素家族可能具有诱导脊髓室管膜上皮神经干细胞分裂增殖的能力。
唐巍[4]2006年在《益气活血法和补肾生髓法对体外培养和脑缺血大鼠神经干细胞增殖分化的影响》文中研究指明目的依据中医脑髓学说、气血相关理论和缺血性脑卒中“气虚血瘀”病机学说,借助益气活血法代表方脑络欣通和补肾生髓法代表方左归丸,比较观察两种不同中医治法对诱导神经干细胞增殖、分化,以及神经营养因子表达水平的影响,从神经干细胞增殖、分化和调控角度探讨不同中医治法在修复缺血性脑损伤中的作用及其机制。方法1分离E14胎鼠大脑皮质及皮质下组织,通过原代细胞培养、传代、单细胞克隆和免疫细胞荧光化学方法,用神经干细胞的特异性巢蛋白单克隆抗体(神经上皮干细胞蛋白Nestin)、增殖细胞单克隆抗体(5-溴脱氧尿苷嘧啶BrdU)、神经细胞的特异性抗体(神经元特异性烯醇化酶NSE、胶质纤维酸性蛋白GFAP、半乳糖脑苷脂Gal-C)鉴定神经干细胞的自我更新增殖能力和多向分化潜能。2分别采用脑络欣通药物血清和左归丸药物血清培养大鼠胚胎神经干细胞,观察其促增殖效应和诱导分化效应,应用相差显微镜和免疫荧光染色对其进行比较观察。3线栓法制作急性局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型,动物随机分为假手术组、模型组、脑络欣通组及左归丸组4组。在相应时间点进行脑缺血范围测定和神经缺损体征评分。在脑缺血再灌注1d、3d、7d后的3个不同时间点,应用免疫组织化学或免疫荧光化学技术,进行Nestin、BrdU单标染色及BrdU/GFAP、BrdU/NSE双标染色,分析比较各组大鼠脑组织中阳性细胞的表达情况。4线栓法制作急性局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型,动物随机分为假手术组、模型组、脑络欣通组及左归丸组4组。在脑缺血再灌注1d、3d、7d后的3个不同时间点,应用免疫组织化学技术,进行脑源性神经营养因子(BDNF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)免疫组化显色,在大鼠脑缺血后脑内有神经干细胞增生的相关区域,分析比较脑缺血后以及应用脑络欣通和左归丸后BDNF、bFGF的表达情况。结果1从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并具有增殖的能力,表达巢蛋白抗原和增殖细胞抗原;在血清诱导下,分化后的细胞表达3种神经细胞(神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)的特异性抗原。2脑络欣通药物血清和左归丸药物血清均可诱导绝大多数神经干细胞分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞;前者诱导干细胞分化的进程虽比后者要慢,但其分化的神经元在细胞形态学上与发育成熟的神经元更为接近。此外,两者还能一定程度上促进培养的神经干细胞增殖,以后者促进神经干细胞增殖的效应较为显着。3脑络欣通组和左归丸组均能缩小大鼠脑缺血范围,改善神经功能缺损体征,脑络欣通组作用强于左归丸组。脑缺血再灌注损伤后,Nestin、BrdU在不同时间点、在缺血侧的不同脑区出现程度不等的表达。与模型组比较,两治疗组Nestin、BrdU免疫阳性表达明
高殿帅, 蔡青, 鲁强, 刘丙方, 徐群渊[5]2004年在《成年大鼠脑内具有神经生发功能的脑室下区的细胞形态学研究》文中研究说明为研究成年大鼠脑内具有神经生发功能的侧脑室外侧壁脑室下区 (SVZ)细胞的组成及特征 ,本研究对该区组织切片进行了免疫特异性反应、镀银及铅铀染色 ,在光镜和电镜下进行了观察。结果发现 ,SVZ含有能被溴脱氧尿核苷 (Brd U)标记且具有成神经细胞形态学特征的分裂后细胞 ,还有胶质纤维酸性蛋白阳性细胞和少突胶质样细胞等其他类型细胞。另外发现 ,室管膜(EL)细胞、EL深部细胞、少突胶质样细胞以及不同细胞突起所组成的网络样结构与上述 SVZ成神经样细胞紧密相邻。实验结果表明 ,SVZ成神经样细胞周围可以没有特定的胶质细胞鞘包裹 ,位于侧脑室外侧壁的不同类型细胞可能在 SVZ神经生发过程中具有不同作用。
吕佩源[6]2004年在《小鼠血管性痴呆细胞分子生物学发病机制及石杉碱甲的影响》文中提出血管性痴呆（vascular dementia, VD）是由各种脑血管病引起的获得性智能损害综合征，属神经内科的常见病、多发病。随着社会人口的日益老龄化和脑血管病发病率的不断升高，VD的发病呈迅速增长趋势，给社会和家庭带来沉重的负担。目前VD的发病机制尚不清楚，也无特殊有效的治疗方法，因此探讨和阐明VD的发病机理，对于临床制定更加合理的治疗方案具有重要的价值和理论意义。目前认为，海马与学习、记忆功能密切相关，其中神经元和突触数量及其形态正常与否对学习、记忆的产生和维持具有重要意义。有关VD时海马病变与学习和记忆功能损害的关系，近年来倍受人们关注。第叁脑室正中隆起和第四脑室外侧隐窝与外侧孔之间室管膜的特异性区域是脑脊液循环的必由之路，是脑内化学信息转导的重要位点，对脑脊液成分，尤其是免疫信息分子具有重要的监控作用，并且参与多种维持内环境稳定的神经内分泌及神经免疫调节作用。有报道阿尔茨海默型老年性痴呆时，在脑室室管膜细胞内也有神经原纤维缠结和淀粉样沉积。而VD时该区域是否也发生微细变化，目前尚未见报道。神经细胞内钙离子浓度(intracellular concentration of calcium, [Ca2+]i)、钙调素(calmodulin, CaM)及其激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ, CaMPKⅡ)一直是脑组织缺血缺氧损伤机制研究的焦点。多种脑缺血动物模型的研究表明，神经细胞内钙超载(Ca2+ over-loading)、CaM及CaMPKⅡ水平升高参与了脑组织缺血损伤；并且应用Ca2+通道拮抗剂抑制钙超载，可以减轻神经细胞缺血性损伤。有些学者对缺血性脑组织损伤做了进一步研究，发现缺血后神经细胞内环磷酸腺苷(cyclic AMP, cAMP)水平升高，神经突触后膜谷氨酸受体表达增多，二者均参与了脑组织缺血性损伤。目前认为，在生理状态下神经细胞[Ca2+]i、cAMP是参与学习和<WP=6>记忆机制的细胞内第二信使；而神经细胞膜N-甲基-D-天门冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate, NMDA) 受体及细胞内[Ca2+]i、CaM及CaMPKⅡ、cAMP水平的变化对学习和记忆的影响，也逐渐成为了多数学者研究的热点。也有学者对老年性痴呆（Alzheimers dementia, AD）动物模型进行了研究，发现AD模型脑组织内钙离子超载、cAMP、腺苷环化酶（adenylyl cyclase, AC）水平和谷氨酸受体水平降低。这些研究结果为我们探讨VD动物模型脑组织内NMDA受体、钙信号转导机制及cAMP改变提供了线索。此外，二氢麦角环肽在治疗VD方面具有明显的疗效，成为治疗痴呆的一线药物；而石杉碱甲为治疗痴呆的一种新药，疗效及药理学机制尚在研究中。因此，我们以二药作为药物治疗组，观察了其对VD小鼠上述指标的影响，探讨其治疗痴呆的新药理学机制。本研究采用反复缺血―再灌注诱发小鼠VD动物模型，观察VD时海马CA1区组织病理学改变及第叁脑室正中隆起、第四脑室外侧隐窝扫描电镜特征，检测海马组织NMDA受体的表达及转录水平、[Ca2+]i、CaM及CaMPKⅡ、cAMP水平，以探讨VD的细胞分子生物学发病机制。小鼠VD模型的建立及海马组织病理学特征小鼠331只，分为正常对照组（n = 66）、假手术对照组（n =66）、VD模型组（n = 67）、二氢麦角环肽组（n = 66）、石杉碱甲组（n = 66）。采用颈总动脉结扎，经过连续叁次脑组织缺血20 min―再灌注10 min，建立VD小鼠模型。同时设立正常对照组、假手术对照组、二氢麦角环肽组、石杉碱甲组；制造VD模型的第29天、30天，各组小鼠分别进行跳台试验和水迷宫试验，对其学习和记忆成绩测试；HE和硫堇染色下观察海马组织形态学变化，超薄切片透射电镜观察海马细胞超微结构的变化。1.1 学习成绩术后第29天，分别进行跳台试验和水迷宫试验，测试跳台试验反应时间（sec）和错误次数（number / 5 min）作为学习成绩，水迷宫试验游完全程时间（sec）和错误次数（number / 3 min）作为学习成绩。跳台试验结果显示：⑴与正常对照组的反应时间（49.86±11.24）<WP=7>和假手术对照组的反应时间（50.77±10.56）比较，VD模型组小鼠学习阶段的反应时间（84.40±12.15）明显延长（P<0.01）；⑵与VD模型组的反应时间比较，二氢麦角环肽组小鼠学习阶段的反应时间（59.21±13.24）及石杉碱甲组小鼠学习阶段的的反应时间（61.14±15.23）均明显缩短（P<0.01）；⑶与正常对照组的错误次数（1.09±0.31）和假手术对照组的错误次数（1.22±0.28）比较，VD模型组小鼠学习阶段的错误次数（3.70±0.31）明显增加（P<0.01）；⑷与VD模型组的错误次数比较，二氢麦角环肽组小鼠学习阶段的错误次数（1.51±0.40）及石杉碱甲组小鼠学习阶段的的错误次数（1.34±0.33）均明显减少（P<0.01）；⑸正常对照组、假手术对照组、石杉碱甲组、二氢麦角环肽组之间的学习成绩无显着性差异（P>0.05）。水迷宫试验结果显示：⑴与正常对照组的游全程时间（80.67±35.42）和假手术对照组的游全程时间（88.16±32.56）比较，VD模型组小鼠学习阶段的游全程时间（146.60±33.39）明显延长（P<0.01）；⑵与VD模型组的游全程时间比较，二氢麦角环肽组小鼠学习阶段的游全程时间（115.23±40.21）及石杉碱甲组小鼠学习阶段的游全程时间（102.51±49
任秀君[7]2007年在《针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响》文中指出研究目的:高脂血症(hyperlipidemia,HLP)由血中脂蛋白合成与清除紊乱所致,表现为血浆脂蛋白异常、血脂增高等,属于祖国医学的“痰浊”“瘀血”范畴。它是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要危险因素,有效地防治HLP是防治心脑血管疾病的重要途径。脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一。在我国死于脑血管病者居叁大死因首位。其中缺血性脑血管疾病占60%～80%。脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高的“叁高”特点,是威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病。为了减少和延缓中风的发生,减轻中风后机体状态,从高血脂阶段早期进行针刺干预,是针刺防治中风的新视角,具有重要流行病学研究意义。高血脂与中风,神经干细胞与神经营养因子之间的关系是目前研究尚未进行探讨的部分,本研究试图通过建立高血脂合并脑缺血动物模型,并观察针刺的影响,探讨在高血脂阶段积极早期进行针刺干预,是否可通过升高神经营养因子的合成与分泌,从而促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,促进脑损伤的修复和再生。研究方法:应用大鼠喂养经典高脂饲料,化学诱导大脑中动脉血栓闭塞制造高血脂合并脑缺血模型。将动物随机分为八组:正常对照组、高血脂模型组、高血脂治疗组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组、高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组。高血脂治疗组用电针叁阴交、丰隆穴治疗10天。脑缺血治疗组用针刺人中、百会穴治疗7天。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组,先给大鼠喂养高脂饲料造成高血脂模型,治疗Ⅰ组电针叁阴交、丰隆穴10天后,两组同时电针叁阴交、丰隆穴,针刺人中、百会穴,7天后处死。正常对照组和模型组均不针刺。用生化方法检测各组治疗前后血脂四项。应用神经行为学指标观察治疗前后神经症状的改善情况。实验结束用免疫组化方法检测海马区和额叶皮层脑缺血病理改变、室管膜下区和大脑额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达情况。用酶联免疫法(ELISA)检测右侧大脑匀浆中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)浓度。实验结果:1高血脂合并脑缺血模型的建立本实验选用经典高脂饲料喂养6周造成高脂血症大鼠模型,在此基础上用大脑中动脉FeCl3刺激血栓性闭塞法造成局灶性脑缺血,最终造成高血脂合并脑缺血模型。预实验结果显示,与同时段正常对照组比较,高血脂组4周、6周CHO、LDL-C、TG升高有显着差异,P<0.01,HDL-C没有显着差异。说明高脂饲料喂养4-6周可以造成大鼠高血脂模型。由于高血脂形成时间较长,饲养6周的高血脂症大鼠模型更近似于人类高血脂症的病理变化,正式实验定为6周。正式实验,42天,高脂饮料喂养的各组大鼠的CHO和LDL-C、TG与正常对照组大鼠比较,升高有显着性差异,P<0.01。HLD-C降低有显着性差异,P<0.01。证明高血脂症大鼠造模成功,可以进行实验。52天脑缺血造模后,在MCAO清醒(术后约1h)后,在1～2h内观察模型动物有脑缺血模型出现的神经功能缺失症状,各组大鼠在造模后1～2h的神经症状行为在评定上均有阳性反应,与正常对照组比较均有显着性差异p<0.01。HE染色结果可见,实验组动物脑缺血造模后,缺血灶出现在额叶,位置比较恒定,缺血灶内细胞排列散乱,并见大量神经元变性坏死,出现脑水肿表现,海马区大量神经元变性坏死,排列紊乱,各组有不同程度的神经元脱失现象等病理改变,说明本实验的脑缺血模型制作是成功的。本实验首次建立高血脂合并脑缺血的动物模型,此模型成功率高,死亡率小,重复性好,充分模拟了人类疾病的病理及生理改变。2正常大鼠血脂、HE染色结果、神经干细胞、NSE、神经营养因子的表达正常大鼠CHO 51.92±9.46mg/dL, HDL-C 26.80±8.16 mg/dL,LDL-C 30.50±8.19 mg/dL,TG47.98±12.18 mg/dL。HE染色结果显示,大鼠右侧海马区和额叶皮层神经细胞排列清楚,细胞形态清晰。神经干细胞标志,nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,在正常大鼠右侧脑内表达较少,在前脑背外侧伸展、侧脑室外侧壁可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞(背外侧伸展nestin:阳性细胞数63±9.40;面密度0.62±0.10%;光密度0.50±0.03%。PCNA:阳性细胞数185±10.60;面密度1.93±0.11%;光密度1.22±0.07%。vimentin:阳性细胞数95±6.31;面密度0.61±0.04%;光密度0.34±0.02%。Tuj-1:阳性细胞数56±7.69;面密度0.96±0.13%;光密度0.22±0.03%。侧脑室外侧壁:nestin:阳性细胞数41±5.61;面密度0.35±0.05%;光密度0.23±0.03%。PCNA:阳性细胞数114±22.79;面密度1.25±0.25%;光密度0.94±0.19%。vimentin:阳性细胞数48±11.85;面密度1.05±0.26%;光密度0.58±0.14%。Tuj-1:阳性细胞数35±4.69;面密度0.88±0.12%;光密度0.45±0.06%。)正常对照组大脑右侧额叶皮层相应区域表达更少。(nestin:阳性细胞数14±3.47;面密度0.11±0.03%;光密度0.09±0.02%。PCNA:阳性细胞数58±6.52;面密度0.64±0.07%;光密度0.39±0.04%。vimentin:阳性细胞数56±6.46;面密度0.22±0.03%;光密度0.11±0.01%。Tuj-1:阳性细胞数13±5.14;面密度0.08±0.03%;光密度0.05±0.02%。)右侧大脑匀浆中NSE(41.70±3.47 ng/dL)及神经营养因子NGF(79.36±7.07 pg/ml)、BDNF(5.66±0.86μg/L)、bFGF(51.20±6.05 ng/L)含量呈基础表达。3针刺对实验性高血脂大鼠的治疗作用3.1针刺对实验性高血脂大鼠血脂的作用经针刺治疗后,和高血脂模型组相比,高血脂治疗组大鼠的CHO、LDL-C、TG降低有极显着差异,P<0.01。HLD-C升高有极显着差异,P<0.01。说明针刺能降低实验性高血脂大鼠CHO、LDL-C、TG,升高HLD-C,调节血脂水平。3.2针刺对实验性高血脂大鼠右侧大脑SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1在实验性高血脂造模后大鼠脑内表达较少,在室管膜下区SVZ、背外侧角可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞,额叶皮质表达更少,与正常对照组相比,其阳性细胞数、面密度、光密度没有显着差异,P>0.05。针刺对实验性高血脂大鼠nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达影响不大。3.3针刺对高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中NSE的作用高血脂造模后,右侧脑匀浆中NSE浓度与正常脑匀浆中NSE浓度没有显着差异,P>0.05,说明高血脂本身不能影响右侧脑组织中NSE的分泌与合成。高血脂大鼠治疗组和模型组之间没有显着差异,说明针刺不能影响实验性高血脂大鼠NSE的分泌。3.4针刺对实验性高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组比较,高血脂模型组大鼠大脑匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显降低,P<0.05或P<0.01;与高血脂模型组比较,针刺治疗组BDNF显着升高,P<0.05,NGF、bFGF没有显着差异,P>0.05,但有升高的趋势。实验结果提示高血脂可降低大鼠大脑中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成,针刺可升高高血脂状态某些神经营养因子的含量,如BDNF。4针刺对实验性脑缺血大鼠的治疗作用4.1针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用59天,与正常对照组比较,脑缺血模型组和脑缺血治疗组神经症状评分升高有极显着性差异,p<0.01;与脑缺血模型对照组比较,脑缺血治疗组的神经症状评分降低有极显着性差异,p<0.01。HE染色结果显示,脑缺血治疗组缺血区周围组织水肿减轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。4.2针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用脑缺血后,大鼠缺血侧前脑室管膜下区(背外侧伸展、侧脑室外侧壁)、缺血区额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1强表达,并有多层阳性细胞,背外侧角可见大量的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,并向外形成了背外侧伸展,脑缺血区可见散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。与正常对照组比较,脑缺血模型组、治疗组nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与脑缺血模型组比较,脑缺血治疗组各项升高均有极显着差异,P<0.01。脑缺血后存在神经干细胞的增殖,并有一部分神经干细胞有向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化的趋向。针刺后各项指标高于脑缺血组。说明针刺可提高实验性脑缺血大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。针刺结果显示,针刺可促进大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。4.3针刺对实验性脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常组相比,脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组大脑匀浆中NSE含量降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示:脑缺血后,脑匀浆中NSE浓度显着升高,说明出现脑损伤。针刺可降低NSE浓度,从而减轻脑损伤。4.4针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常组相比,脑缺血模型组缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显上升,有显着性差异,P<0.05;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组缺血侧脑组织匀浆中NGF、bFGF含量升高有显着差异,P<0.05或P<0.01。实验结果提示脑缺血后,缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF浓度显着升高,说明脑缺血后,自身可分泌神经营养因子,从而产生一定的脑保护作用。针刺可通过促进缺血侧大脑NGF、bFGF的分泌与合成,加强脑保护作用。5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠的治疗作用5.1针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠血脂的作用经针刺治疗后,与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组、Ⅱ组CHO、LDL-C升高有极显着性差异,P<0.01;高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅱ组TG升高,有极显着性差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组CHO、TG、LDL-C降低有显着性差异,P<0.01或P<0.05,治疗Ⅱ组没有显着差异,P>0.05;与治疗Ⅰ组比较,治疗Ⅱ组CHO、LDL-C、TG没有显着差异,P>0.05;HDL-C,各组之间比较没有显着差异,P>0.05,但与42天比较,治疗Ⅰ组HDL-C升高有显着差异,P<0.01。本实验表明,针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,高血脂合并脑缺血模型治疗治疗Ⅰ组疗效好于治疗Ⅱ组,从而说明从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平。5.2针刺对实验性高血脂合并脑缺血脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用与合并模型组比较,合并治疗组神经症状评分显着降低,p<0.05;与合并治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组没有显着差异,p>0.05,说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。针刺后缺血区HE结果显示,针刺后缺血区周围组织水肿减轻。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组水肿程度最轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明电针在高血脂成模后积极治疗可减轻脑损害。5.3针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用高血脂合并脑缺血模型组前脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、额叶缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达弱于单纯脑缺血模型组。与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,高血脂合并脑缺血Ⅱ组各项降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示高血脂可减弱脑缺血后nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达。即高血脂可减弱脑缺血后神经干细胞的增殖,迁移和分化。针刺可提高高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比Ⅱ组各项表达要强,说明在高血脂阶段介入治疗,更能提高nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。针刺结果显示,针刺可促进高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。说明在高血脂阶段介入治疗,更能促进神经干细胞的增殖,分化和迁移。5.4针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常对照组和脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量显着上升,有显着性差异,P<0.05,P<0.01。与正常对照组相比,合并各组缺血侧大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与合并模型组比较,合并治疗Ⅰ组、Ⅱ组下降有显着差异P<0.01,P<0.05;与高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组升高有显着差异P<0.05。实验结果提示,高血脂合并脑缺血可加重脑缺血后脑损伤,针刺可减低高血脂合并脑缺血大鼠的脑损伤,尤其在高血脂阶段介入针刺治疗的治疗Ⅰ组疗效远远好于治疗Ⅱ组。5.5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组、脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组NGF、BDNF、bFGF降低有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组NGF、bFGF上升有显着差异P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组NGF、BDNF降低有显着差异P<0.01。实验结果提示:高血脂可降低脑缺血后脑自身的保护作用,针刺可通过促进NGF、BDNF、bFGF的分泌和合成,从而起到脑保护的作用。针刺治疗Ⅰ组的NGF、BDNF高于Ⅱ组,说明在高血脂阶段积极进行针刺治疗可更好的提高神经营养因子分泌,从而起到脑保护的作用。实验结论:1高血脂合并脑缺血模型的建立是成功的。2高血脂本身并不能影响实验性高血脂大鼠右侧室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑匀浆中NSE的表达,但能降低右侧大脑匀浆中神经营养因子,如NGF、BDNF、bFGF的分泌。3脑缺血能增强实验性脑缺血大鼠缺血侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。4高血脂合并脑缺血,可减弱脑缺血后室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织NSE的分泌,降低缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,减弱大脑的自我保护作用。5针刺“丰隆”、“叁阴交”,可降低实验性高血脂大鼠CHO、TG、LDL-C,升高HDL-C水平。针刺不能影响实验性高血脂大鼠高血脂后大脑右侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑组织中NSE的分泌,但能促进右侧脑组织中BDNF的分泌与合成。6针刺“百会”“人中”可改善实验性脑缺血大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,降低缺血侧NSE的分泌,增强实验性脑缺血大鼠缺血侧大脑室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进大脑缺血侧脑组织NGF、bFGF的分泌与合成。7针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,改善高血脂合并脑缺血模型大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,可提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。8从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平,改善脑缺血状态,明显提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧大脑NSE的分泌,促进缺血侧大脑匀浆中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。9针刺能通过促进缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,降低NSE分泌,促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,从而促进神经元的修复和再生。综上所述本实验结果显示,神经营养因子和神经干细胞增殖、迁移、分化之间存在必然联系。在实验性脑缺血和实验性高血脂合并脑缺血大鼠脑缺血造模后,神经营养因子含量的升高,往往同神经干细胞的增殖同时出现,所以猜测本实验脑缺血后是神经营养因子的升高促进了神经干细胞的增殖、迁移和分化。实验结果表明,针刺作为一种治疗手段在一定程度上促进了神经营养因子的分泌,从而最终促进了脑缺血后神经干细胞增殖、迁移、分化,尤其在高血脂阶段针刺治疗可减轻脑缺血后损伤,促进神经元的修复与再生。
郝庆卯[8]2006年在《杂色曲霉素对小鼠室周器官及其它脑区的影响及其机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:霉菌毒素对脑组织的损伤受到了国内外许多学者的广泛关注,但是,杂色曲霉素(Sterigmatocystin, ST)对脑组织的影响国内外尚未见报道。室周器官(circumventricular organs, CVOs)是脑室周围的一些微小器官,包括穹隆下器、正中隆起、终板血管器、脉络丛、连合下器、松果体后叶及最后区等,由于其缺乏血脑屏障,因此是监控血成分的理想位点。本实验通过灌胃给药构建ST动物实验模型,研究给药后不同时间点ST对CVOs生物学效应。观察给药后小鼠穹隆下器、脉络丛和外侧隐窝形态学变化及其室管膜和室管膜下细胞超微结构变化。检测小鼠穹隆下器、脉络丛和外侧隐窝TNF-α、TGF-β2基因的表达情况。检测小鼠穹隆下器、脉络丛和外侧隐窝和其他脑区细胞凋亡,探讨ST对脑组织的影响及其机制。其意义在于首次研究ST毒素对CVOs的作用,为以后更加深入了解ST毒素对脑组织的影响奠定了一定的基础,同时为研究其他毒素对脑组织的影响开辟了一条新的途径。方法:1扫描电镜和透射电镜检查雄性BALB/c小鼠,体重18~20 g,由河北医科大学实验动物部提供。将18只BALB/c雄性小鼠随机分为6组,每组3只。处理组5组,对照组1组,处理组按ST 3000μg/kg(sigma公司)的剂量,溶于0.5 ml生理盐水中灌胃。对照组1组用等量的生理盐水灌胃。灌胃后即刻处死动物,处理组动物于灌胃后1、2、4、8、16 h处死动物。1.1扫描电镜标本制备麻醉动物后,开胸经心脏常规灌注,灌注液为1.5%多聚甲醛和2.5%戊二醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH7.2)。灌注完毕取出整脑,在固定剂中(4℃)后固定12 h。将修好的脑组织块用磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH7.2)仔细冲洗3次,再放入磷酸缓冲液中过夜,梯度酒精脱水,叔丁醇置换,二氧化碳临界点干燥,真空喷金,日立S-3500N扫描电镜观察、照像。
万凤[9]2017年在《基于干细胞巢调控的人参皂苷对缺血/再灌注神经干细胞增殖、分化的作用及其机制》文中研究说明目的研究人参皂苷通过作用于神经干细胞巢(NSCs niche)内的神经干细胞(NSCs)、星形胶质细胞(AC)和脑微血管内皮细胞(EC),对缺血/再灌注(OGD/R)后的NSCs增殖、分化的影响以及HIF-1α-VEGF信号通路的调节机制。方法1孕15-17d的SD大鼠,体外分离培养胎鼠海马NSCs,采用免疫荧光染色法对NSCs特异性标志物Nestin进行鉴定,NSCs增殖标记物BrdU进行增殖鉴定,神经元祖细胞特异性标记物Tuj-1及星形胶质细胞的祖细胞特异性标记物Vimentin对NSCs进行分化鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养星形胶质细胞,采用免疫荧光染色法对星形胶质细胞的特异性标志物GFAP进行鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养脑微血管内皮细胞,采用免疫荧光染色法对脑微血管内皮细胞的特异性标志物Factor Ⅷ进行鉴定。2 MTS法测定人参皂苷促进NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量及最佳给药时间点。3携带GFP基因的慢病毒转染NSCs,观察GPF的阳性表达率来确定NSCs的转染率,筛选出慢病毒转染NSCs的最佳转染指数MOI值及最佳转染时间。按照课题组先前的造模方法,采用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型模拟脑缺血/再灌注损伤,以缺氧缺糖4h为NSCs损伤的最高时间点。Western Blot检测慢病毒转染后NSCs核内HIF-1α蛋白表达,观察转染后HIF-1α蛋白表达情况,并计算出HIF-1α蛋白沉默率;免疫荧光及细胞核染色检测HIF-1α基因在NSCs的表达位置情况;免疫荧光染色法对转染后NSCs进行鉴定,并且检测转染后NSCs的增殖、分化情况。4实验分为6组,设立NSCs正常组、NSCs模型组、NSCs人参皂苷组(1.OOμg/ml)、慢病毒转染的NSCs(LV-NSCs)正常组、LV-NSCs模型组、LV-NSCs人参皂苷组(1.OOμg/mL),OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs和培养液,免疫荧光染色技术分析NSCs的增殖、分化情况,Western Blot分析NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测培养液VEGF含量。5采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与星形胶质细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组、NSCs/AC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组、LV-NSCs/AC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、星形胶质细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析星形胶质细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。6采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与脑微血管内皮细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组、NSCs/EC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/EC 正常组、LV-NSCs/EC 模型组、LV-NSCs/EC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、脑微血管内皮细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析脑微血管内皮细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。结果1 胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞的分离培养和鉴定体外成功分离培养胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞,经鉴定,其纯度达95%以上。2人参皂苷促进NSCs、胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量和最佳给药时间点①人参皂苷促进NSCs增殖的最佳剂量为1.00μg/mL,促进NSCs增殖的最佳给药时间点为24h。②人参皂苷促进星形胶质细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进星形胶质细胞增殖的最佳给药时间点为72h。③人参皂苷促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳给药时间点为24h。3慢病毒转染NSCs筛选最佳MOI值及最佳转染时间成功采用慢病毒转染NSCs,慢病毒转染NSCs的最佳MOI值为10,最佳转染时间为144h。与对照组相比,NSCs转染率为90.47%(P<0.01)。4 Western Blot检测OGD后慢病毒转染NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况与NSCs正常组和转染阴性对照组相比,NSCs转染组HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。经计算,HIF-1α 沉默率为 88.5%。5免疫荧光及细胞核染色检测OGD后HIF-1α在NSCs内的表达情况在缺氧条件下,NSCs正常组显示HIF-1α能够在NSCs核内表达;NSCs转染组显示GFP绿色荧光能够在细胞核内表达,并且HIF-1α不表达,表明慢病毒能够成功转染NSCs,并使HIF-1α表达沉默。6免疫荧光染色鉴定慢病毒转染NSCs后的Nestin及NSCs增殖、分化情况慢病毒转染后的NSCs均表达Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性,慢病毒转染后的NSCs仍能够增殖,并且分化为神经元的祖细胞和星形胶质细胞的祖细胞,但其增殖、分化能力明显降低。7免疫荧光染色技术检测OGD后NSCs增殖和分化情况①NSCs各组:NSCs正常组、NSCs模型组和NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与NSCs正常组相比,NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs模型组比较,NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组、LV-NSCs模型组和LV-NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs模型组比较,LV-NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数少量增加,差异无统计学意义。8 Western Blot检测OGD后各组NSCs核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs各组:NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白少量表达或几乎不表达;与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞核中的HIF-1α蛋白表达明显减少(P<0.01)。9 ELISA检测OGD后各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs各组:NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量很低;与N LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显减少(P<0.01)。10 MTS检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。11免疫荧光双标染色检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组和NSCs/AC人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/AC 正常组相比,NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/AC 各组:LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组和 LV-NSCs/AC 人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。12 Western Blot检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组星形胶质细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。②LV-NSCs/AC:LV-NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。13 ELISA检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/AC各组:LV-NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。14 MTS检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。15免疫荧光双标染色检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组和NSCs/EC人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin 阳性表达;分别复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/EC 正常组相比,NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:正常组、模型组和人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性表达;分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。16 Western Blot检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组脑微血管内皮细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与 LV-NSCs/EC 模型组相比,LV-NSCs/EC 人参皂苷组 HIF-1α 蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。17 ELISA检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组相比,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。结论人参皂苷通过调节NSCs niche内的NSCs、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞,通过调控HIF-1α-VEGF信号通路,以自分泌和旁分泌的共同方式,促进缺血/再灌注后NSCs增殖,并且诱导NSCs分化为神经元和星形胶质细胞的祖细胞。
卓缘圆[10]2010年在《电针对脾虚证幼鼠中枢神经细胞保护作用的研究》文中进行了进一步梳理近年来中医对脾虚证进行了大量有价值的探索性研究工作,脾虚证不仅对消化系统、免疫功能等方面带来损害,还对中枢神经系统造成影响,如脾虚可引起脑内神经元、神经递质、神经营养因子、信号转导、基因表达等相关的改变,还可以影响脑神经细胞的分化和增殖,改变组织的重塑能力,从而引起皮质和海马等脑组织的结构的改变,进而影响脑功能。针刺疗法在脾虚证的治疗中有很好的疗效,具有一定的临床和实验基础,因而我们设想,对于脾虚证引起的脑神经细胞损害,是否能够通过纠正脾虚证,改善脾虚的状态,从而有效地保护损伤的神经细胞,促进脑神经功能的恢复。基于此种设想及参阅大量文献,本课题以神经干细胞的增殖和分化为切入点,从文献研究与实验研究两方面,探讨电针治疗对脾虚证引起神经细胞损伤的保护作用和机制。1、目的：观察脾虚证幼鼠侧脑室下区、海马齿状回区的细胞结构和神经干细胞增殖、分化情况,同时观察这两个脑区碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其mRNA的表达,以及电针足叁里、叁阴交穴位对细胞结构、神经干细胞增殖、分化和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其mRNA表达的影响,以期从神经干细胞角度揭示电针对脾虚证幼鼠中枢神经保护作用的途径和机制,为针灸治疗脾虚证引起的中枢神经细胞损伤提供理论和实验依据。2、方法：SPF级幼年健康雄性SD大鼠192只,鼠龄为4周龄,体重55±5g。适应环境饲养3天后开始实验。按随机数字表法分为正常组、模型组、电针组,每组64只。每组再分别随机分为7天组、14天组、28天组和49天组四个亚组,每亚组16只。采用大黄灌胃法、利血平腹腔注射法联合饥饱失常法制作实验性大鼠脾虚证模型,造模时间为14天,观察脾虚证大鼠的外观表现和体重变化,电针组在造模期结束后于双侧足叁里、叁阴交穴行电针治疗,采用疏密波刺激(密波15Hz),强度6-15V,持续时间为20分钟,每日一次至动物处死。模型组在造模期结束后固定于针刺操作台上20分钟,不作任何治疗。2.1各亚组随机选择2只大鼠,共24只大鼠分别在实验设定的时间点处死,进行灌注固定取脑,用光学显微镜和电子显微镜观察正常组、模型组和电针组大鼠侧脑室下区和海马齿状回区的病理形态学改变。2.2各亚组随机选择6只大鼠,共72只大鼠,分别在实验设定的时间点前两天进行Brdu腹腔注射,处死后进行灌注固定取脑,运用双重免疫组化方法对正常组、模型组和电针组大鼠侧脑室下区和海马齿状回区Brdu细胞、Brdu/Nestin. Brdu/GFAP和Brdu/NSE细胞进行标记,采用美国Image-Pro Plus专业图像分析软件进行图像分析,400倍光镜下进行阳性细胞计数,最后用Statal0.0软件进行统计分析,比较各组差异。2.3各亚组随机选择8只大鼠,共96只大鼠分别在实验设定的时间点处死,运用免疫组化法对正常组、模型组和电针组大鼠侧脑室下区和海马齿状回区的bFGF蛋白进行标记,采用美国Image-Pro Plus专业图像分析软件进行图像分析,200倍光镜下进行阳性细胞计数,并运用RT-PCR技术测定bFGF mRNA表达,最后用Statal0.0软件进行统计分析,比较各组差异。3、结果：3.1模型大鼠较正常大鼠明显消瘦,毛色不荣,并出现成群蜷缩、扎堆、拱背、精神倦怠、嗜卧、眼眯、四肢无力或见颤抖、反应迟钝、拉尾排便次数增多。3.2与正常组比较,光镜下观察模型组脑组织内神经元轮廓模糊,胞体肿大,周围间隙增宽,核碎裂,胞浆出现空洞,空泡形成,细胞带层次减少。电针组脑组织内神经元轮廓尚清晰,细胞核形态正常,细胞带尚均匀,可见有胶质细胞浸润。电镜下观察模型组脑结构在神经元胞体和神经毡区都有改变,尤以线粒体和突触终末端的改变明显,电针组神经元损伤程度较轻,细胞结构良好。3.3无论是在侧脑室下区或海马齿状回区,双重免疫组化都有相似的结果。正常组大鼠Brdu、Brdu/Nestin、Brdu/GFAP、Brdu/NSE的表达在各时间段均无统计学意义(P>0.05)。Brdu的表达在模型组7天组和14天组较正常组低(P<0.05),到28天组恢复到正常组水平；在电针组7天组表达已达正常水平,14天组的表达最为显着,在28天组和49天组逐渐减少,但仍多于同期正常组和模型组(P<0.05)。Brdu/Nestin阳性细胞的表达在模型组7天组仅有少量,在14天组达到正常水平(P>0.05),28天组达到高峰(P<0.05)；在电针组7天组即可与正常组相当,在14天组达到高峰值,28天和49天组逐渐减少,但与同期的模型组与正常组比较仍有统计学意义(P<0.05)。Brdu/GFAP阳性细胞的表达在模型组7天组和14天组均较同期正常组少(P<0.05),28天组可达到正常组水平(P>0.05)；而在电针组7天组即可达到正常的水平(P>0.05),14天组为高峰期,28天后逐渐减少,恢复到基线水平。Brdu/NSE阳性细胞的表达在模型组7天组和14天组均较同期正常组少(P<0.05),28天组可达到正常组水平(P>0.05)；而在电针组7天组即可达到正常的水平(P>0.05),14天组开始增多,28天组达到高峰值,以后逐渐恢复至正常水平。3.4无论是在侧脑室下区或海马区,bFGF及其mRNA在各时间段同期表达都是一致的。模型组bFGF及其mRNA表达在7天组处于基线水平,14天组明显增多,与同期正常组相比差异有非常显着性意义(P<0.05)；28天组仍停留在一个高水平,至49天回落,与正常组比较无统计学意义(P>0.05)。与模型组不同,电针组bFGF及其mRNA表达在7天组即处于较高的表达,与模型组和正常组比较具有显着性差异(P<0.01),14天组稍有下降,但较同期正常组仍有明显差异(P<0.01),并且这一表达水平可以持续至49天。4、结论本研究选择大黄灌胃、利血平腹腔注射联合饥饱失常法造成幼鼠实验性脾虚状态的病理模型,应用组织形态学、免疫组织化学等方法,围绕着神经干细胞的生长、增殖和分化对脑神经细胞的影响展开探讨,观察脾虚对脑神经细胞所造成的影响,同时分析电针对脾虚造成的神经细胞损害的保护作用及其机制。结果如下：脾虚证可出现脑神经元胞体和突触的改变,同时导致神经干细胞增殖和分化能力降低。电针“足叁里”“叁阴交”穴对脾虚所造成脑组织的损害有保护作用,使脑神经元损伤程度较轻,维持正常的细胞形态,保护神经毡中突触的基本结构,同时电针能促进脾虚证大鼠神经干细胞的增殖,适当地促进侧脑室下区和海马齿状回区增殖的神经干细胞往星形胶质细胞及神经元方向分化,电针的保护作用可能与促进bFGF蛋白及其mRNA表达上调有关。综上所述,我们认为对于脾虚证引起的中枢神经细胞损害,通过电针的刺激作用可以改善机体脾虚的功能状态,消除致病因素,并且诱导神经干细胞增殖、分化,从而使脾虚证所造成的受损的神经细胞得到修复。
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